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肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对佐剂性关节炎大鼠滑膜中TNF-α、HIF-1α和VEGF表达的影响

2011-05-13 4页 pdf 376KB 37阅读

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肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对佐剂性关节炎大鼠滑膜中TNF-α、HIF-1α和VEGF表达的影响 亘 医药 0年 9月 第 32卷 第 l8期 Hebei Medical Journal,2010,Vol 32 Seo No.18 肿瘤坏死因子受体.抗体融合蛋白对佐剂性关节炎 大鼠滑膜中 TNF—oL、HIF—l oL和 VEGF表达的影响 徐育冬 靳洪涛 宋新梅 张绍君 【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子受体.抗体融合蛋白(益赛普)对佐剂性关节炎大鼠滑膜中肿瘤坏 死因子一 (TNF-ot)、缺氧诱导因子一1ot(HIF—lot)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法 将成年雄 性 Wistar大鼠...
肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对佐剂性关节炎大鼠滑膜中TNF-α、HIF-1α和VEGF表达的影响
亘 医药 0年 9月 第 32卷 第 l8期 Hebei Medical Journal,2010,Vol 32 Seo No.18 肿瘤坏死因子受体.抗体融合蛋白对佐剂性关节炎 大鼠滑膜中 TNF—oL、HIF—l oL和 VEGF表达的影响 徐育冬 靳洪涛 宋新梅 张绍君 【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子受体.抗体融合蛋白(益赛普)对佐剂性关节炎大鼠滑膜中肿瘤坏 死因子一 (TNF-ot)、缺氧诱导因子一1ot(HIF—lot)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法 将成年雄 性 Wistar大鼠随机分为5组,Ⅱ~V组建立佐剂性关节炎大鼠(AA)模型,于造模后第 l2天开始Ⅲ组给予 甲氨喋呤灌胃治疗,Ⅳ一V组给予益赛普皮下注射治疗。第28天取膝关节滑膜,常规 HE染色,计算滑膜 病理积分,免疫组织化学染色检测 TNF—ot、HIF—lot和 VEGF在膝关节滑膜的表达。结果 I组大鼠滑膜组 织均有少量 TNF.of.、HIF.1ot和 VEGF的表达,Ⅱ~V组较 I组均明显增高。Ⅳ、V组滑膜组织 TNF一 表达 较Ⅱ组明显减低(P <0.01)而Ⅲ组与 Ⅱ组差异无统计学意义。Ⅲ~V组滑膜组织 HIF-1d、VEGF的表达 均明显低于Ⅱ组,差异有统计学意义(P<0.O1)。结论 益赛普可明显降低 AA大鼠滑膜组织 TNF一 、 HIF.1ot和 VEGF表达。益赛普可以降低 AA大鼠的关节炎指数、足体积,减轻足肿胀程度,对 AA大鼠的关 节炎症有明显的治疗作用。 【关键词】 佐剂性关节炎;大鼠;可溶性重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白;肿瘤坏死因子一 ; 缺氧诱导因子.1 0【;血管内皮生长因子 【中图分类号】 R 593.22 【文献标识码】 A 【文章编号】 1002—7386(2010)18—2475—04 The effect of rhn-TNFR-Fc on the levels of TNF- .HIF-1 and VEGF in synovium of adjuvant arthritis in rats XU Y~tong’ JlN Hongtao SONG Xinmei.et a1. Department ofRheumatology The Second Hospital of Hebei Medical Unwemi@,Sh~iazhuang 050000,China 【Abstract】 Objective To investigate the changes of levels of TNF一0【,HIF一1 and VEGF in in synovium of adjuvant arthritis(AA)in rats after injection