高脂饮食诱导肥胖大鼠模型的实验研究

# 论著# 高脂饮食诱导肥胖大鼠模型的实验研究 上海市内分泌代谢病研究所 ( 200025) 林 帆1 钱 镭 林 苗1 王 晓 罗 敏2 国家自然科学基础资助项目 ( 30871205) ; 福建省卫生厅青年科研基金 ( 200621241, 200622241) 1 福建省立医院; 2 通信作者, Email: luomin doc@yahoo1 cn =摘 要> 目的 建立营养性肥胖大鼠动物模型。方法 雄性 SD大鼠 50 只随机分成高脂饮食组和普通饮食 组, 于喂养第 12 周时测大鼠体重、血脂、空腹胰岛素、葡萄糖耐量、胰岛素耐量, 于第 16 周留尿测定微量白蛋白 和肌酐, 留取肾周和附睾脂肪称重, 分离大鼠胰岛进行体外培养, 测定胰岛及单个细胞直径。结果 与对照组相 比, 高脂组大鼠体重、肾周及附睾脂肪含量、血脂、空腹胰岛素水平以及尿白蛋白的排出均明显升高, 存在糖耐量 减低、胰岛素抵抗。高脂组大鼠中直径大于 200 Lm 的大胰岛比例增多, 胰岛细胞数目增多。结论 建立的肥胖大 鼠模型较接近成年人肥胖症的病理生理改变, 可作为肥胖及相关疾病的研究平台。 =关键词> 肥胖; 动物模型; 大鼠; 胰岛; 蛋白尿 =中图分类号> R1511 1 =文献标识码> A =文章编号> 100222600( 2009) 0620001203 Experimental study of high2fat diet2induced rat model with obesity Lin Fan, Q ian Lei, Lin Miao, Wang Xiao, Luo Min. Shanghai Inst itute of Endocrine and Metabolic Disea2 ses, Shanghai 200025, China =Abstract> Objective To establish rat model with nut rit ional obesity. Methods F ifty male SD rat s were randomly di2 vided into t wo groups and maintained for 16 weeks on high2fat diet and normal diet respectively. Body weight, serum lipids, fast ing insulin, intraperitoneal glucose tolerance t est ( IPGT T) and insulin t oler ance test ( IT T) were measured after 12 weeks in the two groups. Ur ina ry albumin/ creatinine ratio ( ACR) , per irenal fat and inguinal fat were measured after 16 weeks, as well as islets of these rats were isolated for compa ring their diamet er. Results H igh2fat diet resulted in a significant incr ease in body weight, serum lipids, fast ing insulin, ACR, glucose intoler ance, insulin r esistance, as well as the content of per ir enal fat and inguinal f at . Both t he propor tion of diameter \ 200Lm of islets and the number of pancreatic cells fr om rats with obesit y were significantly higher than t hose of the