绿豆蛋白质提取工艺的优化

2008, Vol. 29, No. 08 食品科学 ※技术272 绿豆蛋白质提取工艺的优化 刘 咏，杨 柳 (合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009) 摘 要：以水为提取剂从绿豆粉中提取蛋白质，研究了pH值、提取温度和用水量对绿豆蛋白质提取率的影响。 通过正交试验，确定最佳提取工艺条件为：pH12、温度30℃、用水量10ml/g。该条件下豆蛋白质的提取率最高， 蛋白质含量为108.4824mg/g dw。 关键词：绿豆；蛋白质；提取工艺；优化 Optimization of Extraction Process of Protein from Mung Bean LIU Yong，YANG Liu (School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China) Abstract：Protein was extracted from mung bean by water. The effects on protein extraction rate by the factors, such as pH, temperature and addition amount of water, were studied. By the orthogonal test, the optimal conditions are determined as follows: pH 12, temperature 30 ℃ and addition amount of water 10 ml /g mung bean. The protein yield is 108.4824 mg/g dried mung bean under the optimal conditions. Key words：mung bean；protein；extraction process；optimization 中图分类号：TQ93 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)08-0272-03 收稿日期：2008-04-25 作者简介：刘咏(1968-)，女，副教授，研究方向为农产品加工与贮藏。E-mail：yongliu_68@163.com 绿豆含有丰富的蛋白质、淀粉、各种矿物质、各 种维生素和人体必需的各种氨基酸，其蛋白质含量是小 麦的2.3倍、玉米的3倍、大米的3.2倍，赖氨酸含量 是禾谷类的2～5倍[1]。 目前对绿豆的加工，大多数生产厂家都侧重于绿豆 淀粉的加工生产，而忽略绿豆蛋白的开发，只是把它 作为生产废料或牲畜饲料，造成绿豆资源浪费。另外， 绿豆蛋白具有优良的溶解性、保水性、乳化性、凝胶 性、发泡性和泡沫稳定性等功能特性，在食品加工业 的面制品、肉制品、乳制品和饮料中的应用前景十分 广阔。利用分离蛋白制成的蛋白奶、咖啡豆奶、豆奶 酪、果汁豆奶等蛋白饮料，不仅具有较高的营养价值， 而且质量优良、味道鲜美，深受广大消费者的欢迎。 1977年Thompson L U[2]首次对绿豆分离蛋白进行提 取。之后，Adsuale R N[3]对绿豆分离蛋白的营养质量 作了全面的综述。近年来，王金水等[4]对绿豆分离蛋白 的功能性质进行了初步的研究。梁丽琴等[5]研究了绿豆 分离蛋白的功能性质，对p H值、温度、离子强度、 蛋白质质量分数等因素对绿豆分离蛋白的溶解性、吸水 性、吸油性、起泡性及泡沫稳定性、乳化性、乳化 稳定性、黏度的影响作了系统研究，为绿豆分离蛋白 更好地应用于食品工业提供理论依据。 目前，国内外生产分离绿豆蛋白仍以碱提酸沉法为 主，美国和日本[6]等发达国家已开始试用超滤膜法和离 子交换法，我国也进行了这方面的研究工作。 本实验采用廉价的水作为提取剂，通过调节温度、 pH值与用水量而得到品质完整的绿豆蛋白质。该法可 以实现水提取剂的循环利用，无污水排放，避免环境 污染。 1 材料与 1.1材料、仪器与试剂 绿豆为市售，实验前烘干研磨成粉。 所用化学及生物化学试剂均为纯。 冷冻离心机、数显恒温水浴锅、电子分析天平、 电热恒温干燥箱、旋转蒸发仪、721分光光度计及高效 液相色谱仪(HPLC)。 