with rhu.TNFR-Fc(etanercept).Methods The aduh male Wistar rats were randomly divided into 5 groups:the AA model was induced with Freund complete adjuvant,on the 12th day after induction,the rats in group II1 were given with MTX(2.7 mg/kg)by intragastric administration;the rats in group 1V,V were舀ven with etanercept by subcutaneous injection.The arthral pathological score was calculated.the levels of TNF.n.HIF一1 ot and VEGF were detected by histoimmunochemical staining at different stages after CFA inoculation.Results The TNF—d.HIF一1 of.and VEGF levels in experimental group were higher than that in control group.The levels of TNF一 in group IV ,V were significantly lower than those in group Ⅱ, however.there was no significant difference between group Ⅲ and group II.The levels of HIF一1 0【and VEGF in group llI,IV,Vwere significantly lower than those in groupⅡ(P<0.05).Conclusion Etanercept is able to reduce sign ificantly the levels of TNF一0【,HIF-l ot and VEGF in synovium tissue of rats with AA,and which is able to decrease arthritis indexes and foot volume,as a result,which is effective in treating adjuvant arthritis of rats. 【Key words】 adjuvant arthritis rat;rhu-TNFR—Fc;tumor necrosis factor— ;hypoxia—inducible factor—l ot; vascular endothelial growth factor 类风湿关节炎 (rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性进行 性 自身免疫性疾病,以关节滑膜炎,对称性和破坏性关节病变 为主要特征⋯。血管新生促进滑膜血管翳的发生和发展,维持 血管翳的侵袭性,促进软骨和骨破坏及关节重构,最终造成关 节畸形、强直和功能丧失。缺氧诱导因子一1(HIF一1)、血管内皮 作者单位:050000 石家庄市,河北医科大学第二医院免疫风湿科 (徐育冬、靳洪涛、张绍君);华北石油总医院肾内科(宋新梅) 通讯作者:靳洪涛,050000 河北医科大学第二医院免疫风湿科; E-mail:hongtaojin@yahoo.tom.cn 2475 · 论 著 · 生长因子(VEGF)是促进血管新生的关键因子 ,可能在 RA发 病机制中起重要作用。在细胞因子相互作用 的网络中肿瘤坏 死因子.d(TNF— )居于中心位置,是 RA滑膜炎发生和持续的 一 个关键性因子 ]。本试验 以佐剂诱导的关节炎大鼠模型为 基础,观察肿瘤坏死因子受体一抗体融合蛋 白(益赛普)对关节 炎的影响,评价其疗效,探讨益赛普治疗 RA的机制、临床应用 价值及其对滑膜组织血管增生的抑制情况。 1 材料与方法 1.1 动物与试剂 Wistar大鼠 90只,雄性,体重 140~160 g, 由河北省实验 动物 中心提供,合 格证号 802120,许 可证 号 2476 2010年 9月 第 32卷 第 18期 Hebei Medical Journal,2010,Vol 32 Sep No.18 SCXK(冀)2003—1-003。 