腹泻兔魏氏梭菌的分离鉴定及诊断研究

表 4 　不同菊苣品种营养成分 % 品　种 粗蛋白质 粗脂肪粗纤维粗灰分 无氮浸出物 钙 磷 普那菊苣 241 07 4156 251 82 9182 36119 01 293 01 556 欧洲菊苣 241 93 4161 241 97 9191 34168 01 311 01 589 美国菊苣 231 47 4148 271 53 9156 34114 01 283 01 537 314 　抗病虫害 　不同年份均无重大病虫害发生。抗病虫能力 较强。但该草的地下根茎是肉质根 ,土壤太湿容易发生根腐病。 因此 ,种植菊苣适宜选择排灌通畅的地块。 4 　小结 411 　在试验地气候条件下 ,参试菊苣品种均能正常开花结实 , 表现出较好的生态适应性 ,能忍耐夏季干旱、冬春寒冷的严酷条件 ,抗病虫能力较强。412 　参试菊苣品种在生产性能方面表现出明显的差异 ,鲜草产量、再生性、种子产量均以普那菊苣为最好 ,欧洲菊苣次之 ,美国菊苣最差。413 　菊苣在营养期适口性好 ,营养价值丰富 ,利于家畜采食和消化吸收。在利用时应使之处于莲座期的营养生长状态 ,尽量控制生殖枝的生长 ,以保证良好的适口性和较高的营养价值。414 　根据各参试品种的营养成分含量 ,结合产量分析 ,以普那菊苣饲用价值最高 ,为最理想的推广利用菊苣品种。 疾病防制 　　　　腹泻兔魏氏梭菌的分离鉴定及诊断研究 　　　　　　　　　王海荣1 ,唐德宏2 ,刘思当1 ,王 　磊1 ,柴同杰1 　　(11 山东农业大学动物科技学院 , 泰安　271018 ;21 泰安市畜牧兽医工作站) 摘要 :对山东省泰安等地的 4 起兔的腹泻疫情进行临床诊断 ,根据初步诊断结果进行了病原的分离培养 ,可疑菌经多重 PCR 鉴定为 A 型魏氏梭菌。结合病理组织学变化、动物实验结果 ,证实 A 型魏氏梭菌为引起上述 4 起兔的腹泻疫情的病 原。 关键词 :兔的腹泻 ;魏氏梭菌 A 型 ;分离鉴定 ;多重聚合酶链式反应 ( PCR) 　　兔的腹泻性疾病是危害养兔业发展的重大疾病 ,各个品种、 各个年龄的兔子都可发病 ,以断奶仔兔发病率最高 ,春、秋、冬三 季多发。引起兔子腹泻的原因很多 ,常见的传染性病原主要有 : 兔魏氏梭菌、大肠杆菌、沙门氏菌、兔球虫 ,尤其是兔的魏氏梭菌 病 ,由于诊断不及时、正确 ,治疗效果不好 ,发生后常常给养殖场 造成重大的经济损失。 1979 年我国首先在江苏省昆山种兔场发现兔的梭菌性下 痢 (蔡宝祥 ,2001) ,至今已在江苏、山东、福建等 20 多个省市、自 治区发现了此病。魏氏梭菌也是引起畜禽猝死症、坏死性肠炎、 肠毒血症、气性坏疽的主要致病菌。这种病原菌的致病性主要 与其形成的毒素有关 (柴同杰 ,2001) ,产生的毒素共有 12 种 , 其中有α、β、ε、ι四种主要毒素 ;按所产毒素种类 , 将魏氏梭菌分 为 A、B、C、D 及 E 五个型别。搞清流行的血清型 ,是有针对性 地预防和治疗的关键。 近一年多来 ,笔者接触到 4 起养兔场的腹泻病例 ,对此进行 了诊断研究 ,现报道如下。 1 　发病情况 111 　流行病学调查 病例 1 :泰安市郊区某肉种兔场 ,存栏 3 000 只。2004 年 11 月中旬 ,兔场断奶兔、青年兔发生腹泻 ,每天死亡 20～30 只 ,用 　　收稿日期 :2005 - 06 - 03 作者简介 :王海荣 (1968 - ) ,女 ,副教授 ,在职博士生。