小鼠脊髓原代星形胶质细胞培养方法的建立

© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net ·论 　著 · 小鼠脊髓原代星形胶质细胞培养的建立 黄艳丽 　许 　蕾 　段伟松 　蒋怡芳 　姜 　虹 　郭艳苏 　范志亮 　张瑞燕 　任文博 　李春岩 　　【摘要 】　目的 　获得纯度较高的脊髓源性星形胶质细胞。方法 　采用小鼠脊髓神经胶质细胞的原代培 养和传代培养。无菌条件下取生后 1～3d ICR ( Institute of Cancer Research)小鼠的脊髓 ,剪碎后胰酶分次消化 , 结合机械吹打使细胞分散 ,制成单细胞悬液 ,接种于无底物黏附的玻璃培养瓶中 ,置 37℃, 5% CO2 培养箱中 培养。培养液为 DMEM /F12混合培养液。培养 9～12d待细胞达到 80% ～90%融合后进行摇床纯化 ,舍弃含 脱落细胞的细胞悬液 ,以去除少突胶质和小胶质细胞 ,继续培养 ,待细胞铺满瓶底后传代 ,并对传代细胞进行 形态观察和星形胶质细胞的免疫荧光鉴定 , GFAP免疫细胞化学染色阳性细胞可高达 98%。结果 　通过恒温 振荡和传代后得到了形态典型 ,含量较高的脊髓源性星形胶质细胞。结论 　用无底物贴附 ,恒温振荡和传代 方法可获得高纯度脊髓源性星形胶质细胞。 【关键词 】　星形胶质细胞 ;细胞培养 ;纯化 ;神经胶质原纤维酸性蛋白 ;小鼠 中图分类号 : R329. 2 + 8 　　　文献标识码 : A 　　　文章编号 : 1006 - 351X (2009) 03 - 0183 - 03 Culture of pr imary a strocytes from Spina l Cord of m ice 　HUANG Yan2li, XU Lei, DUAN W ei2song, J IANG Yi2fang, J IANG Hong, GUO Yan2su, FAN Zhi2liang, ZHANG Rui2yan, REN W en2bo, L I Chun2yan. Department of Neurology, the Second Hosp ital, Hebeimedical university; Key laboratory of neurology, Hebei p rovince, Shijiazhuang 050000 , China Correspond ing author: 　 L I Chun2yan , Email: hblicy5@ yahoo. com. cn 【Abstract】　O bjective　 To purify astrocytes from sp inal cord for further experiments. M ethods 　 Primary culture and passage of astrocytes in vitro. Under sterile environment the sp inal cord was obtained from ICR m ice born in 1～3 days, dissected and p repared cell suspension by digestion with the use of tryp sin and mechanical digestion, then transferred to culture flasks without any stratum, and cultured (37℃, 5% CO2 ). The culture medium was DMEM / F12 and then reduced oligodentrocytes and m icroglial cells with orbital shaker when it was confluent by 80% ～90% on days 9 through 12. The p rimary culture was passaged when it was confluent. Finally the secondary culture was observed and the astrocytes were identified by immunohistochem ical staining with anti2mouse GFAP. The GFAP2positive cells were counted no less than 98%. Results　By orbital shaker in constant temperature and pasaage the purified astrocytes with typ ical shapes were got. Conclusion 　 W ith orbital shaker in constant temperature, passage and cultivation without any stratum, we successfully obtained the high purity astrocytes from neonatal m ice sp inal cord. 