高脂饮食性脂肪性肝炎大鼠肝脏线粒体损伤和ATP储备改变

, 一 一 一 世界华人消化杂志 一 一 年版权归世界胃肠病学杂志社 病毒性肝炎 ’ 高脂饮食性脂肪性肝炎大鼠肝脏线粒体损伤和 尸储备改变 丁晓东 , 范建高 , 徐正婕 , 郑晓英 , 田丽艳 , 王国良 丁晓东 , 上海第二 医科大学附属新华医院消化内科 上海市 咒 范建高 徐正婕 , 郑晓英 田丽艳 王国良 上海市第一人民医院消化内科 上海市 丁晓东 , 男 , 年生 山东烟台市人 汉族 年白求恩医科大学毕业 年复旦大学上海医学院内科学硕士毕业 主要少人事慢性肝病的研究 通讯作者 范建高 。。。 , 上海市第一人民医院消化内科 , 月 电话 一 传真 一 收稿日期 一 一 接受日期 一 一 , 」 , , , , 川 行 , 铆 们 阳 一 , 一 臼 , 劝 一 , 及 , 一物 石 , 一 , , , , , · 珑 坷 一 一 , , , 洲 , 妇 加 内 , 飞阅一 , 泊介豹 趾 , 一 下 , 盯 日 , , , 《 , 一 , , , , , 《 , 几川 以一 一 一 一 摘要 目的 探讨高脂饮食大鼠脂肪性肝炎模型肝脏线粒体损 伤和三磷酸腺普 储备的改变 一 大鼠随机分为模型组 和对照组 , 分别给予高脂饲料和饲料喂养 , 分批于实验 、 、 和 处死 常规检测血清生化和肝匀浆 含量 , 光镜和 电镜观察肝脏组织学改变 一 一 , , , 日 伪 以 一 结果 与对照组相比 , 模型组肝脏 时肝脂肪变明 显 , 表现为单纯性脂肪肝 , 一 进展为脂肪性 肝炎 模型组肝脏 含量呈减低趋势 , 一 时 较对照组减低约 乃 电镜下 模型组大鼠肝 细胞线粒体肿胀 、 增大 , 部分 内膜峰粒脱落 , 和 大鼠线粒体内有类圆形结晶样物质沉积 结论 高脂饮食大鼠脂肪性肝炎模型的肝细胞存在线粒 体损伤和 储备的减低 , , , 【 土 一 林 士 一 林 , , 』 山 【 幻 一脚。均 扣 沪卿。吻 , 关键词 非酒精性脂肪性肝炎 线粒体 三磷酸腺普 丁晓东 范建高 徐正婕 关脱英 田丽艳 王国良 高脂饮食性脂肪惭干炎大鼠 肝脏绷立体损伤和奸尸储备改变 世界华六 肖化杂志 一 一 门 门 引言 随着非酒精性脂肪性肝炎 , 发病率的增高 ‘ 一 魂 , 针对 的 研究越来越多 能量供应超过机体需要时 , 大量转化 丁晓东 , 等 高脂饮食性脂肪性肝炎大副干脏线粒体损伤和 户储备改变 为脂肪蓄积在机体 内 , 当超过外周脂肪组织的蓄积 能力后 , 易脂解为游离脂肪酸 。 , 进入血液 , 运输到肝脏 , 经过 氧化转化为三 磷酸腺普 , 储备在 肝细胞 内 线粒体在 氧化中发挥核心作用 , 如果线 粒体损伤导致脂肪酸代谢障碍 , 便酷化为三酞 甘油 , 蓄积在肝脏 , 导致肝细胞 内脂滴增多 , 发生肝细胞脂肪变 为此 , 我们动态观 察 形成过程中肝脏线粒体超微形态改变和 储 备情况 , 以明确他们在 发病 中的作用 材料和方法 材料 雄性 大鼠 只 , 购 自中科院上海实验动 物中心斯莱克公司 , 体质量 一 胆固 醇 , 上海生化试剂商店 猪油 , 自备 血清生化指标通 过 全 自动生化分析仪检测 荧光素酶 一 荧 光素 、 标准 粉剂和荧光素酶系缓冲液 中科院上海 植物生理研究所 低温离心机 公司 , 一 透 射电子显微镜 飞利浦透射电镜 一 型发光 光度计 中科院上海植物生理研究所 大鼠正常喂养 后 , 随机分为 组 对照组 只用普通饲料喂 养 , 模型组 只以 胆固醇 猪油 标准大鼠用饲料构成的高脂饲料喂养 实 验开始后 、 、 和 分别处死 只对照组 和 只模型组大鼠 所有大鼠处死前夜禁食 , 以氯胺 酮麻醉 , 腹主动脉采血后取肝 , 称量肝脏湿质量 , 之 后迅速从肝脏切取 块肝组织 , 中性甲醛固定后制备 石蜡切片 , 同时一小块肝脏标本标记后液氮罐中冷 冻保存 , 并取 “ 的肝脏组织一块戊二醛固定后行 电镜检查 方法 血清 、 、 和总胆固醇 , 采 用全 自动生化分析仪检测 肝组织石蜡切片 染色观 察肝病理学变化 , 根据肝小叶内含脂滴细胞数 总细胞 数之比值 , 对肝细胞脂肪变进行分级 一 肝脏炎症活动 度计分 。 , 标准分为汇管区炎症 、 小 叶内炎症 、 碎屑样坏死 、 桥接坏死 项 , 计分公式为 十 十 十 肝脏经戊二醛固定 后 , 由 型超薄切片机切片 , 构椽酸铅色片染 色 , 透射电镜观察肝细胞超微结构的改变 , 尤其是线 粒体的变化 测定所有试剂均用重蒸蒸馏水配制 , 溶液为 腺昔酸提取液 · , 荧光素酶系缓冲液 每只粉剂用 重蒸水溶解 , 内含 甘氨酞甘氨酸 、 、 缓冲液 的标准曲线 将 配成 一‘ 一 一 的 管应用液进行测定 , 以相对发光强度的 值与 浓度绘制标准曲线 荧光素酶 一 荧光素法测定 取肝组织 一 , 加入 腺昔酸提取液中 , 匀浆后沸水中加热 , 然后 以 离心 , 取上清液 检测时将肝匀浆液 加入重蒸馏水 稀释 , 置入 的比 色杯中 , 放入 一 型发光光度计的暗室中 , 从暗室 盖的小孔中快速注入荧光素酶系缓冲液 , 所记 录之发光曲线的初始峰值即为检测样品光强 , 测定温 度为 ℃ , 测定电压为 根据所得光强 测定曲 线上所 占的小格数 后 , 在标准 曲线上查出 值 统计学处理 计量资料用 士 表示 , 组间比 较采用 检验 , 为差别有统计学意 义 , , 为差别有显著性统计学意义 , 所有统 计采用 , 软件完成 结果 实验过程中 组大鼠体质量 、 肝质量和腹腔内脂肪含 量均呈进行性增加 从 开始模型组大 鼠体质量 、 肝指数 肝脏湿重 体质量 和腹腔内脂肪指数 腹腔 内脂肪含量 体质量 均显著高于对照组 只 , 升高最明显 , 表 与对照组相 比 , 表 各组大鼠体质工 、 肝菌 、 腹腔内脂肪含 , 改变 分组 正常组 高脂组 正常组 高脂组 正常组 高脂组 正常组 高脂组 体质量 士 士 土 士 士 士 士 士 肝重 肝指数 脂肪指数 土 士 土 ‘ 士 士 土 士 启 士 土 土 土 土 刀 土 士 习 土 土 刀 士 刀 士 士 士 士 士 土 士 刀 土 刀 士 刀 士 土 士 士 土 士 , “ 对照组 一 一 世界华人消化杂志 。。 年 月 日 第 卷 第 期 表 各组大鼠生化指标改变 ,了,矛士土士 分组 正常组 高脂组 正常组 高脂组 正常组 高脂组 正常组 高脂组 灯 士 儿 土 士 士 土 士 土 士 士 士 士 土 士 土 士 土 士 士 土 土 ‘ 士 儿 士 士 土 士 士 土 士 , 土 , “ 对照组 表 各组大限肝脂肪变程度和 计分 脂肪变程度 分 组 — 一 林 一 十 对照组 士 ‘ 高脂组 石 士 土 高脂组 土 士 高脂组 士 上 “ 高脂组 习 士 ‘ 土 , , ”尸 对照组 在第 一 部分模型组大鼠血清 水平明显升高 , 时模型组大鼠血清 均值显著增高 只 , 时增高更为明显 只 血清 水平在造模 开始显著升高 对照组只 , 至造模 达高峰 两组大鼠血清 水平在造模 一 时差异 不明显 , 但在 时 , 模型组与对照组相 比明显 升高 血清 水平 自造模 始呈增高趋 势 , 时差别有统计学意义 只 , 一 时升高更为明显 , 表 肝脏病理学改变 光镜下 , 肝组织 染色显示造 模 大鼠肝脏即有弥漫性肝细胞脂肪变性 , 