完全弗 氏佐剂 (FCA,10 m1)购于 Sigma公 司,卡介 苗 (BCG,50 mr,/支)购自华瑞创新生物科技开发中心。TNF— 免 疫组化试剂盒购自武汉博士德生物制品公司,VEGF免疫组化 成套试剂盒购 自晶美生物制品公司。 1.2 分组及 AA大鼠模型的建立 将90只雄性 Wistar大鼠采 用数字表法随机分为 5组 ,分别编号 I~V组,I组 10只,Ⅱ 一 V组每组 20只。 I组为正常对照组,Ⅱ组为单纯造模组 ,Ⅲ 组为造模 +甲氨喋 呤组,Ⅳ组 为造模 +益赛 普低剂量 组 (0.44 mg/kg),V组为造模 +益赛普高剂量组 (0.88 ms/kg)。 将 FCA与卡介苗配置为含BCG 10 mg/ml的水包油乳剂。试验 第 1天在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V组大鼠的尾根部皮内注射该乳剂 0.2 ml 致炎,诱发佐剂性关节炎。而 I组大鼠的尾根部皮内注射等量 0.9%氯化钠溶液。 1.3 给药 于致炎后第 12~23天Ⅳ、V组皮下注射益赛普,Ⅳ 组予 以 益 赛 普 0.44 mg·kg~ ·d~,V组 予 以 益 赛 普 0.88 mg·kg~·d~。给药容积均为 0.1 ml/100 g,连续12 d。 Ⅲ组大鼠给予甲氨喋呤2.7 mg/kg灌胃,Ⅱ组大鼠给予蒸馏水灌 胃0.5『n1·只~·d~;给药时间均固定在每天上午9:()o。 1.4 测量足体积及关节炎指数(AI)的评定 于实验的第 0、 3⋯6 9 12、15、18、21、24、27天用排水法测右足体积,分别测量 3 次 ,取平均值。根据关节红肿程度进行 AI的评定, 如 下:0分:无关节炎;1分:个别足趾发红、肿胀 ;2分 :大部分足趾 及足底肿胀;3分:踝关节以下肿胀;4分:肿胀累及踝关节以 上,不能负重;AI=四肢关节评分之和。 1.5 病理学及免疫组织化学检测 于致炎后第 28天,处死所 有大鼠并取膝关节滑膜组织,置于 4%多聚甲醛固定液中固定, 以备作病理及免疫组织化学检测。常规 HE染色并计算滑膜 病理积分,按照程度不同分别评分 :0分:正常;1分:极少炎 性细胞浸润或(和)组织轻微水肿;2分:轻微浸润;3分:中等浸 润;4分:明显浸润;5分 :严重浸润。免疫组化检测用 SABC (链霉亲和素生物素酶复合物)法,TNF— 、HIF一1 和 VEGF阳 性滑膜细胞均呈颗粒状棕黄色或棕褐色。采用真彩色图像分 析系统对 TNF- 、HIF.1O/.和 VEGF表达强度进行定量。方 法 如下:每张切片随机选取 5个视野(×200),系统自动测量 出阳性染色部傅的积分光密度(IOD),5个视野的平均IOD值 代表该切片 TNF. 、HIF 1OL和 VEGF的表达情况。 1.6 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件,计量资料以面4-s 表示 ,采用单因素方差分析 ,相关性采用直线相关分析 ,P < 0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 11~V组大鼠造模后共有 38只于第 l5—19天先后出现 关节红、肿等关节炎表现,给药期间 Ⅱ组死亡 1只,Ⅲ、Ⅳ组各 有 1只受伤,剔出死亡、受伤及造模不成功的大鼠后,最终人选 实验统计结果的实验动物共计 45只,I、Ⅱ组各 10只,Ⅲ、Ⅳ 组各 9只,V组7只。 2.2 AI值及足体积的测定 I组大鼠无足爪肿胀 ,各时间点 AI值均为0分,Ⅱ~V组大鼠 AI值均高于 I组 ,差异有统计学 意义(P<0.05)。造模后第 21~27天V组大 鼠的 AI值明显 低于 Ⅱ组,差异有统计学意义(P<0.05),而Ⅲ、Ⅳ组 AI值虽 然均低于 Ⅱ组但差异无统计学意义(P >0.05)。Ⅲ、Ⅳ、V组 两两之间在各时间点 AI值差异无统计学意义(P>0.05)。见 表 1。 表 l 4组大鼠在不同时间段 AI值比较 注:与 Ⅱ组比较 , P<0 05, <0.01 2.3 各组不同时间段右足体积比较 试验前 5组大鼠之间右 足体积差异无统计学意义(P>0.05)。 Ⅱ一V组大鼠右足体 积于造模后第 15天开始明显增高,与 I组比较,Ⅱ组于造模后 第 15天足肿胀程度明显增高(P <0.05或 <0.01);Ⅲ~V组 于造模后第 18天足爪肿胀程度明显增高(P<0.05),并于第 21~24天逐渐达肿胀高峰,除Ⅳ组外,Ⅲ、V组于第 27天足肿 胀程度均略好转,但与 I组比较差异仍有统计学意义(P< 0.05)。与Ⅱ组比较,Ⅲ组虽然足肿胀程度低但差异无统计学 意 义(P>0.05),Ⅳ组于第 2l~24天足体积明显低于 Ⅱ组(尸 <0.05),但第 27天与差异无统计学意义 (P >0.05);V组于 第 21~27天足体积均明显低于Ⅱ组(P<0.05)。