蛋白锌硒片对小鼠免疫功能的影响

© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net [作者简介 ]　范轶欧 ( 1978 - ) ,女 ,在读博士 ,医师 ,主要从事毒 理学研究。 【论著 】 蛋白锌硒片对小鼠免疫功能的影响 范轶欧 , 周雯 , 陈敏 (山东省疾病预防控制中心 , 济南 　250014) [摘要 ]　目的 :了解不同剂量的蛋白锌硒片对小鼠特异性和非特异性免疫功能的影响。方法 :昆明种小鼠经口连续分别 给予 013、016、118 g/kg·BW 的蛋白锌硒片 ,同时设蒸馏水对照组 ,连续灌胃 30 d,进行淋巴细胞转化实验、迟发型变态 反应实验、抗体生成细胞检测、血清溶血素的测定、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、碳廓清实验和 NK细胞活性测 定。结果 :与空白对照组比较 ,中、高剂量组迟发型变态反应能力增强 , 低、高剂量组抗体生成细胞数增加 , 中剂量组小 鼠的单核 -巨噬细胞碳廓清吞噬指数增加 ,中、高剂量组小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数增加 ,差异有统计 学意义。结论 :蛋白锌硒片对小鼠免疫功能有增强作用。 [关键词 ]　蛋白锌硒片 ; 小鼠 ; 特异性免疫 ; 非特异性免疫 [中图分类号 ]　R114　　　　[文献标识码 ]　A　　　　[文章编号 ]　1004 - 8685 (2009) 10 - 2230 - 03 Effect of prote in z inc and selen ium tablet on imm une function of m ouse FAN Yi2ou, ZHOU W en, CHEN M in ( Shandong Center for D isease Control and Prevention, J inan 250014, China) [ Abstract] 　O bjective: To exp lore the effects of p rotein zinc and selenium tablet of different dosage on specific and non - spe2 cific immune function of m ice1M ethods:M ice were orally adm inistrated with the tablet at doses of 013, 016 and 118 g/kg, anoth2 er group of m ice were chosen as control1After 30 days′treatment, p roliferation and transformation of sp leen lymphocytes, delayed anaphylactic reactions, the number of antibody form ing cells, serum level of hemolysin, macrophage′s power of swallowing chick2 en red blood cells in mouse′s abdom inal cavity, carbon expurgatory function by phagocyte and NK cell activity were observed re2 spectively1Results:Comparing with control group, delayed anaphylactic reactions and macrophage′s power of swallowing chicken red blood cells in mouse′s abdom inal cavity in m iddle or high dose group intensified, the number of antibody form ing cells in low or high dose group increased, and carbon phagocytosis by phagocyte in