1.2双缩脲法测定蛋白含量[7-8] 取7支试管，用移液管分别加入1mg/ml的标准牛 血清白蛋白溶液1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0ml，各 加蒸馏水至3ml，再分别加入2ml双缩尿试剂，轻轻振 荡混合均匀并在室温下(20～25℃)放置30min，于540nm 273※工艺技术 食品科学 2008, Vol. 29, No. 08 因 素 水 平 A 温度(℃) B pH值 C 用水量(ml/g) 1 20 10 8 2 30 11 9 3 40 12 10 1 L9(34)正交设计的因素水平表 Table 1 L9(34)orthogonal test design 70 60 50 40 30 20 10 0 蛋 白 质 含 量 ( m g / g d w ) pH 5 6 7 8 9 10 11 12 13 图1 pH值对绿豆蛋白提取率的影响 Fig.1 Effects of pH values on extraction rate of protein 处进行比色。以吸光度为横坐标，牛血清蛋白的含量 为纵坐标绘制标准曲线，作为定量的依据。 1.3单因素对提取绿豆蛋白质的影响 1.3.1pH值对提取蛋白质的影响 分别调节pH值至6、7、8、9、10、11、12提 取蛋白质。用电子天平准确称取(精确至0.001)1g 绿豆 粉，并置于洁净的锥形瓶中，加入7ml蒸馏水，摇匀； 在室温下，滴入氢氧化钠溶液并用酸度计溶液的p H 值，浸提1h；4000r/min转速下离心5min，将离心管 中的上清液收集于25ml容量瓶中；再用7ml水进行二次 浸提1h、离心，合并两次所得上清液、定容、混匀； 用移液管取3ml上清液注入洁净试管中，加入2ml双缩 脲试剂，摇匀；在540nm下分别测得吸光度；计算3ml 上清液中蛋白质含量以及总体积上清液中蛋白质含量。 1.3.2温度对绿豆蛋白质提取率的影响 分别在20、30、40、50、60、70℃恒温提取蛋 白质。用电子天平准确称取(精确至0.001)1g绿豆粉，置 于洁净的锥形瓶中，加入7ml蒸馏水，摇匀；用酸度 计将溶液pH值调至6.5；在恒温水浴锅内，保持恒温 浸提1h；1h后，在4000r/min转速下离心5min，将离 心管中的上清液转入25ml容量瓶中，再加7ml水进行二 次浸提1h、离心，合并两次浸提所得上清液、定容、 混匀；用移液管从容量瓶中取3ml上清液注入洁净试管 中，加入2ml双缩脲试剂，摇匀；在540nm下分别测 得吸光度；计算3ml上清液中蛋白质含量以及总体积上 清液中蛋白质含量。 1.3.3用水量对提取蛋白质的影响 每1g绿豆粉分别加入5、6、7、8、9、10ml蒸 馏水提取蛋白质。用电子天平准确称取(精确至0.001)1g 绿豆粉，置于洁净的锥形瓶中加蒸馏水摇匀，调节各 瓶中溶液pH值至6.5；浸提1h，期间定时摇动2～3次 以便浸提充分；在4000r/min转速下离心5min，收集上 清液转入25ml容量瓶中；再取等体积蒸馏水进行二次浸 提1 h、离心，合并两次所得上清液、定容、摇匀； 移取3ml上清液注入洁净试管中，加入2ml双缩脲试剂 并摇匀；在540nm波长下测出各自的吸光度；计算3ml 上清液中蛋白质含量以及总体积上清液中蛋白质含量。 1.4正交优化试验 根据单因素试验得到的结果，选取三个水平进行正 交试验，正交表采用L9(34)，因素水平表见表1。 2 结果与分析 2.1蛋白质标准曲线 以牛血清白蛋白作标准品，测得蛋白质标准曲线 为：Y=28.1690X－1.0394，R2=0.9995。式中，Y为蛋 白质含量(mg)；X为波长540nm处的吸光度(A540)。 2.2单因素对绿豆蛋白提取率的影响 2.2.1pH值对绿豆蛋白提取率的影响 由图1可以看出，pH值对蛋白质含量有明显的影 响，随着pH值不断变大，提取的蛋白质含量也随之增 加，但是pH值超过11后却稍有降低，当pH值为11时 候蛋白质含量达到最大值，然后随着pH值的增大蛋白 质含量开始下降，说明提取蛋白质应该在碱性环境尤其 是pH11的条件下提取，效果比较好。选择pH值为10、 11、12作为正交试验的三个水平。 2.2.2温度对绿豆蛋白提取率的影响 图2 温度对绿豆蛋白提取率的影响 Fig.2 Effects of temperature on extraction rate of protein 40 35 30 25 20 15 10蛋 白 质 含 量 ( m g / g d w ) 温度(℃) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 由图2可以看出，随着温度逐渐升高，蛋白质含 量也随之增高但增长平缓，在温度达到40℃时蛋白质含 量达到最高，其后随温度升高提取的蛋白质含量下降， 开始时下降较迅速，50℃以后下降趋于缓慢，该曲线 最终有平稳的趋势，说明温度高有利于蛋白质溶解，蛋 白质的提取率较高，可以有效地减少水的用量，减少 排污量。