V组于给药 12 d后足体积明显低于Ⅲ组(P <0.05);III组与Ⅳ组、Ⅳ组与 V组差异均无统计学意义(P >0.05)。见表 2。 表2 5组大鼠不同时间段右足体积比较 .i 注:与 I组比较. P<0.05,苷P<0.01;与n组比较,△.p<0.05:与Ⅲ组比较,~rp<0 05 2.4 大鼠滑膜病理学改变及病理学评分 I组正常大鼠滑膜 衬里层有 1~2层滑膜细胞组成 ,且部分不连续。滑膜衬里层 下层为由脂肪细胞、少量成纤维细胞 、巨噬细胞和少量血管组 成的结缔组织。滑膜组织无炎性细胞浸润,无纤维组织增生。 Ⅱ组可见滑膜组织中等量淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞浸 润,平均病理积分3.8 4-0.4,滑膜衬里层增生达 4—6层。Ⅲ 一 V组滑膜组织病理积分均明显低于 Ⅱ组,差异有统计学差异 (P<0.01);V组滑膜组织病理积分低于Ⅲ组(P<0.05);IV 组滑膜组织病理积分与Ⅲ、V组之间差异无统计学意义(P> 0.05)。见表 3。 医药20 Q生9月 第 32卷 第 18期 Hebei Medical Jouma1,2010。Vo1 32 Sep No.18 表 3 大鼠膝关节滑膜病理学积分 积分 I组 (n :10) Ⅱ组 (n =10) Ⅲ组 (n=9) Ⅳ组 (n=9) V组 (n=7) 注 :与 Ⅲ组 比较 , P <0.05;与 Ⅱ组 比较 , <0.O1 2.5 滑膜组织 TNF一0【、HIF—l 和 VEGF的表达 I组大 鼠滑 膜组织有少量 TNF一0【、HIF-1 和 VEGF的表达。与 I组 比较, Ⅱ~V组均明显增高 (P <0.01)。与 Ⅱ组 比较 ,Ⅳ、V组滑膜 组织 TNF—o【表达明显减低,差异有统计学意义(P <0.01);Ⅲ 组 TNF一 表达虽低于 Ⅱ组,但差异无统计学意义(P >0.05); Ⅲ一V组滑膜组织 HIF一1 0【、VEGF的表达均明显低于 Ⅱ组 (P <0.01)。1V、V组滑膜组织TNF.仅表达低于Ⅲ组(P <0.05), V组滑膜组织 TNF— 表达低于Ⅳ组(P<0.05)。lU、1V组滑膜 组织 HIF一1 、VEGF的表达均高于V组 (P <0.05);Ⅲ与Ⅳ组 之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表 4、图 1~8。 表4 5组大鼠膝关节滑膜组织 TNF.d、HIF一1 和 VEGF IOD值比较 / m2 , 面 ± s 注:与 I组 比较, P <0.0l;与 Ⅱ组比较, <0.01;与Ⅲ组比较, P ‘ 0.05,与Ⅳ组比较, P<0.05 2.6 滑膜病理学评分与 TNF.0【、HIF一1 0【和 VEGF表达的相关 性 滑膜组织 TNF一仅、HIF一1 和 VEGF的 IOD值分别与病理积 分成直线正相关(r=0.872,P <0.Ol;r:0.810,P <0.01;r = 0.778,P <0.01)。 3 讨 论 益赛即注射用重组人 Ⅱ型肿瘤坏死因子受体一抗体融合蛋 白,是一种可抑制 TNF一0【功能的生物制剂。目前益赛普抗炎疗 效的可能的机制包括:(1)减少炎症部位的细胞生成;(2)下调 滑膜细胞因子的表达;(3)降低血浆 MMP一1和 MMP一3的水平; (4)可调节细胞的凋亡 }。有研究结果显示 ,应用益赛普治疗 的RA患者关节炎症明显好转。HIF一1仅和 VEGF在血管新生 的病理和生理中炎症具有重要作用。HIF一1 是缺氧状态下血 管生成的核心调控因子 ,可上调 VEGF表达。研究显示 ,在体内 TNF一仪启动VEGF生成以促进血管新生,抗TNF一仅治疗可降低 VEGF生成及与 RA相关的血管新生,使增生血管复原 。抗 TNF一仅制剂,在体外培养的滑膜细胞可抑制 VEGF生成 。本 实验显示,益赛普可抑制滑膜组织 TNF一 、HIF一1d和 VEGF的 过度表达,且和足体积、关节炎指数均呈直线正相关。益赛普 治疗组滑膜组织 TNF一 的表达低于单纯造模组,而甲氨喋呤组 与单纯造模组差异无统计学意义,说明益赛普可降低滑膜组织 TNF一 的表达。益赛普治疗组滑膜组织 HIF一1 、VEGF的表达 2477 图 1 正常滑膜组 织 (HE× 图2 增生滑膜组织(HE× 400) 400) 图3 TNF—d在正常大鼠滑膜 图4 TNF— 在 AA大鼠滑 的表 达 (免疫 组 化 X 膜的表达 (免疫组化 400) ×400) 图5 VEGF在下正常大鼠滑 膜的表达 (免疫组化 X 400) 图7 HIF一1 在正常大鼠滑膜 的表 达 (免疫 组 化 × HIF一1 0【在 AA大鼠滑 膜的表达 (免疫组化 400) ×400) 均明显低于单纯造模组 ,高剂量组明显低于甲氨喋呤组,而低 剂量组与甲氨喋呤组无统计学差异。