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05----机械牵张作用对牙周膜成纤维细胞增殖的影响

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05----机械牵张作用对牙周膜成纤维细胞增殖的影响 本项目由国家自然科学基金资助 (编号 :30170245) 作者单位 :西安第四军医大学口腔医学院正畸科 710032 机械牵张作用对牙周膜成纤维细胞增殖的影响 冯雪  陈富林  林珠  段银钟 【摘要】 目的 :观察机械牵张作用对牙周膜成纤维细胞 ( PDL Fs)增殖能力的影响。方法 :用自行研制的细胞 加载系统对 PDL Fs 施以频率为 6 次/ min (每次为 5 s 牵拉、5 s 松弛) ,幅度 12 %的牵张力 ,于加载 24、48、96 h 后 ,通过细胞计数、流式细胞仪检测观察 PDL Fs 增殖能力...
05----机械牵张作用对牙周膜成纤维细胞增殖的影响
本项目由国家自然科学基金资助 (编号 :30170245) 作者单位 :西安第四军医大学口腔医学院正畸科 710032 机械牵张作用对牙周膜成纤维细胞增殖的影响 冯雪  陈富林  林珠  段银钟 【摘要】 目的 :观察机械牵张作用对牙周膜成纤维细胞 ( PDL Fs)增殖能力的影响。方法 :用自行研制的细胞 加载系统对 PDL Fs 施以频率为 6 次/ min (每次为 5 s 牵拉、5 s 松弛) ,幅度 12 %的牵张力 ,于加载 24、48、96 h 后 ,通过细胞计数、流式细胞仪检测观察 PDL Fs 增殖能力的改变情况。结果 :在不同的时间点 ,加力组及对 照组的细胞数均不断增加 ,在 48 h 及 96 h 时加力组结果明显高于对照组。流式细胞仪结果显示在不同时 间点加力组处于 DNA 合成期的细胞数明显高于对照组。结论 :在对培养的人 PDL Fs 施加频率为 6 次/ min、 幅度 12 %的牵张力时 ,对细胞的增殖起一定的促进作用。 【关键词】 牵张力 ;牙周膜成纤维细胞 ;增殖 Stretch2induced prol iferation of cultured periodontal l igament f ibroblasts Feng X ue , Chen Fulin , L in Zhu , et al . Depart ment of O rthodontics , College of S tom atology , Fourth M ilitary Medical U niversity , Xi’an 710032 【Abstract】Objective : To observe the proliferation of periodontal ligament fibroblasts ( PDL Fs) under mechanical stretching. Methods : PDL Fs were stretched by 6 cycles/ min (5 seconds stretching and 5 seconds relaxing) with 12 % stretching force through self2produced cultured cell loading system. At experimental time point 24 ,48 and 96 hours , the cells were counted and flow cytometry was employed to observe the proliferation of PDL Fs. Results : 48 h and 96 h after stretch treatment the cells in experimental groups were significantly more than those in control groups respectively ( P < 0. 05) . The result of flow cytometry showed that S phase cells in experimental groups were much more than those in control groups. Conclusion : PDL Fs proliferation can be promoted by proper stretch treatment . 