创伤愈合中P物质的免疫组化观察

创伤愈合中 P 物质的免疫组化观察 汤小朋, 佘锐萍, 林德贵 (中国农业大学动物医学院, 北京 海淀 100094) 摘要: 目的: 动态创伤愈合中中性粒细胞、成纤维细胞 (fib rob last, FB ) 和 P 物质 (Substance P, SP) 阳性细胞的时空分 布以及创伤局部 SP 物质的分布与变化, 阐述上述变化与创伤愈合的关系。方法: 取家兔皮肤创伤组织进行 H. E. 、免疫组化染 色, 分别观察局部组织与细胞的变化。结果: 中性粒细胞于创后第 1 天最高, 然后回落; FB 在第 3 天即开始大量增殖, 在上皮化 接近完成, 真皮重建活跃的第 7 天到达峰值; SP 阳性物质在创伤局部呈现强阳性反应, SP 阳性细胞数在创后第 1 天, 第 3 天, 第 5 天时持续显著上升, 维持在较高水平直到第 15 天后才回落。结论: 中性粒细胞在创伤愈合早期起作用, 不直接参与创伤修 复, FB 为创伤修复的主要细胞, SP 参与了创伤愈合的全过程。 关键词: 创伤愈合; 中性粒细胞; 成纤维细胞; P 物质 中图分类号: S857. 17　　文献标识码: A 　　文章编号: 052926005 (2003) 0820012203 Imm unoh istochem istry observa tion of substance P dur ing wound hea l ing TAN G X iao2peng, SH E R u i2p ing, L IN D e2gu i (Co llege of V eterinary M edicine, Ch ina A gricu ltu ral U niversity,Beijing, 100094, Ch ina) Abstract: O b ject ive: To analyse the locat ion and dist ribu t ion of neu troph ils, f ib rob lasts (FB ) and sub2 stance P (SP) po sit ive cells du ring w ound healing. M ethods: H. E. and imm unoh istochem ical sta in ing and analysis of w ound t issues. R esu lts: A fter in ju ry the coun ts of neu troph ils, and SP po sit ive cells w ere in2 creased. N eu troph ils peaked at 1d, FB s at 7d. SP po sit ive cells con t inued to increase from 1d to 5d, and m ain ta ined at h igh level un t il 15d. Conclu sion: N eu troph ils p lay a ro le in the early stage of w ound healing. FB s are the m ain cells in the la ter stage, and their act ivit ies con tribu te to derm is remodeling. SP part ici2 pates the w ho le p rocess of w ound healing. Key words: w ound healing; neu troph ils; f ib rob lasts; sub stance P 　　P 物质 (Sub stance P, SP) 是第一个被发现的脑 肠肽类物质, 广泛分布于中枢神经系统和外周神经 系统, 在外周, 特别是皮肤、消化道和呼吸系统中含 量十分丰富。SP 具有扩张血管、促进腺体分泌、调节 免疫与炎症反应, 刺激参与炎症反应的免疫细胞等 多种作用[1, 5 ]。有报道表明, SP 与创伤愈合关系密 切, 一些离体或在体实验也观察到外源性 SP 具有 促进炎症反应作用的结果[2 ]。本实验采用组织化学 和免疫组织化学的方法, 观察了家兔创伤愈合中 SP 的定位与分布、SP 阳性细胞动态变化, 以探讨 SP 在创伤愈合过程中的作用, 为进一步研究创伤愈合 的机理提供依据。 1　材料与方法 1. 