m iddle dose group increased1Conclusion: Protein zinc and selenium tablet possesses the potential effect of enhancing the immune function of m ice1 [ Key words] 　Protein zinc and selenium tablet; Mouse; Specific immune response; Non - specific immune response 　　锌、硒为人体必需的微量元素 ,对人体的生长发育与维持 人的生命活动发挥着重要的作用。锌参与 40多种金属酶的 合成 ,与 200多种酶的生物活性有关 [ 1 ]。锌在免疫系统的形 成、稳定调节及维持机体正常免疫功能方面有重要作用 [ 2 ]。 硒是机体内的主要抗氧化酶 GHS - Px的必需组分 ,通过氧化 酶阻止自由基产生的脂质过氧化反应 ,使免疫细胞免受损害 , 从而提高免疫功能 [ 3, 4 ]。研究明 ,人体内硒的功能活性和作 用机理与摄入硒的化学形态密切相关。蛋白锌硒片是一种新 型的生物态型补充剂 ,相对于无机态型和有机态型更利于人 体的吸收。本实验观察了蛋白锌硒片对小鼠免疫功能的影 响 ,旨在对其保健功效进行初步评价。 1　材料与方法 111　实验动物 SPF级昆明种雌性小鼠 , 6～8周龄 ,体重 18～23 g,共 192 只。由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供 , 合格证号 : SCXK - (军 ) 2002 - 001。 112　样品与主要试剂 样品 : 蛋白锌硒片为淡黄色片剂 ,由某公司提供 ,人体口 服推荐剂量为 316 g/人 ·日 ,试验时直接称取样品粉碎加蒸 馏水搅拌制成混悬液并稀释到各试验组。试剂 : RPM I - 1640 培养基 ( GIBCO公司 ) ,胰酶 (济南爱博经贸有限公司 ) , Hank′s 平衡盐、刀豆蛋白 A ( conA )、氧化型辅酶 I(NAD )、吩嗪二甲 基酯硫酸盐 ( PMS)以及碘硝基氯化四氯唑 ( INT)皆为 Sigma 产品 , 噻唑蓝 (MTT)为上海生工生物工程有限公司、小牛血清 为杭州四季青生物材料有限公司产品 ,其他试剂均为分析纯。 Yac - 1细胞购于山东省医学科学院。 113　剂量的选择和饲养条件 每项免疫试验分 4个组 ,每组 12只小鼠。蛋白锌硒片设 013、016、118 g/kg·BW 3个剂量组 ,分别相当于人体推荐用 量的 5倍、10倍、30倍 ,按 012 m l/10 g·BW的容量给予蛋白 锌硒片溶液 ,另设阴性对照组灌胃给予同体积的蒸馏水。每 天一次 ,连续 30 d。 114　实验方法 [ 5 ] 11411　小鼠淋巴细胞增殖功能检测 　小鼠灌胃 30 d后脱颈 处死 ,无菌条件下取小鼠脾脏 ,用含 10%小牛血清的 RPM I - 1640培养液调脾细胞密度 ,制成 5 ×106 /m l小鼠脾细胞悬液。 0322 中国卫生检验杂志 2009年 10月 第 19卷 第 10期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology, Oct 2009; Vol 19　No 10 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 将该浓度的脾细胞悬液加入 96孔培养板 ,每个样设 3个复孔 , 于 37℃下 5%的 CO2 培养箱中培养 72 h。培养结束前 4 h,每 孔加入 MTT ( 5 mg/m l) 50μl。取出反应物 ,离心 ,弃上清液 , 每孔加入酸性异丙醇 1 m l,混匀 ,用酶标仪测定 570 nm 波长 处的光密度。 11412　小鼠迟发型变态反应 (DTH ) (足跖增厚法 ) 　小鼠连 续灌胃 26 d时 ,每只小鼠腹腔注射 2% (V /V ) SRBC ( 012 g/ 只 ) ,进行免疫 4 d后 ,测量左后足跖部厚度 ,然后在测量部位 皮下注射 20% (V /V) SRBC ( 20μl/只 ) ,每只小鼠 20μl,注射 24 h后测量左后足跖部厚度 ,同一部位测量三次 ,取平均值。 