【Key words】　A strocytes ; Cell culture ; purify ; Glial fibrillary acidic p rotein ; m ice 基金项目 :国家自然基金资助项目 (30670732) ;河北省重点基础研究项 目 (08966105D) 作者单位 : 050000石家庄 ,河北医科大学第二医院神经内科 ;河北省神 经病学重点实验室 通信作者 :李春岩 , Email: hblicy5@ yahoo. com. cn 　　胶质细胞在中枢神经系统中的数量约占 90% ,而 星形胶质细胞 ( astrocyte, AS)是其中数量最多、分布 最广的一种胶质细胞。它与神经元密切接触、相互作 用 ,对神经元提供结构支持和营养支持的作用 ,并且通 过调节细胞外离子和神经递质水平而调节神经兴奋性 和神经传递 [ 1 ]。随着对 AS功能的了解 ,它已逐渐成 为神经生物学领域研究的热点。但在体的星形胶质细 胞与其它神经细胞混杂存在 ,相互对话 ,因此需要对星 形胶质细胞进行纯化 ,以便深入了解其形态结构和生 物学功能。有关星形胶质细胞培养的文献很多 ,但多数 是培养大鼠皮层的星形胶质细胞 ,或应用细胞株培养 , 有关小鼠脊髓星形胶质细胞培养的资料较少。我们参 考了国内外有关文献 [ 2～6 ]并进行改良 ,对星形胶质细胞 进行纯化培养 ,为进一步深入研究奠定实验基础。 材料和方法 1. 材料 　近交系 ICR小鼠 ,河北医科大学实验动 381脑与神经疾病杂志 2009年第 17卷第 3期 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 物中心提供 ; DMEM干粉购自 Gibco公司 ;胎牛血清购 自杭州四季青生物材料研究所 ;胰蛋白酶 ( Tryp2 sin)、青霉素 2链霉素均为 Sigma公司产品 ; D2Hank’s液 为实验室自配 ; Mouse Anti2GFAP单克隆抗体及 CY5 Anti2Mouse荧光二抗购自 Chem icon公司 ; Hoechst为 Sigma公司产品。 2. 原代培养 　①取 1～3d的新生 ICR小鼠 ,将其 断头处死 ,在无菌条件下由腹侧取出脊髓 , 置盛有 D2 Hank’s液的小皿中 ,在解剖显微镜下剔除脊膜 ,随后换 到另一干净的小皿中。②在小皿内剪碎脊髓 ,大小为 1 ×1 ×1,再将其移入尖底离心管中 ,加 2～3倍体积的 0. 25%胰蛋白酶 ,在 37℃下消化 15m in,加入等体积的 含血清培养基 (不含抗生素 )终止消化 ;轻吹 20次左 右 ,静置片刻 ,将上清吸入另一离心管中 ,原离心管中 加入 1m lD2Hank’s轻吹洗脊髓后将上清移入另一离心 管中 ,在原离心管中加入 1～2m l的 0. 25 %胰蛋白酶 再次消化 15m in,终止后连同上次消化的上清液一起 1500 rpm离心 5m in,弃上清液 ,再加入含 10%血清的 DMEM培养基 ,机械吹打使细胞分散 ,制成单细胞悬 液。③血细胞计数板计数后调整密度到 1 ×105 接种 于无底物黏附的 25cm2 玻璃培养瓶 ,在 37℃, 5%CO2 培 养箱中培养。④每天倒置显微镜下对细胞进行观察 ,接 种 24～48h后细胞第一次换液 ,以后每周换液两次。 3. 星形胶质细胞的纯化　细胞培养 7～10d待细胞 分层生长后 ,置于 37℃摇床中 200r/m in振荡 6h,弃含脱 落细胞的细胞悬液 , D2Hank’s液洗 3次 ,加入含 10%血 清的 DMEM培养基 ,放入 37℃, 5% CO2 培养箱中继续 培养。为提高星形胶质细胞的纯度 ,可在传代后约 5～ 7d细胞融合时 ,再次放入摇床中振荡 ,重复上述操作。 4. 传代培养 　①取已培养 15d左右的原代培养 物 ,吸去旧培养基 ,用 D2Hank’s液洗 2次 , 然后滴加 400μl 0. 125%胰酶 2EDTA,倒置显微镜下观察 ,待细胞 回缩 ,细胞间隙增加时用不含抗生素的培养基终止消 化 ,并轻轻左右摇动培养瓶 ,随后用弯吸管轻轻吹打制成 细胞悬液 ,分别接种于另两个 25cm2 的培养瓶 ,在 37℃, 5%CO2 条件下培养。②每天进行倒置显微镜下观察 ,根 据细胞的生长情况及液体颜色改变加补液体或换液。 5.星形胶质细胞的鉴定 　取第三代培养物接种于 六孔板内 , 24h后待细胞恢复后取出 ,吸去培养液 ,用 PB快速洗两次 ,每孔分别加入少许 4%多聚甲醛 ,室 温下固定 30 m in,去除固定液 ,用 0. 01mol/L PBS洗三 遍 ,以含 10%马血清的 0. 01mol/L PBS液在 37 ℃条件 下封闭 20m in。加鼠抗 GFAP的一抗 ( 1∶500) ,放入 4℃冰箱过夜 ,次日用 0. 01 mol/L PBS清洗三遍后同 时加入 CY5标记的抗小鼠二抗 (1: 100)和 Hoechst (1: 400) ,避光放入 37℃水浴孵箱 1h,再用 0. 01mol/L PBS洗三遍后晾干 ,用抗荧光衰减的封片剂封片 , O2 lympus FV1000激光共聚焦显微镜下观察。 结　　果 倒置相差显微镜下活体观察见星形胶质细胞的分 离纯化过程中细胞生长情况良好。