1　动物处理与切片制作　健康 5 月龄家兔 32 收稿日期: 2002212220 作者简介: 汤小朋 (19682) , 男, 副教授, 博士, 从事兽医教学与科 研工作。 通讯作者: 佘锐萍 只, 雌雄各半, 体重 2. 2～ 3. 1 kg, 购自北京温泉实 验动物养殖场。雌雄分开笼养, 饲喂上述养殖场供给 的兔饲料, 自由饮水。观察 3 日临床无异常后开始进 行实验。所有实验动物均在胸背部两侧剃毛, 常规无 菌处理, 距背中线 1. 5 cm 在两侧胸背部剃毛区用特 制取皮器制作直径为 0. 6 cm 的圆盘形皮肤伤口, 去 除表皮、真皮及皮下结缔组织, 深至肌层。每侧 4 个, 每兔共 8 个创口。分别于创伤后 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20 共 7 个时相点取材, 每个时相点 4 只家兔, 16 个创 面。取材时, 用耳静脉注入空气法处死家兔后, 立即 剪取创口及创缘皮肤, 4% 中性甲醛固定。石蜡包埋。 5 Λm 厚连续切片, 做H. E. 染色和ABC 免疫组织化 学染色。第一抗体为兔抗人 P 物质多克隆抗体, San2 taC ruz 公司产品; ABC 试剂盒为美国 ZYM ED 公司 SP29000 试剂盒, 购自北京中山生物技术有限公司。 1. 2　结果判定与处理　免疫组织化学切片上, 阳性 反应信号呈棕黄色或棕褐色着染, 细胞核呈浅蓝色。 40 倍物镜下分别在H. E. 染色和免疫组化染色切片 上测定每 0. 25 mm 2 组织内的 FB、中性粒细胞和 SP 阳性细胞数目, 每个样品随机观察 5 个视野, 取其平 21 调查研究 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中国兽医杂志 2003 年 (第 39 卷)第 8 期 均值, 进行组间平均值差异检验。 2　结果 2. 1　创伤愈合的大体观察　创伤后 1 天, 创面有较 多的炎性渗出物, 渗出物干燥, 创面收缩。创伤后 3 天, 创面出现痂皮, 创面痂皮呈现较为干燥的颗粒状 外观。创伤后 5 天, 创面明显缩小, 干燥。创伤后 7 天, 创口周围兔毛明显生长, 创面直径约为 0. 3 cm , 取材时可见创口周围皮下血管增生。创伤后 10 天, 创面进一步缩小, 部分创口痂皮开始脱落, 部分伤口 已被周边快速生长的兔毛覆盖。创伤 15 天后, 大部 分伤口痂皮脱落, 新生上皮覆盖, 创缘周边被毛覆 盖, 不再容易观察。 2. 2　H. E. 染色的观察结果 2. 2. 1　一般观察　H. E. 染色正常皮肤光镜下表皮 厚度约 2～ 3 层细胞。基层细胞整齐排列于基底膜内 侧, 表皮上有角质蛋白, 真皮内可见毛囊、皮脂腺和 少量纤维细胞、毛细血管。创伤后 24 h, 创口坏死, 炎症反应较重, 创口均有大量的炎症渗出物, 渗出物 的表面为纤维素, 在渗出的纤维素内有少量中性粒 细胞, 创伤底部则主要由大量坏死的中性粒细胞组 成, 相互之间界面比较清楚。创伤底部邻近坏死组织 的真皮组织内胶原纤维肿胀, 并有大量炎性细胞浸 润。创伤后 3 天, 创面渗出、坏死仍明显, 创口为大量 的渗出物和坏死组织覆盖。创缘表皮细胞开始再生, 向创面痂皮下生长, 伤口肉芽组织开始生长。创伤后 5 天, 创缘新生上皮明显, 新生上皮层进一步增厚, 表皮细胞较大, 细胞层数增多, 邻近创底真皮内中性 粒细胞数量减少, FB 的数量开始大量增加。创伤后 7 天, 创缘有较厚的新生上皮, 新生上皮下肉芽组织 丰富, 肉芽组织中 FB 和毛细血管进一步增多, 开始 出现新生胶原纤维。创伤后 10 天, 创面基本被新生 的表皮覆盖, 痂皮脱落, 新生表皮无角质化, 表面光 滑, 表皮出现新生毛囊上皮与其他皮肤附属器。肉芽 组织细胞数量开始减少, 新生组织中新生胶原纤维 粗大。创伤后 15 天, 无坏死和渗出, 创面表面完全表 皮化, 部分创面新生表皮较薄, 无明显的皮肤附属器 官。肉芽组织 FB 和毛细血管仍然很多。创伤后 20 天, 新生完全表皮, 新生表皮较正常表皮厚, 细胞较 大, 细胞层多, 新生表皮下新生胶原纤维明显, 深部 开始出现有序排列, 仍可见大量的 FB , 新生胶原纤 维着色较浅。 2. 2. 2　FB 的观察　从创后第 1 天开始, 在创伤局 部的真皮组织中就可以见到 FB 出现, 这时的 FB 染 色较淡, 胞核较大, 大部分为圆形。