攻击前后足跖厚度的差值即表示 DTH的程度。 11413　小鼠脾细胞抗体形成能力的测定 　灌胃至第 30天 ,每 只小鼠腹腔注射质量分数 5%绵羊红细胞 ( SRBC ) 悬液 012 m l。第 34天 ,处死小鼠 ,按照淋巴细胞转化实验方法制备 脾细胞悬液 ,以 RPM I1640培养液调整其细胞浓度为 5 ×106 / m l,倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上 ,作平行片 ,待琼脂凝固 后 ,将玻片水平扣放在片架上 ,放入 CO2 培养箱中孵育 115 h, 然后加入补体 (1: 8的新鲜豚鼠血清 ) ,继续温育 115 h,计数 溶血空斑数。 11414　小鼠血清溶血值测定 　小鼠灌胃 30 d后 ,腹腔注射 2%的 SRBC 012 m l致敏 ,于第 34天摘眼球取血 , 2000 r/m in 离心 10 m in,取血清 ,用生理盐水稀释 100倍 ,取稀释的血清 1 m l,加 5% SRBC悬液 015 m l和 10%的补体 015 m l (1: 10的 新鲜豚鼠血清 ) ,于 37℃温箱孵育 3 h,观察血球凝集程度。结 果以抗体积数表示。 11415　小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定 　末次灌胃后 ,各组 小鼠腹腔注射 20%鸡红细胞 (CRBC) 1 m l,间隔 30 m in,颈椎 脱臼处死动物 ,用生理盐水冲洗腹腔 ,并取腹腔冲洗液涂片 , Gim sa - 磷酸缓冲液染色后 ,镜检计数 ,计算吞噬百分率及吞 噬指数。 吞噬率 ( % ) = (吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数 /100个巨噬 细胞 ) ×100 吞噬指数 =被吞噬的鸡红细胞数 /100个巨噬细胞 11416　小鼠单核巨噬细胞吞噬能力测定及其对免疫脏器的影 响 　于末次灌胃 1 h 后称取小鼠体重 ,以每鼠 10 g 体重 011 m l尾静脉注射 315倍稀释的印度墨汁 ,于注射后 2、10 m in 后眼眶采血 20μl,溶于 2 m l质量分数 011% Na2 CO3 溶液中 , 摇匀后 ,以 Na2 CO3 溶液做空白对照 ,于紫外分光光度计 600 nm 波长处测定吸光度 ,以廓清指数比较单核巨噬细胞吞 噬能力 : 廓清指数 k = ( lgOD1 - lgOD2 ) / ( t2 - t1 ) , OD1、OD2 分别 为在时间 t1、t2 时所取血样的吸光度 ; t2 - t1 为取两血样的时 间差。 胸腺指数、脾脏指数的检测 :末次取血后 ,将小鼠脱颈处 死 ,称小鼠体质量及脾脏、胸腺的质量 ,用下列公式计算 : 胸腺指数 =胸腺质量 ( g) /体重 (100g) 脾脏指数 =脾脏质量 ( g) /体重 (100g) 11417　自然杀伤细胞 (NK)活性测定 　脾细胞悬液制备与脾 淋巴细胞转化试验相同 ,调整悬液细胞浓度为 2 ×107 /m l。取 浓度为 2 ×105 /m l的 YAC - 1靶细胞和效应细胞各 100μl (效 靶比 50: 1) 加入 U型 96孔培养板。靶细胞自然释放孔加靶 细胞和培养液各 100μl,靶细胞最大释放孔加靶细胞和 1% NP40各 100μl;上述各项均设 3个复孔 ,于 37℃、5% CO2 培养 箱中培养 4 h,然后将 96孔培养板以 1500 r/m in离心 5 m in, 每孔吸取上清 100μl置平底 96孔培养板中 ,同时加入 LDH 基质液 100μl,反应 3 m in,每孔加入 1 mol/L HCl 30μl,全自 动酶标仪 490 nm处测定光密度值。 115　统计学处理 用 Excel 进行数据录入 , 数据经核对和清理后 , 用 SPSS1110软件进行一般资料的统计描述 ,各组间比较用方差 分析 ,再用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法 (Dunnett检验法 ) 进行统计分析。 