分离的小鼠脊髓细 胞在培养 (种植 ) 4h后 ,部分细胞即可长出细小的胞 突 ; 36 h后 ,所有细胞均已贴壁 ,光晕明显 ,并长出突 起 ,培养 4～5d后 ,细胞数量增多 ,约 10d左右细胞达 到 80～90%会合 ,可进行摇床纯化。随着培养时间的 延长 ,培养物中的星形胶质细胞的比例越来越大 ,而神 经元、少突胶质细胞的比例越来越少。 传代后细胞生长更活跃 ,培养 5～7d便可长满瓶 壁 ,星形胶质细胞的比例增多 ,形态结构更加突出。相 差显微镜下形态学特征 :胞体较大而扁 ,形状不规则 , 胞质较丰富 ,细胞核圆形或卵圆形 ,常偏于胞体的一侧 , 内有 1～2个核仁 ,星形胶质细胞的胞突尤其是初级胞 突较多较长 ,呈放射状 (图 1, 2) ,经 GFAP特异性抗体的 免疫荧光染色证实 98%为星形胶质细胞 (图 3)。 图 1, 2　倒置显微镜下传代培养 8d的胶质细胞 ( ×100, ×200) 图 3 　传代培养星形胶质细胞 ×10 (激光共聚焦显微镜图象 bar =40μm) a GFAP免疫荧光染色　b Hoechst染色　c GFAP和 Hoechst共定位图象 481 脑与神经疾病杂志 2009年第 17卷第 3期 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 讨 　　论 星形胶质细胞 ( astrocyte, AS)是中枢神经系统 ( central nervous system , CNS)内数量最多 ,分布最广的 胶质细胞。AS传统分类两种 : ①纤维性 AS:多分布在 白质 ,细胞突起细长 ,分支较少 ,胞质内含大量胶质丝。 组成胶质丝蛋白质称神经胶质原纤维酸性蛋白 ( glial fibrillary acidic p rotein, GFAP)。②原浆性 AS:多分布 在灰质 ,细胞突起较短粗 ,分支较多 ,胞质内胶质丝较 少。它们与神经元之间存在复杂的相互作用 ,以维持 神经系统内环境的稳定。 星形胶质细胞是 CNS的主要成份之一 ,具有对各 种损害产生强烈反应的特性。GFAP是星形胶质细胞 的特征性标记物 ,是星形胶质细胞的骨架蛋白 ,分子量 为 50KD ,属细胞质内中间丝的一种成分 ,在细胞骨架 重建、髓鞘维持、细胞黏附和信号转导途径等细胞活动 中具有十分重要的作用 [ 7 ]。胚胎神经发育早期星形 胶质细胞前体的中间丝一般以波形蛋白为主 ,在星形 胶质细胞成熟时波形蛋白的达水平降低 ,而 GFAP 表达增加并贯穿一生 ,因此 , GFAP被公认为星形胶质 细胞的特征性标记物 [ 8 ]。生理情况下脑内少有表达 , 在病理状态下出现反应性上调 ,其上调机制尚未完全 阐明。AS在 CNS中始终伴随着神经元的整个发育过 程。AS在正常 CNS生理发育及病理过程中具有重要 作用。GFAP缺如条件下小鼠对脑缺血损伤具有更高 的敏感性 , GFAP在缺血性脑损伤发生发展过程中具 有重要作用 [ 9 ]。 肌萎缩侧索硬化 ( Amyotrophic lateral sclerosis ALS)临床表现以运动皮质、脑干和脊髓运动神经元选 择性变性、丢失为主要病理特点 ,引起进行性肢体瘫痪 和肌肉萎缩。同时在 ALS病人脊髓病理中发现明显 的胶质细胞增生 ,尤其是围绕受损的上下运动神经元 和变性的皮质脊髓束周围有强的胶质细胞反应。本实 验室在研究 SOD12G93A转基因小鼠 ALS动物模型的 基础上选用了近交系 ICR小鼠作为实验动物 ,以小鼠 脊髓作为星形胶质细胞的培养来源。由于新生鼠脊髓 组织少 ,特别是小鼠 ,所以最初的取材是较为关键的一 步 ,取材时动作要轻柔 ,尽量将脊髓保持完整 ,同时注 意脊膜剥离干净 ,以便取得更多的脊髓组织同时去除 脊膜也是减少成纤维细胞干扰的重要一步。取得原代 细胞的多少关系到培养的成败和周期的长短 ,因此吹 打和胰酶消化的时间要尽可能的轻而短 ,我们采用了 0. 25%浓度的胰酶分次消化 ,同时减少了机械吹打的 次数 ,且动作轻柔 ,以此来减少细胞的损伤。同时由于 星形胶质细胞的增殖高峰发生在胚胎晚期和出生后 , 故本实验取材自新生 1～3d的小鼠脊髓。 原代培养物中星形胶质细胞与少突胶质细胞和其 他神经细胞分为两层 [ 10 ] ,星形胶质细胞作为底层 ,其 他细胞则生长在星形胶质细胞层之上即表面层 ,故经 过一定力度的摇动处理 ,可选择性地使在星形胶质细 胞层上生长的细胞脱落 ,得到较纯的星形胶质细胞。 少突胶质细胞的增殖速度远小于星形胶质细胞 ,故随 培养时间的延长 ,及恒温摇床震荡后 ,少突胶质细胞在 培养物中所占比例越来越少 ,传代后则更少。星形胶 质细胞在无底物的情况下仍能存活 ,并生长分化良好 , 但神经元在体外不易存活 ,需要胶原、多聚赖氨酸等黏 附底物 ,所以该方法可以减少神经元的介入 ,以便获得 更纯的胶质细胞。我们经过反复实验培养传代得到了 较纯的星形胶质细胞 ,该方法的建立和培养物的获得 , 为今后研究星形胶质细胞的结构和功能提供了可靠方 法和实验材料。 参 　考 　文 　献 [ 1 ]　赵翠萍. 星形胶质细胞在肌萎缩侧索硬化症发病机制中的作用. 国际神经病学神经外科学杂志 , 2006, 33: 2952298. 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