西方马脑炎

5 西方马脑炎(Western Equine Encephalomyelitis) 5 西方马脑炎(Western Equine Encephalomyelitis) 5．1 概述 本病于1930年首先发现于美国西部，并于是年10月在加利福尼亚州Merced县自一匹症状为颜面麻痹、发热、共济失调而死亡的马脑干和丘脑内分离到病毒。西方马脑炎病毒(Western Equine Encephalomyelitis virus, WEEV)是西方马脑炎的病原体，属披膜病毒科甲病毒属。 地域分布 主要分布于美国西部和墨西哥，并蔓延至亚特兰大沿海地区、加拿大、巴西、圭亚那、阿根廷、秘鲁、智利和厄瓜多尔等地区。波兰和前苏联也曾正常人中带有西方马脑炎病毒抗体，捷克是否有本病患者尚无确切证据。我国尚未发现西方马脑炎病例。 发病情况 人患西方马脑炎的潜伏期一般5-10天，但可变动在4-21天之间。 发病急，临床上可分为两期，全身症状期的临床现为发热、头痛、嗜睡和胃肠道功能障碍。在婴儿中的特点为发热和惊厥。四岁以下儿童多为发热、烦躁和头痛。较大儿童和成人的症状和体征相似。绝大多数病人的病情不再发展，数日内完全恢复。仅少数病人病情继续恶化进入脑炎期，出现高热39-40℃及中枢神经系统症状，表现为剧烈头痛、尤以枕部为最，失眠、昏睡、肌肉疼痛、言语失常、运动失调、畏光、眼球震颤、视力紊乱、眩晕、颈背强直抽搐、昏迷等，一般持续7-10天，严重病例多死于3-5日，病死率最高可达10%，痊愈后大部分病人无后遗症。由于在婴幼儿患者中常出现脑损害，所以后遗症以婴幼儿为多见，以智力低下，行为失常为主。 病原体 属披膜科甲病毒属。圆形颗粒，有囊膜，直径40nm。在pH6.5-8.5时最稳定，在低于pH6.5的更酸的悬液中感染力迅速消失。耐热60-70℃ 10分钟，对紫外线、甲醛、乙醚、氯仿和去氧胆酸钠敏感，室温下不稳定，可在-70℃保存。 本病毒有血凝素，病毒抗原凝集红细胞的pH范围为5.9-6.8,最适pH为6.3，温度范围为22-37℃，最适温度为37℃。 该病毒对小白鼠、雏鸡、鸡胚、豚鼠、鸟和细胞均很敏感，在原代鸡胚、鸭胚细胞以及地鼠肾、猴肾等原代细胞或传代细胞系HeLa细胞中产生细胞病变和蚀斑；在白蚊伊蚊、环跗库蚊细胞系亦产生蚀斑，但无细胞病变。XL-2细胞系（来自蟾蜍）感染西方马脑炎病毒后24小时能出现明显的细胞病变，亦能产生小蚀斑（0.5-1mm）。 传播媒介 西方马脑炎病毒在自然界传播中主要依靠蚊虫媒介。在美国及加拿大西部，主要传播媒介为环跗库蚊（Culex tarsalis），是鸟间、鸟与马、人与人之间的主要传播媒介；背点伊蚊（Aedes dorsalis）及黑斑伊蚊在流行季节数量多，可能在本病暴发后在马间传播起辅助作用；在美国东部无环跗库蚊，黑尾赛蚊是其主要的媒介蚊虫；实验证实埃及伊蚊、刺扰伊蚊、白纹伊蚊、致倦库蚊也可感染西方马脑炎病毒。 传染源 实验室和现场研究的大量资料表明，野鸟是该病毒的主要贮存宿主。已证实有20种鸟及6种哺乳动物携带病毒，从75种以上的野鸟及多数家禽、家畜中发现抗体。 马感染病毒后属低病毒血症，可认为是终末宿主。爬虫类对该病毒易感，病毒亦可在蛇体内越冬。蛇类和蚊虫带病毒越冬是该病毒在冬季的活存方式。 传播途径 西方马脑炎主要通过蚊传播。其传播环如下图。 流行特征 流行有严格的季节性，主要发生于夏秋。流行期为6-10月，7月份为发病高峰。患者主要为乡村居民及野外工作者，男多于女。病人中半数为10岁以下儿童。 5．2西方马脑炎病毒的检测（包括标本的采集处理，病原体的分离培养，免疫学、分子生物学检测的具体方法、步骤，技术细节、注意事项等。） 5．2．1病毒分离 取早期患者血液、脑脊液及死者脑组织、蚊等标本分离病毒。标本应无菌采集，必要时加入含抗生素的保护液，标本采集后应低温保存，尽快送检。 动物接种：常采用1-3日龄乳鼠脑内或腹腔接种。小鼠发病濒死前取脑组织低温保存、鉴定。 细胞培养：原代鸡胚成纤维细胞、地鼠肾细胞、传代HeLa、BHK-21、Vero、C6/36蚊细胞等对西方马脑炎病毒均敏感。选择生长良好的敏感细胞单层，弃培养液后用生理盐水洗涤，接种培养液1/10量的标本，37℃吸附30min，弃去接种液，加入维持液37℃培养每天观察，一般于2~3日内出现细胞病变。 获得病毒后，可用特异的单克隆抗体进行中和试验鉴定，中和指数在102以上可认为是阳性。 4．2．2血清学检测 采取病人发病急性期和恢复期血清进行特异性抗体检测，抗体升高4倍或4倍以上具有诊断意义。 近年来多采用免疫荧光法（IFA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测特异性抗体IgM、IgG。 免疫荧光检测（以间接法检测人血清特异性抗体IgG为例）： 将WEEV感染的细胞消化、滴片、晾干后冷丙酮固定制备成抗原片，收集病人血清倍比稀释，滴加于WEEV感染的抗原片，于37℃孵育30min，用PBS洗3次，晾干后加的IFTC标记的羊抗人IgG，37℃反应30min，PBS洗片3次。