2　结果 211　蛋白锌硒片对小鼠脏 /体比值的影响 蛋白锌硒片高、中、低剂量组的胸腺 /体重及脾脏 /体重比 值分别为 ( 0144 ±0108 ) , ( 0155 ±0111 ) , ( 0140 ±0106 )和 (0155 ±0110) , (0141 ±0109) , (0157 ±0107) ,分别与阴性对 照组 (0138 ±0110)和 (0149 ±0109)比较 ,差异均无统计学意 义 ( P > 0105) ,提示蛋白锌硒片对小鼠的免疫器官重量无明显 影响 ,见表 1。 表 1　蛋白锌硒片对小鼠脏器 /体重比值的影响 ( x ±s) 剂量组 (mg/kg·BW ) 动物数 (只 ) 胸腺 /体重比值 ( g/100g) 脾脏 /体重比值 ( g /100g) 010 12 0138 ±0110 0149 ±0109 013 12 0141 ±0109 0157 ±0107 016 12 0140 ±0106 0155 ±0110 118 12 0144 ±0108 0155 ±0111 212　蛋白锌硒片对小鼠细胞免疫功能的影响 蛋白锌硒片各剂量组的脾淋巴细胞转化 OD差值与阴性 对照组比较 ,均无显著性差异 ,表明蛋白锌硒片对小鼠脾淋巴 细胞转化无明显的提高作用。蛋白锌硒片各剂量组小鼠的足 跖肿胀度均大于阴性对照组 ,其中高、中剂量组与阴性对照组 的差异具有显著性 ( P < 0101) ,表明蛋白锌硒片能提高绵羊红 细胞诱导小鼠足跖肿胀程度 ,具有促进迟发型变态反应的作 用 ,见表 2。 表 2　蛋白锌硒片对小鼠脾淋巴细胞转化及 D TH的影响 ( x ±s) 剂量组 (mg/kg·BW ) 动物数 (只 ) 加 ConA与未加 ConA OD差值 足跖肿胀度 (mm) 010 12 01249 ±01076 0125 ±0107 013 12 01242 ±01040 0131 ±0109 016 12 01249 ±01070 0143 ±01193 3 118 12 01253 ±01076 0147 ±0113 3 　　注 :与阴性对照组比较 , 3 3 P < 0101 213　蛋白锌硒片对小鼠体液免疫功能的影响 蛋白锌硒片各剂量组小鼠的抗体生成细胞数 (空斑数 )均 高于阴性对照组 ,低、高剂量组与阴性对照组的差异均有显著 性 ( P < 0105) ,表明蛋白锌硒片具有促进抗体生成细胞增值的 1322中国卫生检验杂志 2009年 10月 第 19卷 第 10期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology, Oct 2009; Vol 19　No 10 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 作用。蛋白锌硒片各剂量组小鼠的血清溶血素抗体积数与阴 性对照组比较 ,均无显著性差异 ( P > 0105) ,见表 3。 表 3　蛋白锌硒片对小鼠抗体生成细胞及血清溶血素的影响 ( x ±s) 剂量组 (mg/kg·BW ) 动物数 (只 ) 溶血空斑数 ( ×103 /全脾 ) 半数溶血值 (HC50 ) 010 12 2613 ±717 4015 ±1411 013 12 3515 ±10103 4219 ±1212 016 12 3117 ±817 3813 ±1516 118 12 3510 ±8113 3917 ±1318 　　注 :与阴性对照组比较 , 3 P < 0105 214　蛋白锌硒片对小鼠单核 -巨噬细胞吞噬功能的影响 蛋白锌硒片各剂量组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞 噬率及吞噬指数均高于阴性对照组 ,中、高剂量组的吞噬率和 吞噬指数与阴性对照组比较 ,有显著性差异 ( P < 0101) ,表明 蛋白锌硒片具有促进小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬能 力。蛋白锌硒片中剂量组的碳廓清吞噬指数与阴性对照组的 差异有显著性 ( P < 0101) ,表明蛋白锌硒片具有促进小鼠的单 核 -巨噬细胞碳廓清功能的作用 ,见表 4。 