control group. Conclusion Established rat model with obesity which are closer to the pathophysiological changes of adult obesity may provide the research platform for obesity and related diseases. =Key words> Obesity; Animal model; Rats; Islets of langerhans; Proteinur ia 随着人们生活水平的提高, 饮食结构和生活方式逐渐改 变, 肥胖的发生率也逐年升高, 已成为一种威胁健康的流行 病, 同时它还是 2型糖尿病、高血压病和心血管疾病的危险 因素[ 1]。而对肥胖症发病机制和防治方法的研究离不开营养 性肥胖动物模型的建立, 本研究应用高脂饮食诱导 SD 大鼠 建立营养性肥胖模型, 通过胰岛分离技术, 检测肥胖大鼠胰 岛直径, 通过尿白蛋白/肌酐比值 ( albumin/ cr eatinine ratio, ACR) 了解肥胖大鼠肾脏损害情况, 旨在为肥胖及相关疾 病的研究提供实验平台。 1 材料和方法 11 1 材料: ( 1) 动物: 雄性 SD大鼠 50 只, 体重 ( 90 ? 5) g, 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司 [许可证号: SCXK (沪) 200320003, 合格证号: 0030600]。 ( 2) 主要试 剂和仪器: 大鼠胰岛素 RIA 试剂盒 (美国 Linco 公司) , XI 型胶原酶 (美国 Sigma 公司 ) , 全自动生化仪 (美国 Beckman CX9 型) , 透射电镜 (荷兰 philips CM120) , 体式 显微镜 (德国 Leica公司) , 倒置显微镜 (日本 Olympus公 司) , 血糖仪 (德国罗氏公司)。 11 2 方法: 11 21 1 饲养方法及分组: 大鼠饲养温度 20~ 25 e , 自由饮 水, 昼夜明暗交替日光灯照明。普通、高脂饲料由上海斯莱 克实验动物有限责任公司按配方提供, 并经钴 60 辐照灭菌, - 20 e 保存。大鼠送抵动物房后适应性喂养普通饲料 1 周, 后随机分成普通饲料组 20 只和高脂饲料组 30只。高脂组先 喂 10%猪油, 2 周内逐渐过渡到 20%猪油高脂饲料, 共喂 养 16 周。 11 21 2 腹腔注射的葡萄糖耐量试验 ( IPGTT ) : 喂养 12 周, 试验前大鼠禁食 12 h, 按 2 g/ kg 腹腔注射 50%葡萄糖, 分 别于 0 min (空腹) , 糖负荷后 15、30、60、90、120 m in 尾 静脉采血测定血糖。 11 21 3 胰岛素耐量试验 ( ITT) : 喂养 12 周, 大鼠禁食 4h 后, 按 01 75 U/ kg 腹腔注射胰岛素, 分别于 0、15、30、 60、90、120 min 割尾静脉取血测定血糖。 11 21 4 空腹血脂、血糖及胰岛素测定 : 喂养 12 周, 大鼠禁 1福建医药杂志 2009年 12月第 31卷第 6期 Fujian Med J, December 2009, Vol 31, No1 6 食 12 h 后, 心脏采血测定血脂包括 TG、TC、HDL2C、 LDL2C。血浆胰岛素 ( INS) 送瑞金医院检验科 (下同) 按 放免法测定。 11 21 5 大鼠尿 ACR 测定: 喂养 16 周后于代谢笼内收集大 鼠随机尿液, 送检验科测定尿微量白蛋白 (免疫速率散射比 浊法) 及尿肌酐 (酶促动力学法)。 11 21 6 大鼠胰岛原代分离培养: 喂养 16 周, 3% 戊巴比妥 钠腹腔麻醉大鼠, 缓慢原位灌注 01 5 mg/ m l XI 型胶原酶, 梯度密度离心法分离胰岛, 同时留取肾周和附睾脂肪称重。 体视显微镜下手捡胰岛, 含 10% FBS的 1640 培养基中培养 过夜。 