以正常人血清为阴性对照，荧光显微镜观察结果。 ELISA（以间接法检测人血清特异性抗体IgG为例）： 将纯化的WEEV培养物适当稀释，包被ELISA板，4℃过夜，2%酪蛋白封闭，加入适当病人血清，37℃反应30min，PBST(PBS+0.05%Tween-20)洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，37℃30min，PBST洗涤，TMB(四甲基联苯胺)显色，2mmol/L硫酸终止反应。同时设立正常人血清的阴性对照和PBS空白对照，酶联仪检测A450。 5．2．3分子生物学检测 西方马脑炎病毒是正链RNA病毒，检测标本中的RNA已广泛应用于病毒的检测。采用标准RT-PCR法、TaqMan法和NASBA法扩增标本中的核酸分子。 RNA分离： 收集蚊的PBS匀浆或病毒感染的细胞培养上清，采用QIAGEN公司的QIAamp病毒RNA分离试剂盒分离标本中的RNA，分装后-70℃冻存或直接用于核酸扩增。 标准RT-PCR法： cDNA合成： 于RNase-free的PCR管中加入5μl RNA合成cDNA。逆转录反应产物直接用于PCR扩增或分装后于-20℃保存。 PCR扩增： RT-PCR引物如下： WEE5100：GTTTGGCGGCGTCTCGTTCTCTA（5100–5122） WEE5437c：TCCGTGGTGCTGGTACTGGTCTGT（5437–5414） 扩增产物大小为338bp。 PCR扩增采用50μl体系。具体操作参见罗氏公司的Tian one-tube RT-PCR试剂盒。反应参数：94℃预变性3min，再于94℃30s；55℃1min；68℃3min扩增45个循环，最后于72℃延伸7min。琼脂糖DNA凝胶电泳分析PCR产物。 NASBA法： NASBA法的引物如下： WEE9336：gatgcaaggtcgcatatgagCGAGCAGACGCAACAGCAGAA（9336–9356） WEE9566C：aattctaatacgactcactatagggagaaggCAGGATAGCAAGAGCGACACCA（9566–9545） WEE9390probe： GTGGGGCGAGAAGGGCTGGAGTACG（9390–9414） 扩增产物大小为233bp。 具体操作参见bioMerieux公司的NucliSens basic试剂盒。 TaqMan法： TaqMan法的引物： WEE10248：CTGAAAGTCGGCCTGCGTAT（10248–10267） WEE10314c：CGCCATTGACGAACGTATCC（10314–10295） WEE10271probe：ATACGGCAATACCACCGCGCACC（10271–10293） 扩增产物大小为67bp。 具体操作参见PE公司的TaqMan RT-PCR ready mix试剂盒。 核酸扩增法检测病毒与传统的病毒培养相比，更快速、高通量，但应注意在具体操作时严格设立包括RNA分离和核酸扩增阶段的阴性对照，以免造成假阳性结果。 参考文献 1.自登云.虫媒病毒与虫媒病毒病[M].昆明:云南科学技术出版社,1995,128-142. 2.Linssen B , Kinney RM, Aguilar P , et al . Development of reverse transcription- PCR assays specific for detection of equine encephalitis virus . J Clin Microbiol ,2000 ,38 (4) :1527 - 1535. 3.Das D, Gares SL, Nagata LP, Suresh MR. Evaluation of a Western Equine Encephalitis recombinant E1 protein for protective immunity and diagnostics. Antiviral Res,2004,64(2):85-92. 4.Nasci RS, Gottfried KL, urkhalter KL. Sensitivity of the VecTest antigen assay for eastern equine encephalitis and western equine encephalitis viruses. .J Am Mosq Control Assoc. 2003,19(4):440-444. 5.Lambert AJ, Martin DA, Lanciotti RS. Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays. J Clin Microbiol,2003,,41(1):379-385.