说明益赛普可以降低 AA 大鼠滑膜组织 HIF一1 0l、VEGF的表达,抑制新生血管形成 ,从而 减少血管翳的形成。益赛普治疗组大鼠滑膜组织病理积分均 明显低于单纯造模组;高剂量组明显低于甲氨喋呤组 ,而低剂 量组与甲氨喋呤组差异无统计学意义。说明益赛普可以有效 抑制或延缓 AA大鼠关节病理改变,减轻关节病变程度且成剂 量依赖性。与 甲氨喋呤治疗组比较 ,益赛普高剂量组在足体 积、AI、TNF. 、HIF一1 0【和 VEGF在滑膜的表达、滑膜病理积分均 明显降低,而低剂量组与甲氨喋呤组差异无统计学意义(P< 0.05),说明益赛普起效早于甲氨喋呤,近期效果优 于甲氨喋 呤,这可能与给药方法不同,以及 甲氨喋呤起效缓慢有关,但远 ¨ o _一 曲 如 n 8 4 3 2478 药2010年9月 第32卷 第 18期 Hebei Medicai J0竖 alj Q: ! 兰 : 墨 期疗效尚有待观察。 本实验说明:经益赛普治疗的 AA大鼠,从足肿胀程度、滑 膜 TNF. 、HIF.1ot和 VEGF水平、滑膜病理积分几方面均显著 低于未经治疗的 AA大鼠,近期疗效优于甲氨喋呤,其机制可能 与益赛普中和 TNF- ,抑制了 TNF—ot促炎因子的作用,从而间 接抑制了对血管翳形成直接造成软骨和骨破坏起主要作用的 HIF一1 、VEGF的表达有关。 参考文献 1 吴燕红.类风湿关节炎药物的新认识.河北医药,2008,30:82. 2 Tracey D,Klareskog L,Sasso EH,et a1.Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action:A comprehensive review.Pharmacology& Thera- peutics,2008,1 17:244-279. 3 Baharav E,Mor F,Halpem M,et a1.Lactobaeillus GG Bacteria Ameliorate Arthritis in Lewis Rats.J Nutr.2004.134:1964-1969. 4 张晶,左晓霞,李通,等.沙利度胺对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用及 其对炎性细胞因子的影响.中华风湿病学杂志,2005,9:656-659. 5 Peters CL,Morris CJ,Mapp PI,et a1.The Transcription Factors Hypoxia· Inducible Factor 1 d and Ets.1 Colocalize in the Hypoxic Synovium of In— flamed Joints in Adjuvant.Induced Arthritis.A~thritis Rheumm,2004,50: 291-296. 6 Baler A,Meineckel I,Gay S,et a1.Apoptosis in rheumatoid arthritis.Cuw Opin Rheumatol,2003,15:274-279. 7 Roccaro AM ,Russo F,Cimlli T,et a1.Antiangiogenesis for Rheumatoid Arthritis.Current Drug Targets-Inflammation Allergy,2005,4:27-30. 8 Agarwal A,Panda S,Misra R.Effect of etanercept on matrix metallopmtei· nases and angiogenic vascular endothelial growth factor:a time kinetic study.Ann Rheum Dis,2004,63:891-892. 9 Paleolog EM ,Young S,Stark AC,et al、Modulation of an giogenic VasCUlar endothelial growth factor by tumor necrosis factor-a and interleukin··1 in rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum,1998,41:1258-1265. (收稿13期:2010—05—08) 甲状腺乳头状癌组织中基质金属蛋 白酶一2 表达与微血管密度的关系 底旺 李清怀 张凯丽 严丽 【摘要】 目的 研究甲状腺乳头状癌组织中基质金属蛋白酶一2(MMP-2)表达及与微血管密度 (MVD)的关系。