11 21 7 原代胰岛直径及单个细胞直径测量: 胰岛体外培养 恢复过夜, 20 倍光镜下, 每组胰岛随机选取 3 个视野, 每 个视野 25 个胰岛左右, 利用 Leica QwinPlus 31 1 Software, 对每个视野下胰岛进行直径测量选择长径并记录, 测量 5 组。之后随机取 100个胰岛, 用胰酶消化成单个细胞, 重悬 于 PBS中 , 取 100 Ll进行单个细胞直径测定。 11 21 8 离体胰岛的胰岛素分泌实验: 胰岛分离后, 以含 01 2% BSA 的低糖 DMEM 培养恢复过夜, 以含 01 2% BSA + 21 8 mmol/ L 葡萄糖的 KRB缓冲液预培养胰岛30 min, 之 后分别换含 21 8 mmol/ L 和 111 1 mmol/ L 葡萄糖的 KRB缓 冲液, 培养 1 h, 收集上清于 - 80 e 冰箱保存, 待测胰 岛素。 11 3 统计学分析: 采用 SPSS 111 0 进行统计分析。数据均 以x ? s表示, 两组间比较采用 t检验, P < 01 05 为差异有统 计学意义。 2 结果 21 1 大鼠体重、肾周及附睾脂肪重量, 血脂、INS、ACR 比较: 与对照组相比, 高脂组大鼠体重、肾周及附睾脂肪含 量, TC、HDL2C、LDL2C、INS均明显升高, TG 在两组间 无明显差别 (表 1)。高脂组 ACR [ (21 98 ? 01 90) Lg/ mg] 较对照组 [ ( 21 20? 01 19) Lg / mg] 明显升高 (P < 01 05)。 表 1 大鼠体重、肾周及附睾脂肪含量, 血脂、胰岛素含量比较 ( x ? s) 组别 n 体重 ( kg) TG (mmol/ L) TC (mmol /L ) HDL2C (mmol/ L) LDL2C (mmol/ L) INS ( ng/ ml) 肾周及附睾脂肪 ( g) 对照组 20 4891 0 ? 251 8 01 95 ? 01 32 01 75 ? 0110 01 78 ? 01 12 01 23 ? 01 08 0189 ? 01 74 121 71 ? 31 81 高脂组 30 6061 8 ? 601 7* 01 86 ? 01 21 1151 ? 01 29* 11 23 ? 01 18* 01 92 ? 01 25* 21 61 ? 11 23* 251 58 ? 51 64* 注: 与对照组比较, * P< 01 05 21 2 两组 IPGTT 和 ITT 比较: 高脂组大鼠空腹血糖、糖负 荷后 15、30、60、90 min 血糖均明显高于对照组大鼠 (表 2)。注射胰岛素后 15、30、90 min 高脂组大鼠血糖水平均 高于对照组, 而 60、120 min 无明显差别 (表 3)。 表 2 高脂组与对照组大鼠 IPGTT比较 ( mmol/ L, x ? s) 组别 n 血糖 0 min 15 min 30 min 60 min 90 min 120 min 对照组 20 51 3? 01 3 101 4? 01 8 81 7 ? 11 5 61 9 ? 01 7 61 3 ? 01 4 61 5? 01 6 高脂组 30 51 9? 01 4* 141 1? 11 4*111 2? 11 0* 81 7 ? 01 5* 71 6 ? 01 7* 61 9? 01 5 注: 与对照组比较, * P< 01 05 表 3 高脂组与对照组大鼠 IT T比较 ( mmol/ L, x ? s) 组别 n 血糖 0 min 15 min 30 min 60 min 90 min 120 min 对照组 20 41 5? 01 6 41 1? 11 0 31 0 ? 01 6 21 0? 01 7 11 5? 01 5 11 6? 01 8 高脂组 30 51 7? 01 9* 51 5? 11 7* 41 2 ? 11 6* 21 7? 11 521 3? 11 3* 21 2? 11 5 注: 与对照组比较, * P< 01 05 21 3 大鼠胰岛及单个细胞直径比较: 镜下观察发现, 高脂 组大鼠直径大于 200 Lm的大胰岛数占总胰岛的比例 ( 291 1 ? 