以肝腺 泡 工 区最为明显 , 达脂肪肝诊断标 准 , 肝脏小叶内出现轻度炎症细胞浸润和 散在的点状坏死 造模 大鼠呈中一重度脂肪肝 , 且 积分显著高于造模 大鼠 只 , 所有大鼠均可见到小叶内炎症 , 炎症细胞 以单个核 细胞为主 , 伴点状和 或小灶性坏死 , 部分标本见数 个炎症坏死灶融合成片 , 汇管区亦可见到以单个核细 胞为主的炎症细胞浸润 时 , 大鼠肝脏内往往 数个坏死灶融合成片 , 例出现碎屑样坏死 , 例出 现桥接坏死 , 汇管区炎症也较重 造模 大鼠仍 呈中 一 重度脂肪肝 , 肝脏炎症仍然较重 、 模 型组 , , 表 , 与 高脂 组相比 , 其小叶内炎症略有减轻 , 其中 例 汇管区炎症加剧 透射 电镜下 , 与正常肝细胞相 比 图 模型组大鼠肝细胞内充满大量脂滴 , 肝细胞核 被胞质内积聚的大脂滴推挤 , 从肝细胞中央区被推到 细胞的周边 图 肝细胞线粒体结构异常 , 表现为 线粒体增大 、 肿胀 、 线粒体内靖粒脱落 、 减少 , 且随 着造模时间延长 , 线粒体损害加重 , 部分线粒体内可 以看到类圆形高密度结晶样物质沉积 图 模型组 标本电镜下肝脏内发现胶原纤维沉积 图 大鼠肝脏 含量改变 对照组大鼠肝脏 含量 为 士 一 ”卿 , 模型组肝脏 含量 随着造模时间延长呈逐渐下降趋势 , 模型组与对 照组相比具有统计学意义 尸 , , 模型组 含量进一步下降 , 与对照组 比较 含量降低约 , 且差异具有明显 的统计学意义 护 , 相关分析显示 , 对照组 肝脏 含量与体质量之间呈负相关 厂 一 , 只 , 模型组肝脏 含量与体质量的相关性不 明显 , 只 无论模型组还是对 照组大鼠肝指数与肝脏 含量之间均没有明显的 相关性 丁晓东 , 等 高脂饮食性脂肪性肝炎大副干脏线粒体损伤和 尸储备改变 圈 肝细饱透射电镜扫描结果 正常肝细胞 , 细胞核位于细胞中央 , 线粒体形态正常 , 崎粒位于内晴上 。。 高脂组 肝细 胞 , 线粒体结构异常 , 可见线粒体增大 、 肿胀 、 线粒体内峭枷兑落 、 减少 , 部分线粒体内可以看到类圆形高密度结晶样物质沉积 灭 高 脂组 肝脏内发现胶原纤维沉积 高脂组大鼠肝细胞内充满大量脂滴 , 细胞核被胞质内积聚的月旨滴推挤到细胞的周边 讨论 通过高脂饲料喂养雄性 大鼠 , 对肝脏病理变化进 行 了动态观察 , 结果与我们 以前造模情况基本吻 合 , 实验动物出现超质量 、 高胆固醇血症 、 中 一 重 度脂肪肝伴以小叶内为主的炎症坏死 , 从而通过高脂 饲料成功建立了普通 大鼠的 模型 〔一‘ 肝脏是 机体能量代谢和转换的中枢器官 线粒体是体内中 、 长链脂肪酸 氧化的核心细胞器 , 其在代谢脂肪酸的 过程中产生大量 , 为 合成的主要细胞器 含量决定了细胞对应激的反应能力 , 如果其含量降 低 , 会导致细胞对应激的反应不足 , 引起肝脏的严重 损伤 , 因此组织中 水平是反映组织细胞功能状态 及其生命力的重要参数之一 〔’‘一 ” 〕 为此我们动态观察 了 大鼠模型肝细胞超微结构的改变 , 尤其是线 粒体形态的改变 , 并测定了肝脏 的含量 , 探讨二 者在 发病中的可能作用 电镜检查显示 , 模型组肝细胞中充满大量脂滴 , 导致胞核移向细胞边 缘 , 伴肝细胞线粒体肿胀 、 变圆 、 体积增大 , 细胞内 膜靖粒部分脱落 随着造模时间的延长 , 肝细胞线粒 体损伤逐渐加重 , 造模 起部分线粒体内见类 圆形高密度沉积物 这与国外报道的 肝脏线粒体 损伤的程度相近 , 此时往往同时伴有线粒体 合成 酶亚单位减少 、 线粒体产生 增多等 一川 对肝脏 含量的测定结果表明 , 模型组 肝脏 储备降低 左右 进一步的相关分析显示 , 实验大鼠体质量与肝脏 含量具有一定的相关性 , 这主要见于正常对照组肝脏 , 而模型组则没有发现二 者之间具有相关性 这一结果与 一 〕 在 患者所得出的结果相似 , 作者发现正常人群 肝脏 储备与体质量指数 , 关系密切 , 工越大 , 其肝脏 含量越低 而发生 后的患者 , 尽管肥胖 , 但其肝脏中 储备与 的负相关性不明显 , 这可能与 肝脏 储 备本身就减少有关 肝脏能量储备不足容易导致肝脏 对再次打击的耐受力降低 一 。 