方法 应用免疫组织化学 S—P法观察90例甲状腺肿瘤(其中甲状腺腺瘤 35例,甲状腺乳 头状癌55例)石蜡包埋组织中的MMP-2、CD34表达。并在 CD34染色切片上检测 MVD。结果 在甲状腺 乳头状癌组织中MMP-2阳性表达率(67.3%)明显高于甲状腺腺瘤(28.6%),差异有统计学意义(P< 0.05)。甲状腺乳头状癌组织中的MVD的平均值(62±4)个/HP明显高于甲状腺腺瘤(45±3)个/HP,差 异有统计学意义(P<0.05)。MMP一2阳性表达组 MVD平均值(68±4)+/HP明显高于 MMP-2阴性表达 组(45±4)个/HP,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MMP一2可能通过促进甲状腺乳头状癌间质血管 生成,促进肿瘤的侵袭和转移,并可能成为判定甲状腺乳头状癌生物学行为和预后的指标。 【关键词】 甲状腺肿瘤;基质金属蛋白酶-2;微血管密度;侵袭;转移 【中图分类号】 R 736.1 【文献标识码】 A 【文章编号】 1002-7386(2010)18—2478—02 Relationship between the expression of ase-2 and mierovessel a1.Department of Gland thyroid carcinoma DI Wang,LI Qinghuai,ZHANG Kaili,et Hospital ofHebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China density in papillary Surgery,The Second 【Abstract】 Objective To investigate the expression of matrixmetalloproteinase-2(MMP-2)and its correlation with mierovessel density(MVD)in papillary thyroid carcinoma(PTC).Methods The expressions of MMP一2 and MVD were detected in 90 case of thyroid neoplasm including 35 case of thyroid adenoma and 55 case of thyroid papillary carcinoma.Results The expression of MMP-2 in PTC was significandy higher than that in thyroid adenoma(67.3% vs 28.6%,P <0.05).The average of MVD in PTC was higher than that in thyroid adenoma(P <0.05).The average of MVD was higher in MMP一2 positive group than that in MMP-2 negative group(P <0.05).Conclusion MMP一2 may promote angiogenesis and play an important role in tumor invasion and metastasis,which can be used as an important indicator to eveluate the biologic behavior and prognosis in patients with papillary thyroid carcinoma. 【Key words】 thyroid neoplasm;matrixmetalloproteinase-2;microvessel density;invasion;metastasis 作者单位:050000 石家庄市,河北医科大学第二医院腺体外科 · 论 著 · 基质金属蛋白酶(MMPs)是一组由结缔组织细胞分泌的, 参与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解的zn 依赖性
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