NO对大鼠心肌缺血预处理的影响和再缺血预处理中的作用03

一．实验名称：NO对大鼠心肌缺血-再灌注的影响和缺血预处理中的作用 二．实验目的：学习心脏缺血再灌注模型的建立 探究NO对心脏缺血-再灌注损伤（IRI）的影响及其在缺血预处理（IP）保护机制中的作用 三．实验原理：缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）的发生机制尚未完全阐明，近些年来，国内外学者对NO的研究较多，NO是一种具有很多生物活性的小分子物质，参与许多病理和生理过程，其中涉及缺血再灌注损伤。缺血预处理（ischemic preconditioning，IP）可明显减轻之后的缺血-再灌注损伤，但机制也尚未明确，已知在缺血预处理中会释放一些内源性保护介质：腺苷，缓激肽，乙酰胆碱等，三者均可促进内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)诱导NO的合成，提示NO可能参与了缺血预处理，但机制未明。目前，多数研究认为，缺血-再灌注的损伤与NO的生成减少有关，NO对心肌再灌注有保护作用；但另有研究发现，给予一氧化氮合酶抑制剂（NOS）,如：L-NAME等,来减少NO的生成，并未使再灌注损伤加重，甚至改善心脏功能。 为进一步阐明NO的作用，我们并进行此项实验。 四．实验材料： 1.实验对象：健康雄性大鼠12只，体重250±20g 2.实验器材和药品：计算机生物信号采集处理系统BL-420F、压力换能器、心电电极输入线、HS-300动物呼吸机、心脏导管（聚乙烯导管，长10cm、直径0.5-0.8mm）、小动物手术台、哺乳类动物手术器械（开胸器、外科手术剪、手术钳等）、 三通管、动脉夹、铁支架、 注射器（1 ml，2 ml，5ml）、20%乌拉坦、0.3%肝素生理盐水、生理盐水、L-精氨酸、L-NAME、手术结扎线，充气乳胶管等 五．实验方法： 1.大鼠称重， 20%乌拉坦（5ml/kg）进行腹腔注射麻醉，固定，剪去手术区域体毛，以0.3%肝素股静脉注入作抗凝处理。 2. 颈部正中切口，游离右侧总动脉及气管，分别在下方穿线备用，分离右侧颈总脉1～1.5厘米，近心端用动脉夹夹闭，远心端用线扎牢，在结扎处稍下剪一斜口，向心脏方向插入带三通管的心脏导管（导管内预先充满肝素溶液），导管尾端与压力换能器相接并连于计算机信号处理系统相应通道的输入插口，用线将导管与动脉结扎，缓慢放开动脉夹，观察动脉血压。随后将导管缓慢推入左心室，注意观察压力变化情况。压力传感器接1通道，观察心室内压的变化，各项心功能指标。 3.气管插管，接入呼吸机，进行人工呼吸。 4. ？连接心电图机，（连在哪里的？）选用肢体导联。对大鼠进行心电图，记录导联心电图30s。（如有异常者，弃之。）心电信号接BL420-F计算机信号处理系统2通道，记录心电图变化 5．打开胸腔，并固定。充分暴露心脏及其表面的血管，剪开心包膜，结扎冠状动脉前降支，结扎之前在预结扎的冠状动脉前降支处放置一根约长0.5cm、直径1.5mm的乳胶管，打一个活结结扎，以备进行反复多次缺血再灌实验。 或者经左颈总动脉插管至左心室，接压力换能器测试内压，开胸选取冠脉左前降支起始端，以7-0无创伤缝合针线进行结扎，打一活结，拉紧丝线造成缺血状态，松开丝线可恢复再灌注。 6.术毕稳定20min。随机分入各组进行实验。 7．将12只大鼠分成6组，每组两只，分别为 ①IR组 ②IR+L-精氨酸组 ③IR+L-NAME组 ④IP组 ⑤IP+L-精氨酸组 ⑥IP+L-NAME组 8.分别于缺血前25min和10min两次给予①、②、③组生理盐水1ml、L-arg300mg/kg、L-NAME13mg/kg，再进行30min缺血和1h再灌注。 9.以两次5min缺血+10min再灌注作为缺血预处理，其中：每次的10min再灌注前按步骤8给予相应组生理盐水，L-arg和L-NAME，再进行30min缺血和1h再灌注。 10．观测指标：心率、血压、左心室内压（LVSP）、左心室舒张末期压力（LVEDP）、心室内压最大变化速率（±dp/dtmax） 六．实验结果 心率 BP LVEP LVEDP ±dp/dtmax 1​  2​  3​  4​  5​  6​  七．统计学分析 所有数据均以均数±标准差表示 组间比较利用单因素方差分析 两两比较用t检验 八．预期结果 L- arg组和L- NAME组均明显减轻了IR引起的损伤。缺血预处理前给予NO前体L- arg增加NO生成或使用L- NAME阻断NO生成对缺血预处理保护作用无明显影响。 九．的问题： 1.IR+L- arg组，缺血再灌前给予L-精氨酸可增加内源性NO生成可对心肌缺血再灌注发挥保护作用； 2.IR+L- NAME组，缺血再灌前给予L-NAME可能通过减少NO来减少再灌注时其ONOO-的生成，因而减轻心肌损伤和凋亡。虽然也会因NO量减少而加重损伤，但后者的影响将小于前者的保护，提示再灌时期的NO对心脏是不利的。 3.IP所有组因有缺血预处理而之间变化不大，提示NO可能没有参与缺血前处理，NO对心脏的保护可能与缺血预处理关系不大。