。 幻对 肝活检证实的 例 患者用果糖静脉注射诱发短暂 的中等度肝脏 耗竭 , 注射后 二者 含 量均降到最低值 , 时对照组 含量恢复到注 射前水平 而此时 组 含量没有恢复到注射前 水平 , 直到实验结束其与对照组恢复后的 含量相 比仍有显著的统计学差异 , 说明 患者肝脏遭受 中等度果糖注射应激后 , 其 储备恢复能力降低 作者同时发现对照组 储备恢复程度与 呈负相 关 , 提 示 肥 胖 者 肝 细 胞 对 应 激 反 应 能力 不 足 了 〕进行的实验发现脂肪肝大鼠肝 细胞线粒体上 一 , 合成酶的 一 , 催化亚单位较 对照组减少 , 其线粒体内 含量亦明显降低 对两组禁食 后 , 实验组的 一 , 亚单位较禁食前 一 一 世界华人消化杂志 年 月 日 第 卷 第 期 明显减少 , 而对照组无明显变化 , 说明 合成的 一 亚单位减少与肝脏 储备降低具有一定的相关 性 · 〔‘ 〕用 大鼠诱导的脂肪肝模 型进行缺血再灌注试验发现门静脉结扎 后 , 对照组肝细胞 含量降低 , 而 大 鼠则高 达 , 恢复灌注 后对照组 含量恢复到 缺血前水平 , 而 。 。 大 鼠则有 只死亡 , 存活的 只其 含量明显低于基线时的水平 这些实验和我 们 的实验说明 , 脂肪变的肝脏的确存在 储备降 低 , 使肝脏耐受二次打击 如手术 、 缺血灌注损伤 、 禁食和果糖应激等 的能力降低 总之 , 我们的研究 结果提示 , 高脂饮食 大鼠存在肝脏肝细胞线粒 体结构的损伤和 储备的减低 , 并可能参与 的发生和发展 列 过 之 一 , 九 一 , , 一 一 明 , 月中 一 币 五 命 ” 犷 舒 一 范建高 , 曾民德 非酒精性脂肪性肝病的分类及其诊断策略 中 华肝脏病杂志 一 中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组 非酒精性脂 肪性肝病诊断标准 中华肝脏病杂志 一 中华肝胜病学会肝纤维化学组 肝纤维化诊断及疗效评估共识 中华肝脏病杂志 加 一 , , , , , , 也 , 优 摊 亡, 一 , 叭 , 哥 , , 一 胡 让 物 砚 了 翻亡曰勺 , 徐正婕 , 范建高 , 王国良, 丁晓东 , 田丽艳 , 郑晓英 高脂饮食致大 鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纤维化漠型 世界华川肖化杂志 一 饥 , 杨 石侧 二 一 , , , , · 即 匆 一 , , , 比 , 汕 , , 珑 一 一 , 一 , , 趾 , 研 , 石 , , 州 产 心 而 九亡口口叔卿 一 , , 珑 , , 印 一 , , , , , , , , 一 , 桩 己户 一 一 , , , , , , , 一 亡 而 月叩‘ 舒 一 , 九 加刀 一 , , , 一 饥 叩 舒 一 , , , 加 一 , , ” 刀 一 一 , 血 , , , , 了人州叭 一 而 , , 珑 刘 甲 一 , , 川 , , , 五 , , , , , , 住 魂伴 中口 一 编挥 潘伯荣 审读 张海宁