研究方向 :预 防兽医学。 文章编号 :1007 - 9726 (2005) 06 - 0043 - 03 (中图分类号 :S82911) 药物治疗效果不佳 ;该场为治疗兔的皮肤病 ,曾经以稀释的福尔 马林口服 ;为了使断奶仔兔增重快 ,饲养员添加精料较多 ,未使 用魏氏梭菌疫苗。 病例 2 :山东省新泰某肉兔养殖户 ,在山坡果园中建一兔 舍 ,哺乳幼兔、种兔、断奶仔兔、青年兔混于一舍 ,未及时给断奶 仔兔接种疫苗。由于天气突然变冷 ,2004 年 10 月下旬 ,出现了 断奶仔兔腹泻 ,畜主用抗生素给病兔注射 ,同时灌服庆大霉素 , 患兔的病情不但没有好转 ,反而全部死亡 ,开始每天几只 ,后逐 渐发展到每天 10～20 多只 ,死亡率很高。 病例 3 :青岛胶南某规模化商品肉兔养殖公司 ,饲养伊拉肉 兔。2005 年 3 月上旬 ,出现幼兔腹泻 ,小兔 35～40 日龄 ,断奶 7 ～8 天 ,最小的断奶 2～3 天 ,主要症状腹泻 ,伴有气喘 ;每个兔 舍养兔养殖 700～1 000 多只 ,每天死亡小兔 30 只左右。未使 用魏氏梭菌疫苗。共有两个场发病 ,药物治疗效果不好。 病例 4 :蒙阴地区某长毛兔养殖厂 ,2004 年 5 月发病 ,500 只毛兔一个半月死亡 30 余只 ,主要症状为严重拉稀。 112 　临床症状 　发病兔精神沉郁 ,食欲下降 ,严重者废绝 ;严重 腹泻 ,粪便为黑褐色水样 ,肛门附近及后脚被稀粪污染 ,后期病 兔腹部臌胀 ,双耳发凉 ,呆立 ,发病后 1～2 天 ,逐渐衰竭 ,四肢无 力站立 ,死亡。 113 　剖检变化 　胃内充满食糜 ,胃粘膜严重脱落 ,并散在黑色 溃疡斑 ;小肠充有气体 ,肠壁变薄 ,部分肠段粘膜显著出血 ;盲肠 和结肠膨大 ,内充满气体和黑绿色稀便 ,盲、结肠浆膜明显出血 呈横条带状 ;膀胱积尿 ,部分病例出现肺、气管出血。 根据以上几起病例所表现的流行病学特点、临床症状和病 34第 25 卷第 6 期 　　　　　　　　　　　　　　　　疾病防制 变特征 ,初步诊断上述 4 次疫情都是魏氏梭菌感染引起的。 2 　实验室诊断 211 　材料与 21111 　涂片、镜检 　采取病死兔小肠、大肠粘膜作组织触片 ,革 兰氏染色 ,镜检。 21112 　细菌的分离培养 　无菌操作钩取病死兔的肝脏接种于 1 %葡萄糖 5 %绵羊血琼脂平板中 ;厌氧培养 24 小时 ,再通过 1 %葡萄糖 5 %绵羊血琼脂平板 ,含铁牛乳培养基纯化、鉴定。 取肠内容物划线接种于 5 %绵羊血琼脂平板和 TSC 选择 鉴别培养基 (胰蛋白胨 - 亚硫酸铁 - 环丝氨酸培养基 ,购自北京 陆桥有限公司)中 ;41 ℃厌氧培养 24 小时 ;选择可疑单个菌落 , 涂片镜检 ,通过 1 %葡萄糖 5 %绵羊血琼脂平板 ,含铁牛乳培养 基纯化、鉴定。 取灭菌棉签沾取大肠内容物接种于 5 ml FT G肉汤培养基 (液体硫乙醇钠 ,购自北京陆桥有限公司) 中 , 10 倍稀释 ,取 10 - 1 、10 - 2 、10 - 3三个稀释度各 100μl 接种于 TSC 培养基上 ,均 匀涂开 , 41 ℃厌氧培养 24 小时 ,选择黑色单个菌落分离培养 , 再通过 1 %葡萄糖 5 %绵羊血琼脂平板 ,含铁牛乳培养基纯化、 鉴定。 