而由于温度高会引起蛋白质变性，碱性溶液 中蛋白质也容易水解，分子量变小，因此选择30℃左 2008, Vol. 29, No. 08 食品科学 ※工艺技术274 图3 用水量对绿豆蛋白提取率的影响 Fig.3 Effects of water amount on rate of protein extraction 用水量(ml/g) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 蛋 白 质 含 量 ( m g / g d w ) 4 5 6 7 8 9 10 11 试验号 A B C D 蛋白质含量 pH 温度(℃) 用水量(ml)空列 (mg/g dw) 1 1(10) 1(20) 1(8) 1 62.042 2 1 2(30) 2(9) 2 79.805 3 1 3(40 ) 3(10) 3 81.712 4 2(11) 1 2 3 70.459 5 2 2 3 1 97.824 6 2 3 1 2 79.842 7 3(12) 1 3 2 82.371 8 3 2 1 3 90.875 9 3 3 2 1 88.848 K1 74.40671.62477.58682.905 K2 82.70889.50179.70480.673 K3 87.36583.52187.35681.069 R 12.95917.8779.770 2.232 表2 正交试验结果 L9(34) Table 2 Results of orthogonal test L9(34) 右较适宜。因此选择20、30、40℃作为正交试验中温 度的三个水平。 2.2.3用水量对绿豆蛋白提取率的影响 3 结 论 3.1本研究采用水为提取剂，研究了温度、pH值及 用水量对绿豆蛋白质提取率的影响，其中pH值对蛋白 质含量影响最大，其次是温度，影响最小的是用水量。 3.2通过正交优化试验确定提取绿豆蛋白质的最优提取 条件为：pH12，温度30℃，用水量10ml/g。 3.3在优化条件下测得的绿豆蛋白质的含量为 108.4824mg/g dw。 参考文献： [1] 李茉莉, 孙桂华, 赵阳. 小杂粮作物的开发价值及战略意义[J]. 杂粮 作物, 2005, 25(2): 123-124. [2] THOMPSON L U. Preparation evaluation mungbean protein isolates [J]. Journal of Food Science, 1977, 42(6): 202-206. [3] ADSUALE R N. Chemistry and technology of green grain, CRC critical review[J]. Food Science and Nutrition, 1986, 25(1): 73-105. [4] 王金水, 张长付, 郭录风. 绿豆分离蛋白功能特性研究[J]. 中国粮油 学报, 1998, 13(2): 36-39. [5] 梁丽琴, 袁道强. 绿豆分离蛋白功能特性研究[J], 郑州轻工业学院 学报: 自然科学版, 2005, 20(1): 14-17. [6] 段佐萍. 绿豆的营养价值及综合开发利用[J]. 科技研究, 2004, 25(6): 17-20. [7] 程涛, 孙艳波, 李健. 双缩脲法测定乳中酪蛋白含量[J].中国乳品工 业, 2000, 36(5): 26-30. [8] 鲁子贤. 蛋白质与酶类研究方法[M]. 6版. 北京: 科学出版社, 1989. 由图3可以看出，随着用水量的逐渐增加，蛋白 质含量也随之逐渐增高，但增长一直比较平缓，直到 8ml/g以后蛋白质含量增长较快，不过用水量突破9ml以 后蛋白质含量并没有继续增加，原因可能是水量太多使 分离过程中蛋白质浓度过稀，同时还会溶解较多的色素 和细小纤维。因此，浸提用水量在9ml/g较好。选择 浸提1g绿豆粉用水量为8、9、10ml作为正交试验中用 水量的三个水平。 2.3绿豆蛋白提取条件的优化 根据单因素的结果，做L9(34)四因素三水平正交优 化试验，每个试验重复两次，结果见表2。 从表2可以看出，各因素对试验结果影响的主次顺 序为：B＞A＞C即A(pH)对蛋白质含量影响最大，其 次是B(温度)，影响最小的是C(用水量)；根据k1、k2、 k3确定最优组合是A3B2C3，即每1g绿豆粉中蛋白质的 最佳提取条件是酸碱度(pH)为12，温度30℃，用水量 10ml。 对正交试验得出的结论进行验证实验，在优化条件 下测得蛋白质含量为108.4824mg/g dw，比正交试验中的 结果要好，所以该可行，能适用于实际运用中。