【Key words】  S t retching f orce ; Periodontal ligament f ibroblasts ; Prolif eration 中图分类号 :Q253  文献标识码 :A  文章编号 :100123733 (2003)204620312203   牙周膜成纤维细胞 ( PDL Fs)作为牙周膜内的主要 细胞成分 ,具有独特的生物学特性 ,在牙周膜的改建过 程中起重要的作用。由于牙齿不断地受到各种力的作 用 ,如咬合力及正畸力等 ,牙周膜成纤维细胞一定会具 有某些生物学改变。关于细胞、组织及器官在受到机 械力后所发生的生物学变化研究较多 ,但由于所采用 的模型、力的施加方式以及力值的大小均存在差异 ,所 获得的结果也不尽相同。另外 ,对于牙周膜成纤维细 胞在受到机械力后生物学状态的改变研究较少 ,因此 , 本研究利用自行研制的细胞加载系统对培养的人牙周 膜成纤维细胞进行加载 ,观察机械牵张作用对其增殖 的影响。 1  材料与方法 1. 1  材料 Flexercell 细胞加载系统 (自行研制) ,6 孔弹力膜 培养皿 ( Flexcell) ,DMEM 培养液 ( Gibco) ,胎牛血清 (fetal bovine serum , FBS , Hyclone) ,胰蛋白酶 ( Sig2 ma) ,CO2 细胞培养箱 ( Forma) ,倒置显微镜及照相系 统 (Olympus) ,25 ml 细胞培养瓶 (Nunk) ,流式细胞检 测仪 ( FACSCalibur Becton Dickinson) 。 1. 2  方法 1. 2. 1  PDL Fs 的培养  选取 10~16 岁青少年因正 畸拔除的前磨牙 ,在超净台内以 DMEM 培养液冲洗 2 遍 ,无菌条件下刮取牙根中 1/ 3 的牙周膜组织 ,剪成 1 mm 3的小块 ,平铺于培养瓶底 ,加入含φ= 10 %FBS 的 DMEM 培养液 4 ml ,置于培养箱 ,于 37 ℃,φ( CO2) = 5 %2 ,φ(空气) = 95 % ,100 %湿度条件下培养 2 h , ·213· 实用口腔医学杂志 (J Pract Stomatol) 2003 J ul ,19 (4) © 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 翻转瓶底 ,继续培养。倒置显微镜下严密观察细胞生 长情况 ,待有细胞长出后 ,每 3 d 换液一次。待细胞长 满瓶底后 ,用 2. 5 g/ L 胰蛋白酶消化、传代 ,传至第 4 代时备用。 1. 2. 2  细胞接种与加载  将消化好的细胞计数后 , 按 2 ×104 个/ 孔的浓度接种于 6 孔弹力膜培养皿中 , 加入含φ= 10 %FBS 的 DMEM 培养液 3 ml ,培养 24 h ,待细胞贴壁后 ,吸去培养液 ,加入含φ= 1 %FBS 的 培养液 3 ml。加力组开始加载 ,频率为 6 次/ min (每 次 5 s 牵拉、5 s 松弛) ,幅度约为 12 %。于加载 24、48、 96 h 后进行检测 ,以不加载细胞作为对照组。 1. 2. 3  细胞计数  取加载后的各组细胞 ,胰蛋白酶消 化 ,离心收集细胞 ,加入 3 ml PBS ,充分混匀后 ,细胞 计数 ,每组细胞计数 4 次 ,取平均值进行统计学分析。 1. 2. 4  流式细胞仪检测  取各组细胞 1 ×104 ,φ= 75 %乙醇固定过夜 , PBS 漂洗后 ,进行流式细胞仪检 测 ,检测 S 期、G1 期细胞所占的比例。 2  结  果 2. 1  PDL Fs 的培养 人 PDL Fs 原代培养的成功率约为 10 %。倒置显 微镜下观察 ,约 7 d 时有细胞从组织块周围游出 ,14 d 左右长满培养瓶。细胞多为长梭形 ,胞浆丰富 ,核圆 形、居中 ,有 2~3 个清晰可见的核仁。 2. 2  细胞计数结果 图 1  各加力时间点细胞计数结果   结果表明 ,加载 24 h 时 ,加力组细胞数开始高于 对照组 ,但无显著性差异 ( P > 0. 05) 。加载 48 h、96 h 时 ,加力组细胞数明显高于对照组 ( P < 0. 05) 。 2. 3  流式细胞仪检测结果  表 1  各组细胞中 S期、G1 期细胞所占的比例    ( %) 加力组 24 h 48 h 96 h 对照组 24 h 48 h 96 h S期细胞比例 9. 7 7. 9 5. 9 4. 3 3. 6 2. 3 G1 期细胞比例 86. 6 87. 2 90. 7 91. 5 93. 3 94. 9   表中显示加力组在各实验时间点 S 期细胞比例均 明显高于对照组 ,而 G1 期细胞比例则均明显低于对 照组。 