从创伤后第 3 天 到第 7 天, 细胞进一步变大, 部分 FB 胞浆内可以见 到新生胶原纤维, 新生胶原纤维在光镜下为粉红色, 着色较深。创伤后第 10 天, 部分 FB 为梭形细胞, 胞 核仍为圆形, 但染色变浅。纤维细胞开始出现, 新生 组织中圆形、梭形的 FB 与梭形的纤维细胞同时存 在, 新生胶原纤维排列无序。创伤后第 15 天, 大部分 的 FB 为梭形细胞, 圆形核 FB 少见。新生胶原纤维 开始呈现有序排列。创伤后第 20 天, FB 颜色进一步 变浅, 胶原纤维有序性增加。 2. 3　免疫组织化学观察结果 2. 3. 1　SP 阳性物质的分布特点　正常情况下, SP 主要位于真皮乳头层, 真皮血管以及毛囊、腺体周 围, 真皮其他部位也可见到呈条索状分布的阳性物 质和散在分布的阳性细胞, 表皮内几乎不见阳性物 质。创伤后 24 h, 创伤底部坏死组织与真皮交界面 出现强阳性反应, 坏死组织中有中等数量的阳性细 胞, 伤面渗出液中几乎不见阳性物质。创伤后 3 天, 阳性物质仍主要分布于坏死组织基部, 邻近创底附 近真皮中的阳性细胞数量开始增多。创伤后 5 天, 新 生表皮细胞间质呈现阳性反应, 新生表皮下阳性细 胞数量增多。创口阳性物质的分布同创伤后第 3 天。 创伤后第 7 天到第 15 天, 阳性物质主要位于肉芽组 织中的FB 和小血管壁以及新生的表皮中。创伤后 20 天, 阳性反应物质分布于新生表皮和 FB , 呈较强的阳 性反应。 2. 3. 2　创伤愈合中 FB、中性粒细胞数量和 SP 免 疫组化阳性反应细胞的记数结果　将临近创伤坏死 组织部位或肉芽组织的真皮组织中的 FB、中性粒细 胞和 SP 阳性细胞进行了统计记数, 对照组和处理 组在每个时相点均取 4 张切片进行记数, 每一张切 片记数 5 个视野。结果显示: (1)创伤后第 3、5、7 天 内 FB 呈现持续显著上升的趋势, 其中创后第 3 天 与第 1 天相比, 第 5 天与第 3 天相比上升极显著 (P < 0. 01) , 第 7 天与第 5 天相比上升显著 (P< 0. 05)。 第 7 天时 FB 数量上升到高峰, 然后呈现缓慢下降 的趋势。第 7 天以后相邻各时相点对比, 下降并不显 著 (P> 0. 05)。 (2)创后第 1 天可见到邻近创伤底部 的真皮组织中有大量的中性粒细胞出现, 但第 3 天 时中性粒细胞的数量即下降 (P < 0. 05) , 然后维持 在较低的水平直到第 7 天。第 10 天时中性粒细胞数 量与第 7 天相比又明显下降 (P< 0. 05)。第 15 天时 又一次下降, 与第 10 天相比下降显著 (P < 0. 05)。 直至第 20 天时, 创伤组织中仍有少量中性粒细胞存 在。(3)在创前正常皮肤组织, SP 阳性细胞的数量很 少。阳性细胞数量于造创后即显著升高(P< 0. 01) , 并 于创后第 3 天上升到第一个高峰值, 第 3 天阳性细胞 数量与第 1 天相比, 升高极显著(P< 0. 01)。从第 3 天 开始直到 15 天, 虽然阳性细胞的数量略有变化, 但变 化并不明显, 仍然维持在较高的水平。到第 20 天时, 阳 性细胞的数量有明显减少, 与第 15 天时相比下降显著 (P< 0. 01) , 但是仍然明显高于创前(P< 0. 01)。 比较 3 种细胞的变化趋势, 创伤后第 1 天, 创伤 局部组织中的 FB、中性粒细胞和 SP 阳性细胞均呈 31中国兽医杂志 2003 年 (第 39 卷)第 8 期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 调查研究 现显著升高的趋势; 第 3 天, 除中性粒细胞显著下降 外, SP 阳性细胞数量和 FB 数量仍然呈现显著上升 趋势, 但上升趋势有所不同; FB 在第 5、7 天时明显 升高, 然后缓慢下降。SP 阳性细胞在第 5 天时也显 著升高, 但于第 7 天时有所下降, 然后维持在较高水 平, 直到第 20 天时才显著下降。 3　讨论与小结 3. 1　中性粒细胞、FB 与创伤愈合　创伤愈合的基 础是炎症细胞和修复细胞的一系列的活动。这些细 胞以很有规律的方式参与愈合过程。在软组织损伤 中, 主要的炎症细胞包括单核巨噬细胞、中性粒细 胞、淋巴细胞等, 主要的修复细胞包括 FB、内皮细 胞、表皮细胞等。中性粒细胞是早期进入损伤部位的 主要炎症细胞。