31 5)% 较对照组 ( 201 2 ? 21 4) % 增加 (图 1、2, P < 01 05)。对照组与高脂组胰岛消化后单个细胞直径均在 11~ 14 Lm, 没有明显的偏移。 图 1 对照组胰岛直径构成比 (单位: Lm) 图 2 高脂组胰岛直径构成比 (单位: Lm) 21 4 大鼠胰岛体外培养后葡萄糖促泌结果: 对照组与高脂 组大鼠胰岛对葡萄糖刺激的胰岛素分泌升高幅度接近, 高脂 组大鼠胰岛不论是基础状态低糖时, 还是葡萄糖刺激后胰岛 素分泌均较对照组有升高的趋势, 但差异无统计学意义 (图 3)。 3 讨论 2 福建医药杂志 2009年 12月第 31卷第 6期 Fujian Med J, December 2009, Vol 31, No1 6 图 3 对照组与高脂组胰岛体外葡萄糖刺激后 胰岛素分泌结果 原发性肥胖症最常见的原因是能量摄入过多、消耗减 少, 营养平衡失调, 能量在体内以脂肪的形式贮存。在建立 营养性肥胖动物模型方面的研究不少[ 225] , 但在肥胖动物模 型进行胰岛分离和尿微量白蛋白研究的文献尚少。本研究以 高脂饮食诱导建立肥胖大鼠模型, 与对照组相比, 高脂组大 鼠体重、肾周及附睾脂肪含量, 血清 T C、LDL2C、空腹 INS水平均显著升高; IPGTT 空腹和糖负荷后 15、30、60、 90 min 各时间点血糖升高, 提示糖耐量异常; IT T 示胰岛 素负荷后 15 min 和 30 min血糖恢复较对照组延迟, 提示胰 岛素抵抗。以上结果说明, 该肥胖大鼠模型存在内脏脂肪增 多、糖脂代谢紊乱。由此, 我们通过胰岛分离技术, 在体外 条件下探讨肥胖对胰岛大小和细胞数目的影响, 结果发现, 高脂组大鼠胰岛碎片明显增多, 提示肥胖大鼠胰岛较对照组 脆弱。同时, 高脂组大鼠胰岛直径的变异也较对照组增大, 这与前者中直径大于 200 Lm 的大胰岛比例增多有关。早在 20 多年前, Chan 等和 Ahuja 等[6, 7]利用免疫组化技术就发 现肥胖 Zucker大鼠胰岛体积较对照组增大。Weir 等[8]在人 体中也发现了类似的结果, 这说明高脂诱导的肥胖个体与基 因缺陷导致的肥胖个体均存在胰岛大小的改变。用胰酶消化 胰岛成单个细胞测量结果提示, 两组细胞的直径均在 11~ 14 Lm, 平均值多在 12 Lm左右, 由此可见细胞数目增多是 胰岛增大的主要原因。而胰岛体外分离培养后进行的葡萄糖 促泌实验显示, 高脂组大鼠胰岛对葡萄糖刺激的反应性与对 照组相当, 而且高糖刺激后的胰岛素分泌与对照组相比有升 高的趋势, 这与其他研究报道的肥胖大鼠胰岛对高糖反应性 下降不同[9, 10]。分析其原因可以发现, 这些实验是选用基因 缺陷的动物作为肥胖模型的, 不排除基因缺陷对胰岛素分泌 的直接影响, 而本研究使用的是普通 SD大鼠, 排除了基因 缺陷的影响, 而且采用高脂饮食诱导肥胖的方式, 符合生理 改变, 可以更好地解释胰岛细胞对抗胰岛素抵抗的代偿 现象。 众所周知, 腹型肥胖、胰岛素抵抗、微量白蛋白尿均是 代谢综合征的重要组成成分。Diana等[ 11]用高胆固醇饮食喂 养雌性 SD大鼠, 24 周后出现肥胖、高胆固醇血症及蛋白 尿, 由此建立肥胖相关肾损害的动物模型。有研究表明, 尿 蛋白排出增多与肾小球脏层上皮细胞 (也称足细胞) 损伤, 导致滤过膜电荷屏障和孔径屏障破坏有关[ 12, 13]。本研究中 我们也检测了大鼠 ACR, 发现高脂喂养 16 周后, 高脂组大 鼠尿白蛋白的排出量较对照组增加, 出现微量白蛋白尿, 提 示存在与肥胖相关的肾脏损害。 综上所述, 本研究中 SD 大鼠经 12 周的高脂喂养, 出 现内脏脂肪堆积过多、脂代谢紊乱、糖耐量减低、胰岛素抵 抗, 到第 16 周时出现肥胖相关的肾损害, 较接近临床上成 年人肥胖症的病理生理改变, 且高脂配方简便易行, 效果理 想, 故可作为肥胖及相关疾病研究的动物模型。 参 考 文 献 1 Sowers JR. 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