3  讨  论 目前国际上所采用的细胞加载装置主要有 : Flex2 ercell 细胞加载系统、Petriperm 弹性膜细胞加载系统、 离心力、流体剪切力及双极细胞拉伸力等[1 ,2 ] ,所有的 这些装置都各有其优缺点。本装置采用 PC 兼容机来 控制加载的拉伸及松弛时间 ,具有方便、精确的特点。 加之使用压力感受器 ,能够准确地控制压力值的大小 , 因此机械力的作用准确可靠 ,可以对不同力值作用下 细胞的变化特点进行研究。拉伸及松弛的时间可调 , 实验过程中可根据需要设定 ,因此可以满足我们实验 的需要。 对细胞生物学多种指标的检测可能受多种因素的 影响 ,因而学者们对机械应力作用下细胞增殖状态的 研究结果也不尽一致。Yang 等[3 ]研究了机械应力作 用下鼠髁突软骨细胞的增殖反应 ,结果发现 :在给定的 力值大小与时间范围内 ,随着应力值的增加 ,促进软骨 细胞增殖 ,并在施力 6 h 时达到最大 ,在持续应力作用 24 h 后细胞增殖减弱。Li 等[4 ]用3 H - 嘧啶方法观察 了在对血管平滑肌细胞施加间歇力时 ,随着力值增加 , 细胞增殖增加 1. 4~1. 6 倍。而 Yamaguchi[5 ]的研究 发现 ,对牙周膜细胞分别施加 9 %、12 %、15 %、18 %、 21 %、24 %的间歇力时 ,细胞的增殖与对照组无明显差 别。这可能是与所采用的模型、力的施加方式以及力 值的差异有关。在本实验中 ,细胞计数结果显示在机 械牵张力作用 48 h 时 ,开始对细胞在数量上的增加有 明显的促进作用。 细胞的增殖是指细胞在数量上的增加 ,真核细胞 的增殖是通过有丝分裂实现的 ,细胞周期是单个真核 细胞生长和分裂成子细胞的过程 ,由分裂期 (M 期) 及 间期 ( G1、S、G2 期) 组成 , G1 期是 DNA 合成前期 ,为 下一次分裂合成 DNA 所需的前体物质、能量和酶类 ; S 期是 DNA 合成期 ,DNA 复制增加一倍 ,合成组蛋 白 ,进行中心粒复制 ;通过流式细胞仪可以检测处于不 同周期内细胞数的多少。本实验发现 ,在不同时间点 , 加力组处于 S 期 ,即 DNA 合成期的细胞比例均明显 高于对照组 ,提示机械牵张力可能促进细胞从 G1 期 向 S 其转化 ,从而促进细胞在数量上的增加。 结论 :本实验的结果提示 ,在对培养的人 PDL Fs 施加频率为 6 次/ min、幅度 12 %的牵张力时 ,对细胞 的增殖起一定的促进作用。 ·313·实用口腔医学杂志 (J Pract Stomatol) 2003 J ul ,19 (4) © 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 参考文献 1 Ziambaras K , Lecanda F , Steinberg TH , et al . Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J Bone Miner Res , 1998 ,13(2) :218 2 Saito M , Saito S , Ngan PW , et al . Interleukin 1 beta and prostaglandin E are involved in the response of periodontal cells to mechanical stress in vivo and in vit ro. Am J Orthod Dento2 facial Orthop , 1991 ,99 (3) :226 3 Yang H , Luo S. Mechanical stress regulation and proliferation of rat mandibular condylar chondrocytes in vit ro. Chin J Dent Res , 1999 ,2 (2) :54 4 Li Q , Muragaki Y , Ueno H , et al . Stretch2induces prolifera2 tion of cultured vascular smooth muscle cells and a possible in2 volvement of local renin2angiotensin system and platelet2derived growth factor. Hypertens Res , 1997 ,20(3) :217 5 Yamaguchi M , Shimizu N , Shibata Y , et al . Effects of differ2 ent magnitudes of tension2force on alkaline phosphatase activity in periodontal ligament cells. J Dent Res , 1996 ,75(3) :889 (收稿 :2002206214 修回 :2002208205) 纯钛铸造支架在中空式义齿中的应用 贾二曼  常青  赵铱民 (第四军医大学口腔医院技工中心)   当上颌骨一侧由于肿瘤切除、外伤等原因造成缺损后 ,缺 损空间较大 ,手术后均需采取中空式义齿修复 ,以恢复患者的 外形及部分咀嚼功能。