它通过吞噬作用、氧自由基抗菌效应 和补体激活等清除坏死组织与异物, 保护正常组织, 防止感染发生。我们在实验中观察到家兔创伤后第 1 天, 局部坏死组织与活组织的界面上, 浸润着大量 的中性粒细胞, 形成了所谓的“粒细胞分界带”[14 ]。 细胞记数的结果表明在创伤局部的真皮组织中, 主 要的浸润细胞为中性粒细胞。实验过程中创面无感 染的存在与中性粒细胞的浸润直接相关。多种文献 报道, 中性粒细胞不直接参与创面的修复, 但可以影 响创面的修复[14 ]。我们的实验结果显示, 在创后第 1 天, 创伤局部中性粒细胞数量最多, 然后开始减少, 表明中性粒细胞在创伤的初始阶段即炎症反应阶段 起着作用, 在创伤的后期即修复阶段, 作用不大。 FB 是主要的修复细胞, 有人认为, 它是创伤修 复的工程师、建筑者和管理员[15 ]。FB 在肉芽组织形 成和成熟的过程中表现出不同的特性。第一种特性 是增殖、迁移。FB 的迁移、肉芽组织的产生一般在创 伤后需 3 天左右准备期, 在这期间, 细胞外间质发生 变化, 细胞激活, 为肉芽组织的形成准备条件, 这段 时间的长短取决于 FB 由静息状态进入活化状态的 时间[16 ]。创伤后约 1 周, FB 几乎占据整个伤口, 创 伤后约 4 周, FB 发生细胞凋亡而数量减少。本实验 结果表明, 创伤后第 3 天, 创伤局部 FB 的数量即明 显增多, 到第 5 天继续增多, 第 7 天时达到高峰, 然 后保持较高的数量缓慢回落。这与许多有关 FB 数 量在创伤愈合中的变化规律的报道是一致的。 3. 2　SP 在创伤愈合中的作用　创伤愈合过程是一 个复杂的生物学过程, 是包括了炎症、肉芽组织形 成、胶原纤维等基质的沉积和表皮的重建等一整套 生物体自我修复的过程。在此过程中, SP 也参与了 作用[3 ]。SP 可直接促进内皮细胞、FB 的DNA 合成 和细胞增殖[5, 6 ] , 并能促进新生血管的合成[7, 8 ]。 本实验观察到, 创伤后伤口 SP 阳性物质的含 量均于造创后立即升高, 分别于造创后 5 天和 3 天 时显著升高, 并在较长的时间内一直持续维持在较 高的水平上。结果表明, 创伤部位的血液供应和炎性 反应, 上皮细胞, 血管及 FB 的增殖, 肉芽组织的生 长均与 SP 之间存在一定的关系。 有报道表明 FB 能够合成 SP, 并且其膜上有 SP 受体的存在[9, 10 ]。有人用免疫组化的方法, 观察大鼠 皮肤全层切割创的伤口组织中与 EGFöEGFR 表达 的关系实验时观察到, 创伤后肉芽组织 SP 阳性表 达部位除小血管周围外, FBSP 阳性着色明显, 人工 去感觉神经后, FBSP 阳性染色减弱, 认为 FBSP 的 表达与感觉神经释放的 SP 存在某种联系[11 ]。本实 验中除观察到了 SP 阳性表达位于小血管周围和 FB 的现象外, 还观察到在创前家兔正常的皮肤真皮 组织中也有 SP 阳性反应细胞存在, 从细胞的外形 看, 创前的阳性细胞形态与纤维细胞很相似, 推测创 前 SP 阳性细胞很可能是纤维细胞。而且, 从实验结 果还可以看出, 创伤后第 1、3 天, 当创伤局部 FB 的 数量还很少时, SP 阳性细胞数量就已很多。即在第 1 天与第 3 天两个相同的时相点 SP 阳性细胞的数 量明显多于伤口局部的 FB 的数量。况且在创后第 5 天和第 7 天时, SP 阳性细胞的数量的变化情况与创 伤局部 FB 数量的增加情况并不一致, 即 FB 数量大 量增加时, 并没有见到 SP 阳性细胞大量增加的现 象。以上分析结果并不是所有的 FB 均呈现 SP 阳性 反应, 只是其中的一部分呈现出阳性反应。表明创伤 局部 SP 阳性细胞除了 FB 外, 还有其他细胞为 SP 阳性反应。最新的研究发现, 在免疫细胞, 如嗜酸性 细胞、单核ö巨噬细胞、T 淋巴细胞、树突状细胞等的 胞内存在编码 SP 的 A 基因的转录产物和ö或 SP, 而且这些细胞产生并分泌的 SP 可以以自分泌 和ö或旁分泌的方式作用于免疫细胞本身, 调节它们 的功能[12, 13 ]。我们在研究中观察到部分分叶核中性 粒细胞也呈现 SP 阳性反应, 结合创伤初始阶段创 口底部坏死组织与活组织交界处大面积的 SP 强阳 性反应和大量的中性粒细胞聚集的现象, 推测创伤 坏死组织与活组织交界处的 SP 可能有相当一部分 来源于中性粒细胞。 参考文献: [ 1 ]　孙晓庆, 付小兵. 几种神经内分泌肽与创伤修复[J ]. 