21113 　病理组织学检查 　取典型病例病死兔的心、肝、肺、肾、 小肠按常规办法制备石蜡包埋切片 ,进行组织学检查。 21114 　取病死兔的小肠内容物 (蔡宝祥 ,2001) 　用 2～4 倍的 生理盐水稀释 ,60 000 转/ min 离心 15 分钟 ,取上清液经细菌滤 器过滤 ,将实验用小白鼠 (购自山东省生物制品中心)分为 2 组 , 每组各 4 只 ,实验组腹腔注射处理好的滤液 ,对照组注射生理盐 水。 21115 　多重 PCR 试验 1)引物设计 :根据魏氏梭菌的 5 种主要毒素基因的序列 ,参 考公开发表的引物序列 ,合成引物 [2～4 ] ,如表 1 所示。 2)模板的制备 : 将标准菌株和分离可疑株接种于羊血琼脂 表 1 　多重 PCR 引物序列 基　因 上游引物 下游引物 cpa 5′- GCTAA T GT TACT GCCGT T GA - 3′ 5′- CCTCT GA TACA TCGT GTAA G - 3′ cpb 5′- GCGAA TA T GCT GAA TCA TCTA - 3′ 5′- GCA GGAACA T TA GTA TA TCT TC - 3′ etx 5′- GCGGT GA TA TCCA TCTA T TC - 3′ 5′- CCACT TACT T GTCCTACTAAC - 3′ iA 5′- ACTACTCTCA GACAA GACA G - 3′ 5′- CT T TCCT TCTA T TACTA TACG - 3′ 平板 ,41 ℃厌氧培养 24 小时 ,勾取若干菌落接种于 FT G肉汤培 养基中 ,41 ℃厌氧培养 6～8 小时 ,取上述培养物 1 ml (菌液) , 8 000转/ min 离心 5 分钟 ,弃去上清液 ,沉淀用 200μl 双蒸水悬 浮 ,100 ℃煮沸 15 分钟 ,8 000 转/ min 离心 5 分钟 ,取上清液作 为模板 ,将上述制备的模板 4 ℃保存。 3)多重 PCR 试验程序 : PCR 试验采用 PCR 扩增试剂盒 (大 连宝生物有限公司) , PCR 反应体系为 50μl。基本反应体系如 下 :10 ×PCR buffer 5μl ,引物 (25μmol/ L ) 各 2μl , dN TP (215 mM) 5μl ,MgCl2 (25 mM) 5μl , r Taq 酶 (5 U/μl) 1μl ,2μl 模板 DNA ,双蒸水 16μl ;基本反应程序如下 :94 ℃5 min ,94 ℃30 s , 56 ℃30 s ,72 ℃1 min ,30 个循环 ,于 72 ℃反应 10 min。 用 115 %琼脂糖溶化加入 015μg/ ml 溴乙锭 1～2 滴制备电 泳凝胶 ,然后取 8μl 的 PCR 产物 ,混合 2μl 上样缓冲液 ,点样 , 并加入 2 000 marker 作为对照 ,在 90v 电压下于 1 ×TBE 缓冲 液中电泳 30～40 分钟 ,取出胶板 ,在紫外灯下观察结果并拍照。 4) PCR 产物的证实试验 :利用 Ta KaRa Agarose Gel DNA Fragment recovery 试剂盒从琼脂板上提纯 PCR 产物进行纯化 , 纯化的产物与 Ta KaRaPMD182T 载体质粒 (大连宝生物) 连接 , 转化感受态大肠杆菌 J M109 (大连宝生物) ,经酶切和 PCR 鉴定 后 ,转化菌送上海生物工程公司测序。 