ICS 11.220
B41
中华人民共和国国家标准
GB/T 19438.3—2004
H7亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR检测方法
Method of real-time RT-PCR for the detection
of the Avian Influenza virus subtype H7
2004-2-15发布 2004-2-15实施
发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会
GB/T 19438.3—2004
I
前 言
本标准是依据GB/T1.1—2000《标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写规则》制定的。
本标准的附录A为本标准的
性附录。
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。
本标准起草单位:中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。
本标准主要起草人:高志强,张鹤晓,郭晋优,刘继红,吴丹。
本标准系首次发布的国家标准。
GB/T 19438.3—2004
1
H7亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR检测方法
1 范围
本标准
了荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的操作方法。
本标准适用于活禽及其产品中H7亚型禽流感病毒的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的
修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成
的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。
GB/T 19438.1-2004 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法
3 缩略语
下列缩略语适用于本标准:
荧光 RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链式反应。
Ct值 Cycle threshold,每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
RNA Ribonucleic acid,核糖核酸。
Taq酶 Taq DNA聚合酶。
PBS 磷酸盐缓冲盐水。
DEPC 焦碳酸乙二酯。
4 原理
采用TaqMan方法,通过比对禽流感病毒血凝素基因,设计一对仅在H7亚型禽流感病毒血凝素基因间
保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5’
端标记FAM荧光素为
荧光基团(R),3’端标记的TAMRA荧光素(Q)在近距离内能吸收5’端荧光基团
发出的荧光信号,称为淬灭荧光基团。反应在退火时,引物和探针同时与目的基因片段结合,探针上R
基团发出的荧光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时,Taq酶发挥
5’→3’的外切核酸酶功能,将探针降解。这样探针上的R基团游离出来,所发出的荧光不再为Q所吸收而
被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行,PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。
5 试剂和材料
5.1 试剂
除特别说明外,本标准所用试剂均为分析纯,所用液体试剂均须使用无RNA酶的容器进行分装。
H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒1):试剂盒的组成、说明及使用注意事项见本标准附录A。
氯仿。
异丙醇。
75%乙醇,用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水(符合GB 6682-92要求)配制。
0.01 M (pH7.2)的 PBS:配方见 GB/T 19438.4-2004附录 A。121 ℃±2 ℃,15 min高压灭菌后,
1) 由指定单位提供,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相
同的效果,则可使用这些等效产品。
GB/T 19438.3—2004
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无菌条件下按 10 000 U/mL加入青霉素和链霉素。
5.2 仪器设备
高速台式冷冻离心机:要求最大离心力在12 000 g以上。
荧光PCR仪。
计算机。
2 ℃~8 ℃冰箱。
-20 ℃冰箱。
微量加样器(0.5 µL~10 µL;5 µL~20 µL;20 µL~200 µL;200 µL~1 000 µL)。
混匀器。
可移动紫外灯:要求近工作台面。
6 样品的采集与前处理
采样过程中样本间不得交叉污染,采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。
6.1 取样工具
需要下列取样工具:
—— 棉拭子;
—— 剪刀、镊子;
—— Eppendorf管;
—— 研钵。
以上取样工具必须经 121 ℃±2 ℃,15 min高压灭菌并烘干。
6.2 采样方法
6.2.1 活禽样品
取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法为:
—— 对于咽喉拭子,采取时要深入喉头及上颚裂来回刮 3次~5次取咽喉分泌液;
—— 取泄殖腔拭子时,将拭子深入泻殖腔转一圈沾取粪便;
—— 将咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放入盛有 l.0 mL PBS的 Eppendorf管中备用。
6.2.2 肌肉或脏器样品
用无菌的剪刀、镊子取待检样品2.0 g于研钵中充分研磨,加10 mL PBS混匀,1 000 g离心10 min
后,取上清液转入Eppendorf管中备用。
6.2.3 血清或血浆
用无菌注射器直接吸取至Eppendorf管内备用。
6.2.4 保存与运送
采集或处理的样本在2 ℃~8 ℃条件下保存应不超过24 h,长期保存须在-70 ℃以下,但应避免反
复冻融(冻融不超过3次)。
样品采集后,将采集的样品密封并编号,采用保温壶或泡沫箱加冰密封尽快运送到实验室。
7 操作方法