中国危重 病急救医学, 1999, 11 (10) : 6362638. [ 2 ]　魏　立, 赖西南. 创伤愈合中神经肽的作用[J ]. 国外医学 创伤 与外科基本问分册, 2000, 21 (3) : 1572161. [ 3 ]　蒋　伟, 王正国, 赖西南. 感觉神经肽 SP 在创伤愈合细胞因子 网络调控中的作用[J ]. 创伤外科杂志, 2002, 4 (4) : 2502252. [ 4 ]　F rode saleh T S, Calix to J B,M edeiro s Y S. A nalysis of inflam 2 m ato ry response induced by substance P in the mouse p leu ral cavity[J ]. Pep tides, 1999, 20: 2592265. [ 5 ]　N ilsson J , V on Euler A M , D alsgaard C J , et a l. Stim ulation of connective tissue cell grow th by substance P and substance K [J ]. N atu re, 1985, 315: 61263. [6 ]　H arrison N K, D aw es K E, Kwon O J , et a l. Effects of neu2 ropep tides on hum an lung fib rob last p ro liferation and chemo2 41 调查研究 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中国兽医杂志 2003 年 (第 39 卷)第 8 期 康贝对隐性乳房炎奶牛 SOD GSH-PX 活性的影响 李睿文1, 李铁拴2, 关　鸣3, 王铁征2, 池景志2 (1. 河北农业大学中兽医学院, 河北 定州 073000; 2. 河北农业大学动物科技学院, 河北 保定 071001; 3. 北京东方联鸣科技发展有限公司, 北京 海淀 100071) 中图分类号: S857. 2　　文献标识码: B　　文章编号: 052926005 (2003) 0820015202 　　康贝是由北京联鸣科技有限公司从美国引进的 一种高效生物活性制剂, 是美国B io system 公司利 用最新的生物发酵工程技术突破传统的生产工艺而 得到的产品。主要由酵母菌、米曲霉菌、枯草杆菌、乳 酸杆菌等组成的混合生物制剂, 含有多种消化酶如Α2淀粉酶、Β2葡聚糖酶、半纤维素酶和纤维素酶等, 具有促进消化作用, 还含有奶牛多种必需氨基酸、维 生素及微量元素。康贝防治奶牛隐性乳房炎具有良 好的效果[1 ] , 投喂康贝 6 周后, 治愈率为 84. 21% , 乳汁体细胞数由投喂前的 3105. 456±2912. 365× 103 个öm l 降到 334. 363±125. 849×103 个öm l, 为 揭示其防治奶牛隐性乳房炎的机制, 本文从抗氧化 酶系进行探讨, 现如下。 1　材料与方法 1. 1　供试奶牛　河北农业大学标本园奶牛场和河 北农业大学实验农场奶牛场的中国荷斯坦奶牛, 年 龄 4～ 6 岁, 产后 4～ 5 个月, 奶牛全身状况良好, 无 临床症状, 乳房及乳汁无肉眼可见异常。 1. 2　药品与仪器　康贝 (北京东方联鸣科技发展有 限公司提供) , CM T 诊断液、4% 氢氧化钠 (自配) , SOD 试剂盒、GSH 2PX 试剂盒 (南京建成生物试剂 收稿日期: 2002205201 作者简介: 李睿文 (19762) , 男, 硕士, 从事临床兽医学研究。 公司, 批号: 20010421) , UV 29100 分光光度计 (北京 瑞利分析仪器公司)。 1. 3　试验分组　随机选取年龄、泌乳期相近的隐性 乳房炎阳性奶牛 20 头作为治疗组, 阳性奶牛 8 头作 为阳性对照组, 另选符合上述要求的阴性奶牛 6 头 作为阴性对照组。治疗组每头奶牛每天投喂康贝 20 g, 试验期为两个月。 1. 4　血样采集　从治疗组随机选取 8 头奶牛, 于试 验期间 0、14、28、42 天颈静脉采血 5 m l, 肝素钠抗 凝。0 天时除采取治疗组与阳性对照组血样外, 还对 阴性对照组采血。采血后立即送实验室进行测定。 1. 