以上为制备魏氏梭菌 PCR DNA 模板的方法 ,制备大肠杆 菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌的 PCR 模板 ,作为阴性 对照。 212 　结果 21211 　镜检 :肠内容物涂片可见革兰氏阳性的粗大杆菌 ,两端 钝圆 ,单个或成双存在。 21212 　未从肝脏分离到可疑魏氏梭菌 ,蒙阴、胶南、新泰病例直 接从肠内容物分离出 3 株可疑菌 ,病兔大肠内容物稀释以后在 10 - 2 、10 - 3可见黑色单个菌落 ,见图 1 ,分离到可疑菌 ,共 5 株。 可疑菌在血琼脂上出现双溶血现象 ,在 TSC 培养基上出现黑色 菌落 ,可爆烈发酵牛乳培养基 ,符合魏氏梭菌的特征。 21213 　病死兔的病理组织学变化 　肝细胞呈颗粒变性、脂肪变 性 ,界限不明显 ,并见小的坏死灶 ,血管周围淋巴细胞、巨噬细胞 浸润 ;肾间质充血、出血 ,肾小管上皮细胞发生程度不同的变性 ; 心肌纤维有程度不同的颗粒变性 ,严重充血、出血 ;脾脏、白髓淋 巴细胞变性坏死 ,红髓区充血、出血 ;肠管粘膜上皮细胞大量坏 死脱落 ,肠腺数量减少 ,粘膜固有层充血、炎性细胞浸润。 图 1 　新泰病兔肠内容物稀释 1 000 倍后 100μl 稀释液中在 TSC 培养基可见的魏氏梭菌菌落 21214 　实验组注射后 24 小时全部死亡 ,对照组小鼠均未出现 死亡。 21215 　本次试验利用 5 对主要毒素的基因引物成功地扩增了 产气荚膜杆菌的 4 种主要毒素基因 (α、β、ε、ι) ,其 PCR 产物分别 为α324 bp、β196 bp、ε665 bp 、ι446 bp ,该产物经测序分析并与 genebank 的所发表的主要毒素序列相比 ,确认所建立 PCR 成功 44 中国草食动物 　　　　　　　　　　　　　　　　　　2005 年 地扩增了该菌的 4 种主要毒素基因。 多重 PCR 的特异性试验结果采用其他细菌进行试验 ,未见 阳性结果 ,所以检测产气荚膜杆菌的多重 PCR 方法 ,不与其他 的细菌和梭菌发生交叉反应 ,具有良好的特异性。见图 2。 分离的 8 株可疑菌 ,经多重 PCR 检测全为 A 型为魏氏梭 菌。见图 3。 图 2 　1、2 阳性对照 (B、E 型) ;3 大肠杆菌 ; 4 肠球菌 ;5 沙门氏菌 ;6 葡萄球菌 图 3 　9、10 (B 型、D 型) 为阳性对照 ; 1～8 为样品 3 　结论与讨论 311 　魏氏梭菌是一种梭状芽胞杆菌属的条件性致病菌 ,是动物 肠道中的寄生菌之一 ,正常情况下 ,不会致病 ,只有在食物和肠 管内容物中菌数含量超过正常限度或在菌体形成芽孢的过程中 分泌毒素致病 (韩文瑜等 ,2003) 。 从肠内容物涂片中可见到大量革兰氏阳性大杆菌 ,符合魏 氏梭菌病的特点 ,但由于肠道可能存在形态与其相似的其他革 兰氏阳性菌 ,仍需进一步的实验室诊断。 直接从肠道内容物中分离到魏氏梭菌 ,在魏氏梭菌病的诊 断中具有重要的意义。一般情况下 ,肠内容物中细菌很多 ,只有 当魏氏梭菌成为肠道内的优势菌以后 ,直接从肠内容物中分离 到魏氏梭菌单个菌落的机率才会比较高 ,而魏氏梭菌只有在出 现单个菌落才会体现细菌的典型特征 :即在血琼脂上出现特征 性双溶血现象和在 TSC 培养基上出现黑色菌落 ;才容易辨别 , 因此直接从肠道内划线分离到魏氏梭菌 ,也就意味着魏氏梭菌 成为了病畜肠道的优势菌。 