纯钛由于其具有良好的生物相容性 ,重 量轻、强度高等优点 ,被应用于中空式义齿修复。我们于 1998 年开始将其用于临床 ,不仅克服了塑料基托易吸水 ,产生异味 以及强度低的缺点 ,也克服了钴铬合金铸造支架的重量问题 , 极大地提高了修复体的修复效果 ,是一种比较理想的修复形 式。其具体制作形式分为一段式 ,两段式及三段式 3 种 ,现分 别介绍如下。 1  一段式钛支架 一段式钛支架是在未被切除 (即健侧) 部分用纯钛铸造基 托来取代塑料基托 ,而非健侧仍使用塑料成型。其支架在设计 及制作时应注意充分体现铸造支架的优点 ,一是应尽量使支架 在余留牙的龈组织部分充分让开 ,以使其获得良好的生理自洁 功能 ;二是铸造基托的边缘应做成移行 ,以保证食物的流通及 舒适 ;三是与各个卡环连接的小连接体在保证强度的要求之 下 ,应形成流线型 ,使之不会存留食物 ;四是与非健侧 (即需中 空的一侧)的塑料连接部位设计应合理 ,以保证与之相连接的 塑料 (或钛基托盖板) 形成自然的连接 ,不形成凹陷或突起 ,提 高义齿使用的舒适度。由于颌骨缺损修复时多是一侧无余留 牙 ,其主要固位力来自于健侧的余留牙 ,因此在固位设计上 ,应 尽可能多的设置基牙 ,充分发挥余留牙的作用 ,不使某一基牙 或一组基牙受力过大 ,形成余留牙的组牙功能 ,使义齿获得合 理的固位力。 2  两段式钛支架 两段式钛支架是指除了健侧部分制作钛支架之外 ,凹陷部 分也使用纯钛来铸造 ,从而更进一步减轻了中空式义齿的重 量。之所以采用二段式铸造 ,是由于现有的牙科铸钛机其熔金 量有限 ,加之铸型的最大尺寸限制 ,颌骨缺损后所形成的空间 面积较大 ,因而无法达到一次铸造完成所致。采取两段式铸钛 支架时应注意的问题是 : (1)确保印模及模型的准确性 ,由于钛 支架的厚度只有约 0. 5 mm ,不能进行较多的磨改修整 ,若一旦 印模不准 ,则易造成失败。同时缺损部位倒凹部分填补应合 理 ,在不妨碍义齿就位的前提下 ,可适当保留部分软组织倒凹 , 以增加义齿的固位力 ; (2) 凹陷部位的钛基托除了与健侧相连 接部位形成利于塑料连接的装置外 ,还需将其它的边缘也形成 与塑料相连接装置。为使其两部分连接的强度确实得以保证 , 除了考虑塑料的连接之外 ,最好使用激光焊接的方式给予加 强。两段式钛支架可以采取同时分别铸造完成 ,亦可采取先将 健侧部分铸造、打磨完成以后 ,再行凹陷部分铸造。 3  三段式钛支架 三段式钛支架是指除了健侧部分及凹陷部分制作成纯钛 基托之外 ,将中空部位的上部盖板也使用纯钛铸造完成 ,此方 法比两段式更进一步减轻了中空义齿的重量。其制作方法是 先将健侧部分及凹陷部分分别铸造完成以后 ,正确复位于工作 模型上 ,使用激光焊接技术将健侧及凹陷两段焊接起来后 ,再 将其四周与塑料连接的网眼用蜡填补起来 ,在凹陷部位用石膏 加以填充 ,恢复其高度。然后采用复制模型的方法 ,将用石膏 填充起来的凹陷部分复制成钛铸造用耐火材料模型 ,再在该模 型上制作熔模 ,经铸造 ,研磨完成后 ,形成中空式上部盖板。将 之复位于工作模型上 ,经排牙 ,制作蜡型 ,充填塑料后 ,形成一 个中空式三段式铸钛支架修复体 ,而其中的石膏填充物 ,利用 两次热聚合法时去除。采用三段式铸钛基托时 ,除了健侧部分 及凹陷部分按照二段式钛支架的制作要求之外 ,其盖板的四周 亦要求形成与塑料相连接装置。同时注意盖板的位置、表面突 度 ,表面形态要与健侧一致 ,使其获得良好的审美性及舒适性。 采用上述介绍的三种方法 ,我们先后为 94 名上颌骨缺损 患者制作了中空式义齿 ,均取得较为满意的修复效果 ,不仅最 大限度的降低了中空式义齿的重量 ,也使修复体的舒适度得以 提高 ,改善了患者的口腔卫生状况 ,扩展了钛在口腔修复领域 中的应用。 (收稿 :2003202212) ·413· 实用口腔医学杂志 (J Pract Stomatol) 2003 J ul ,19 (4) © 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. 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