5　测定方法　本试验测定 SOD、GSH 2PX 活性 采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒, 测定 程序按其进行。 1. 6　统计方法　应用 SA S 统计软件进行 t 检验。 2　结果 2. 1　隐性乳房炎阳性奶牛与阴性奶牛血浆 SOD 和 全血 GSH 2PX 活性的比较。 表 1　隐性乳房炎阳性奶牛与阴性奶牛血浆 SOD 和全血 GSH-PX 活性的比较 组　别 SOD (NU öm l) GSH 2PX (酶活力单位) 阳性组 (n= 8) 165. 427±6. 4523 3 315. 426±40. 3843 3 阴性组 (n= 6) 187. 364±5. 348 381. 426±34. 283 　　注: 3 3 为差异极显著 (P< 0. 01)。 tax is[J ]. Am J Physio l, 1995, 268: 2782283. [ 7 ]　Ziche M ,M o rb idelli L , Pacin iM , et a l. Substance P stim ulates neovascu larization in vivo and p ro liferation of cu ltu red cells [J ]. M icrovase Res, 1990, 40: 2642278. [8 ]　W alsh D A , H u D E, M app P I, et a l. Innervation and neu2 rok in in recep to rs during angiogenesis in the rat sponge granu2 lom a[J ]. H istochem J , 1996, 28: 7592769. [ 9 ]　丛　林, 李世荣, 梁智勇. 增生性瘢痕组织 P 物质及其受体分 布的免疫组织化学研究[J ]. 中华创伤杂志. 1998, 14 增刊: 612 63. [10 ] L uger T A , L o tti T. N europep tides: ro le in inflamm ato ry sk in diseases[J ]. J Eur A cad D erm ato l V enero l, 1998, 10: 2072211. [ 11 ] 魏　立, 赖西南, 王正国, 等. 创伤愈合中周围神经末梢分泌的 P 物质与表皮生长因子及其受体表达的关系[J ]. 中华创伤杂 志, 2001, 17 (8) : 4882491. [ 12 ] L ai J P, Douglas S D , Ho W Z. et a l. D ifferen tial exp ression of neurok in in21 recep to r[J ]. J N euro imm uno l, 1998, 86: 80286. [ 13 ] D e Gio rgio R , T azzari P L , Barbara G, et a l. D etection of sub2 stance P imm uno reactivity in hum an peripheral leukocytes[J ]. J neuro imm uno l, 1998, 82: 752181. [ 14 ] 王正国. 创伤愈合与组织修复[M ]. 济南: 山东科学技术出版 社, 1998. 829. [ 15 ] L ek ic P,M ccu lloch C A. Periodon tal ligam en t cell popu lations: T he cen tral ro le of fib rob lasts in creating a un ique tissue [J ]. A nat Rec, 1996, 245 (2) : 327. [ 16 ] M c C lain S A , Simon M , Jones E, et a l. M esenchym al cell acti2 vation is the rate2lim iting step of granu lation tissue induction [J ]. Am J Patho l, 1996, 149 (4) : 1257. 51中国兽医杂志 2003 年 (第 39 卷)第 8 期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 实验观察