表 4　蛋白锌硒片对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡 红细胞及碳廓清的影响 ( x ±s) 剂量组 (mg /kg·BW ) 动物数 (只 ) 吞噬鸡红细胞 吞噬率 ( % ) 吞噬鸡红细胞 吞噬指数 碳廓清吞 噬指数 010 12 3111 ±816 0149 ±0108 4185 ±0132 013 12 3311 ±910 0153 ±0115 5132 ±0169 016 12 5212 ±10143 3 0169 ±01133 3 5163 ±01763 3 118 12 5919 ±9103 3 0176 ±01113 3 4157 ±0160 　　注 :与阴性对照组比较 , 3 3 P < 0101 215　蛋白锌硒片对小鼠 NK细胞活性的影响 蛋白锌硒片各剂量组小鼠的 NK细胞活性均高于阴性对 照组 ,但与阴性对照组比较 ,均无显著性差异 ( P > 0105) ,表明 蛋白锌硒片对小鼠的 NK细胞活性无明显的提高作用 ,见表 5。 表 5　蛋白锌硒片对小鼠 NK细胞活性的影响 ( x ±s) 剂量组 (mg/kg·BW ) 动物数 (只 ) NK细胞活性 ( % ) 010 12 3118 ±1113 013 12 3312 ±814 016 12 3119 ±1215 118 12 3210 ±919 3　讨论 锌与硒是被公认的与机体免疫功能相关的物质 ,对于保 证免疫系统的完整性是必需的。在其缺乏时 ,机体的非特异 性免疫机能、细胞免疫和体液免疫均可明显降低 ,而在补充锌 或硒后可得以恢复。免疫系统是一个依赖于各种含锌蛋白 (如细胞的复制、转录和信号传导 )的高度增殖的器官 ,而锌可 特异性的调节免疫功能。硒能增强机体的特异性细胞和体液 免疫功能 ,这些作用可能与硒能增加免疫活性细胞内的 GSH - Px含量有关 [ 6 ]。有研究表明 ,硒能够提高机体的免疫力取 决于其化学形式、代谢途径和作用机制 ,富硒蛋白能够增强机 体的细胞免疫和体液免疫功能 ,并且对于体液免疫功能的影 响作用显著优于硒含量同样的富硒牛奶和贫硒蛋白与亚硒酸 钠的混合物 [ 7, 8 ]。蛋白锌硒片能增强巨噬细胞的吞噬功能和 单核 -巨噬细胞碳廓清功能 ,提高机体的细胞免疫 ,这种调节 作用的机理可能是锌和硒影响到细胞因子的产生及合成 ,进 而刺激 T淋巴细胞产生的 IL - 2和 INF -γ,而 IL - 2有活化吞 噬细胞的作用。研究表明 ,补锌和硒对于体液免疫功能正常 及低下动物的体液免疫并无明显的增强作用。但本实验发 现 ,蛋白锌硒片能促进小鼠的迟发型变态反应 ,提高小鼠的抗 体生成细胞数 ,说明锌硒与蛋白结合的形式更有利于锌硒发 挥提高体液免疫功能的作用 ,三者的有机结合 ,其生物学生理 活性作用得到充分发挥。 本实验观察到蛋白锌硒片给予小鼠连续灌胃 30 d,其细 胞免疫和体液免疫指标均有不同程度的提高。因此 ,蛋白锌 硒片具有一定的增强免疫力功能作用 ,可以成为一种有希望 的免疫增强剂。 [参考文献 ] [ 1 ] 丁小波 ,文利新 1微量元素锌与动物免疫 [ J ]1微量元素与健康研 究 , 2006, 23 (3) : 55 - 571 [ 2 ] 祁秀敏 ,徐小虎 ,于晓军 1锌缺乏与免疫功能的研究进展 [ J ] 1卫 生研究 , 2004, 33 (4) : 518 - 5201 [ 3 ] 王栋钢 ,杨咏梅 ,雷培芸 1硒对免疫功能的影响 [ J ] 1广东微量元 素科学 , 2003, 10 (4) : 18 - 211 [ 4 ] 朱善良 1硒的生物学作用及其研究进展 [ J ] 1生物学通报 , 2004, 39 (6) : 6 - 81 [ 5 ] 保健食品检验与评价技术规范 [ S]12003: 22 - 341 [ 6 ] 花蓓 ,施巧芳 1硒的免疫功能 [ J ]1化学教育 , 2002, 2: 1 - 31 [ 7 ] 龚伟 ,田欣田 ,张乃生 ,等 1天然富硒牛奶的实验研究 - 硒对机体 免疫机能的影响 [ J ]1中国兽医杂志 , 1997, 23 (7) : 20 - 211 [ 8 ] 杜莹 ,王晓燕 ,解清 ,等 1富硒蛋白对小鼠免疫功能影响 [ J ]1中国 公共卫生杂志 , 2006, 22 (1) : 84 - 851 (收稿日期 : 2009 - 06 - 23) 2322 中国卫生检验杂志 2009年 10月 第 19卷 第 10期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology, Oct 2009; Vol 19　No 10