酶法合成天然黑色素

2008 / 7技 术 与 市 场技 术 与 市 场技 术 与 市 场技 术 与 市 场技 术 与 市 场技 术 与 市 场技 术 与 市 场技 术 与 市 场技 术 与 市 场技 术 与 市 场技 术 与 市 场技 术 与 市 场技 术 与 市 场技 术 与 市 场技 术 与 市 场技 术 与 市 场 TECHNOLOGYANDMARKET 专利技术 酶 法 合 成 天 然 黑 色 素 专利号:200610075065.8 黑色素广泛存在于动物、植物和微生物中,黑色 素有吸收紫外线、抗氧化、消除自由基的作用,对生 物有机体起着保护作用。 黑色素是一种天然色素,在轻工、化工、食品、化 妆品等方面有重要的用途。目前制取黑色素有两种 ,一是从粮食种皮如黑豆、黑芝麻、高粱等和动 物毛发、表皮分离提取,该提取方法产量小、成本高、 纯度低;二是从酵母菌体中分离制取,该方法提取菌 种分离困难、设备复杂、投资巨大。本专利采用酶促 反应法提取黑色素,具有简便易行、生产成本低、投 资小、设备简单、产品纯度高的特点。 根据黑色素结构组成和在活体生物中的合成原 理,用酶化学方法合成黑色素,具体步骤如下: 1、酪氨酸氧化酶和酶制剂 从多种多酚氧化酶类活性高的植物材料和菌类 材料,其中包括梨、苹果、香蕉、马铃薯、山芋、竹笋、 桤木、杉木、松、马褂木、蘑菇、马勃等植物性材料分 离、制取多酚氧化酶类,包括酚羟基酶。将植物性材 料在磷酸缓冲液pH7.8中粉碎匀浆,5000rpm离心15 至20分钟,取上清液,加入60%~80%饱和度的硫酸 铵,于4℃冰箱中进行盐析,离心收集酶蛋白沉淀。酶 蛋白溶于小体积磷酸缓冲液 (pH7.0),上Sephades G-25柱脱盐,磷酸缓冲液洗脱,收集酶液。酶液中加 入冷冻丙酮或乙醇沉淀出酶蛋白,离心收集酶蛋白, 冷冻干燥得粉末酶制剂,酶活力每克11000至15000 单位。 2、酶促反应系统的构建 缓冲液:0.2M磷酸缓冲液pH7.2~8.8; 底物:根据合成的黑色素类型不同,酶反应底物 包括一元酚及其衍生物(酪氨酸、酪胺、多巴、多巴胺 等及其衍生物)、二元酚及其衍生物(对苯二酚、邻苯 二酚、间苯二酚、儿茶酸、异儿茶酸等及其衍生物)、三 元酚及其衍生物(连苯三酚、没食子酸等及其衍生物) 以及不同的组合,底物浓度为0.1至3.0g/升; 酪氨酸氧化酶活力5000至100000单位/升; 在反应容器中加入介质缓冲液、酪氨酸酶制剂和 可转化为黑色素的底物,组成酶促化学反应系统,在 最适宜的pH、温度、酶浓度、底物浓度和供氧条件下 进行酶促合成黑色素反应。该反应系统在pH6~9范围 内是稳定的,在pH<5.5时反应系统不稳定,底物沉 淀,酶失去活力。 3、黑色素制备 分别将合适比例上述底物溶于上述磷酸缓冲液 中,在水浴上加热溶解,冷却至40℃,加入新鲜的酪氨 酸酶制剂。在38℃~42℃保温90至120分钟进行酶促 反应,期间快速搅拌或用气泵不停地充气。反应混合 液逐渐由红褐色变成黑色。待反应结束后,加入6N HCL调pH≤4,黑色素絮状沉淀析出,过滤收集沉淀, 得黑色素粗产物。再经稀酸、稀碱洗涤后,再用水洗 至中性。将洗至中性的黑色素粗制品置于烧瓶中,加 适量6NHCl洄流8至20小时,水解其中的蛋白质,放 置冷却,过滤出黑色素,用稀碱洗涤,最后水洗至中 性,60℃烘干,即得黑色素。 联系人:王敬文 地址:浙江省富阳市大桥路73号 中国林科院亚热带林业研究所 邮编:311400 18