用棉签沾取肠内容物之后 ,将其在培养基中倍比稀释 ,这样 比直接划线稀释更均匀 ,不仅有利于分离到魏氏梭菌 ,还可以对 魏氏梭菌进行粗略计数 ,更有效地反映肠道中魏氏梭菌的数量。 未从肝脏分离到魏氏梭菌 ,说明尚未形成魏氏梭菌的败血 症 ,根据魏氏梭菌的致病机制 (柴同杰等 ,2001) ,魏氏梭菌过量 繁殖产生大量毒素 ,毒素通过肠道吸收以后引起动物肠毒血症 而死亡 ,有时并未形成败血症动物就已经死亡。 312 　魏氏梭菌鉴定的常规方法是进行生化实验和小白鼠毒素 中和试验 ,其检测周期长 ,步骤繁锁 ,精确性差。在本实验中 ,分 离的疑似魏氏梭菌通过培养基的鉴别培养初步鉴定后 ,运用多 重 PCR 的方法 ,直接鉴定病原并对病原进行分型 ,大大简化了 操作程序 ,有利于魏氏梭菌病的快速诊断 ,减少由此造成的经济 损失 ,在有条件的单位此方法不失为一种好的确诊方法。 313 　病理组织学检查表明 ,各器官病理组织学变化与魏氏梭菌 病的病变特点相符 　综上所述 ,根据疫情爆发时出现的临床特 征 ,结合实验室诊断结果 ,可以确定上述 4 起兔的腹泻疫情是兔 魏氏梭菌病引起的 ,致病魏氏梭菌的的血清型为 A 型。 314 　通过流行病学调查发现 :几起发病兔群都未使用魏氏梭菌 的疫苗预防 ;疫情往往最常最先发生于断奶仔兔 ,一旦发病以 后 ,用抗生素治疗效果很差 ,养殖场损失惨重。因此养兔场应加 强兔魏氏梭菌病的预防。预防应从两方面着手 :一方面搞好免 疫接种 ,兔的魏氏梭菌病大多由 A 型魏氏梭菌引起 ,可用 A 型 魏氏梭菌制备的疫苗预防 ;另一方面保持消化道菌群平衡 ,断奶 阶段注意逐渐更换饲料 ,精料和青绿料合理搭配 ,避免不合理地 饲喂抗生素和消毒药 ,减少应激。 参考文献 [ 1 ] 　蔡宝祥主编1 家畜传染病学 (第四版) [ M ]1 北京 :中国农业出版 社 ,20011371 ,2571 [ 2 ] 　Yoo Han sang ,et al1 [J ] 1J Clinical Microbiology ,1997 ,35 (1) : 228～2371 [ 3 ] 　A Aschfalk ,W Muller1 [J ]1 Cana J Microbiology ,2002 ,481365 ,41 [ 4 ] 　张小荣 ,文其乙 ,刘秀梵 ,等1 一株致梅花鹿猝死症 A 型产气荚膜 梭菌的分离鉴定与基因分型研究[J ].畜牧与兽医 ,2002 ,34(6) :9～10. 售黑白花奶牛 北京黑白花 (荷斯坦)奶牛定点繁育牧场 ,现面向全国常年出售大小优质奶牛 ,3 个月以上小母牛 800～ 1 500 元 ;育成牛 1 500～2 000 元 ;日产奶 50 斤以上成母牛 4 000 元左右 , (牛价以产奶量而定 ,日产奶每 10 斤按 800 元计算) 。先货后款 ,购牛在 10 头以上本场专车运输 ,运费减免 50 %。来前来电告知 ,避免中介参 与 ,下车后见场长身份证和牧场 17020 白色长安新星车为准接洽 ,谨防假冒 ! 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