7.1 实验室的设置与管理
实验室的设置与管理见GB/T 19438.1-2004附录C。
7.2 样本的制备
7.2.1 在样本制备区进行。
7.2.2 样本的制备程序
7.2.2.1 取 n个 1.5 mL灭菌 Eppendorf管,其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和,
对每个管编号标记;
GB/T 19438.3—2004
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7.2.2.2 每管加入 600 µL裂解液,然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各 200 µL ,一份样
本换用一个吸头;再加入 200 µL氯仿,混匀器上剧烈震荡混匀 5 s。于 4 ℃条件下,12 000 g离心
15 min;
7.2.2.3 取与本标准 7.2.2.1中相同数量的 1.5 mL灭菌 Eppendorf管,加入 500 µL异丙醇(-20 ℃
预冷),对每个管编号标记;
7.2.2.4 吸取本标准 7.2.2.2离心后各管中的上清液转移至已加入异丙醇的相应管中,上清液至少吸
取 500 µL,不要吸出中间层,颠倒混匀;
7.2.2.5 于 4 ℃条件下,12 000 g离心 15 min ,注意固定离心管方向,即将离心管开口朝离心机转
轴方向放置。轻轻倾去上清液,倒置于吸水纸上,沾干液体,不同样品须在吸水纸不同地方沾干;
7.2.2.6 加入 600 µL 75%乙醇,颠倒洗涤。于 4 ℃条件下,12 000 g离心 15 min。轻轻倾去上清
液,倒置于吸水纸上,沾干液体;
7.2.2.7 4 000 g离心 lO s将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量加样器将其吸干,一份样本换用
一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面,室温干燥 3 min。不宜过于干燥,以免 RNA不溶;
7.2.2.8 加入 11 µL DEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的 RNA,2 000g离心 5 s,冰上保存备用。提取
的 RNA须在 2 h内进行 RT-PCR扩增,长时间保存,须置于-70 ℃条件下。
7.3 靶核酸的反转录和扩增
7.3.1 扩增试剂准备与配制
7.3.1.1 在反应混合物配制区进行。
7.3.1.2 从试剂盒中取出相应的 RT-PCR反应液、Taq酶,待反应液室温下融化后,2 000 g离心 5 s。
设所需 PCR反应数为 n,其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和。每个测试反应体系
需使用 15 µL RT-PCR反应液及 0.25 µL Taq酶。计算各试剂的使用量,加入一试管中,向其中加入 0.25
×n颗 RT-PCR酶颗粒,充分混合均匀,向每个 PCR管中各分装 15 µL,转移至样本处理区。
7.3.2 加样
7.3.2.1 在样本处理区进行。
7.3.2.2 在各设定的 PCR管中分别加入本标准 7.2.2.8制备的 RNA溶液各 lO µL,盖紧管盖后,500 g
离心 30 s。
7.3.3 荧光 RT—PCR反应
7.3.3.1 在检测区进行。
7.3.3.2 将本标准 7.3.2.2中加样后的 PCR管放入荧光 PCR检测仪内并
样本摆放顺序。
7.3.4 反应参数设置
荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的反应参数为:
—— 第一阶段,反转录 42 ℃/30 min;
—— 第二阶段,预变性 92 ℃/3 min;
—— 第三阶段,92 ℃/10 s,45 ℃/30 s,72 ℃/1 min,5个循环;
—— 第四阶段,92 ℃/10 s,60 ℃/30 s,40 个循环,荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火
延伸时进行。
8 结果判定
8.1 结果分析条件设定
8.1.1 读取检测结果,阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。
8.1.2 不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。
8.2 质控标准
阴性对照的检测结果应没有特异性扩增,阳性对照的Ct值应<28.0。
8.3 结果描述及判定
GB/T 19438.3—2004
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8.3.1 阳性
Ct值≤30,而且出现明显的扩增线,表明样品中存在H7亚型禽流感病毒。
8.3.2 阴性
无Ct值并且无扩增曲线,表明样品中无H7亚型禽流感病毒。
8.4 有效原则
Ct值>30.0的样本须重做,重做结果无Ct值者为阴性,否则为阳性。
GB/T ××××—××××
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附录 A
(资料性附录)
H7亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR试剂盒组成、说明、功能及使用时的注意事项
A.1 试剂盒组成
每个试剂盒(规格为48反应/盒)包括以下成分:
裂解液 30 mL×1盒
DEPC水 1 mL×1管
H7亚型禽流感病毒RT-PCR反应液 750 µL×1管
RT-PCR酶 1颗/管×12管
Taq酶 12 µL×1管
阴性对照 1 mL×1管
阳性对照(非感染性体外转录RNA) 1 mL×1管
A.2 说明
A.2.1 裂解液的主要成分为异硫氰酸胍和酚,为RNA提取试剂,外观为红色液体,于4 ℃保存,其他试
剂保存于-20 ℃。
A.2.2 DEPC水,是用1%DEPC处理后的去离子水,用于溶解RNA。
A.2.3 RT-PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。
A.3 使用时的注意事项
使用时应注意:
—— 由于阳性样品中模板浓度相对较高,检测过程中不得交叉污染。
—— 反应液分装时应避免产生气泡,上机前检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器。
—— RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活,必须在室温条件下置于干燥器内保存, 使用时取出所需数量,
剩余部分立即放回干燥器中。