细菌基因突变的研究进展

细菌基因突变的研究进展 李宝全 　宁章勇 　刘思当 　(山东农业大学动物科技学院 　泰安 　271018) 　　细菌的基因突变是指细菌遗传物质的结构发 生突然而稳定的变化 ,导致的变异可遗传于后代。 由于细菌借助无性双分裂的方式进行繁殖 ,因此所 有后代的基因组通常都是完全相同的。尽管 DNA 复制过程十分精确 ,但是后代细菌中偶然不常见的 不精确性会使核苷酸的序列发生轻微的改变 ,导致 基因的变异 ,一般突变的比例为 10 - 4～10 - 9 。在 细菌细胞的数千个基因中 ,其任何一个均有可能发 生突变 ,而同一基因的不同突变可能会在细胞中产 生不同的效应 ,因此 ,可能突变的数目是很大的。 即使是一个“纯的”细菌培养物也将含有许多不同 的突变 ,对细胞内的许多基因产生影响。 1 　突变的类型 突变可分为大突变和小突变。前者指大段转 位因子的转位。小突变是指由于个别碱基的置换、 插入和缺失而引起的 ,影响到一个或几个基因。根 据突变时有无化学诱变剂可以分为 2 种。 111 　化学诱变突变 利用诱变剂来提高培养物中突变体发生的频 率。常用的诱变剂包括辐射 ( X 射线或紫外线) 和 化学试剂 (5 - 溴尿嘧啶、2 - 氨基嘌呤、亚硝酸、羟 胺) 。它们在原位改变 DNA 碱基或作用于碱基类 似物而干扰 DNA 复制。 112 　自发突变 实质上是环境自然选择和细菌进化的结果。 例如 :耐药性的突变。对此情况有 2 个实验可以证 明。第 1 个实验是 Luria 与 Delbruck (1934) 所做的 彷徨试验。第 2 个试验是 lederberg (1952) 设计的 影印培养试验。 2 　基因突变的回复 基因突变通常可经子代进行稳定遗传 ,但次生 突变偶尔也能回复到原来的序列。 211 　转座回复 转座子是细菌内 DNA 序列的 1 个片段 ,可以 在染色体或质粒中随机转移。若第一次转移形成 突变株 ,当第 2 次转移时返回原处 ,又变成了野生 型 ,则形成了转座回复。 212 　重组回复 在对细菌基因组进行重组操作时 ,把相对于野 生型的突变株的突变区剪切以后 ,所附载的目的基 因具有与野生型原有基因相同的型 ,使突变株回 复到了野生型。 3 　细菌基因突变的技术 311 　对已知突变进行检测的方法 31111 　引物延伸检测 　通过设计一个引物 ,其 3’ 末端紧邻已知的突变碱基 ,当反应体系中加入 1 种 与靶 DNA 上紧靠引物 3’末端的碱基互补的标记 核甘酸时 ,这种被标记的核苷酸才能连接上去。从 而形成一条带标记的寡核苷酸链 ,而如果所加的标 记核苷酸与引物 3’末端相邻情况区别开来。这种 方法又称为“微型测序法”。该法还可和双脱氧测 序法相结合使用。 31112 　限制性片段分析 　当突变影响到某一限制 性内切酶酶切位点时 ,可通过酶切细菌基因的 PCR 产物 ,继而通过电泳来检测是否有突变。如果突变 没有影响到限制性酶切位点 ,可采用“突变等位富 集 PCR”技术。 31113 　等位基因特异性寡核苷酸片段分析 　设计 一段 15～20bp 的寡核苷酸片段 ,其中包含了发生 突变的位点 ,当与固定在膜上样品 DNA 杂交时 ,由 于在 20bp 中 1 个碱基的差异会导致 Tm 值下降 5 ～715 ℃,因此通过严格控制杂交条件 ,可以鉴别其 DNA 是否突变。也可将寡核苷酸片段固定在膜 上 ,然后用样品 DNA 来杂交 ,这种方法称之为“反 向点杂交技术”。 31114 　等位基因特异性扩增 　通过设计 2 个 5’端 引物 ,1 个与正常 DNA 互补 ,1 个与突变 DNA 互 补。对于纯合性突变 ,分别加入这两种引物及 3’端 引物进行两个平行 PCR ,只有与突变 DNA 完全互 补的引物才可延伸得到 PCR 产物 ;对于杂合性突 变则需定量分析。如果错配位于引物的 3’—末端 , 导致 PCR 不能延伸 ,则叫“ARMS”。如果错配位于 引物之间而影响引物退火则叫“COR”。 312 　对未知突变进行分析的方法 31211 　杂合双链分析法 　由突变和野生型 DNA 形成的异源杂合双链 DNA 在其错配处会形成一个 凸起 ,在非变性胶中电泳时 ,会产生与相应的同源 双链 DNA 不同的迁移率 ,从而使两者分开。该方 法原理与单链构象多态性相似 ,只不过单链构象多 态性分离的是单链 ,而杂合双链分析法分离的是双 链。有人建议将杂合双链分析法与单链构象多肽 性法联合使用 ,可将检出率提高到接近 100 %。也 03 山东畜牧兽医 有人建议使用缺失的野生型等位基因来提高该方 法的灵敏度。 31212 　化学切割错配 　化学切割错配是在 Maxam - Gilbert 测序的基础上发展起来的一项新技术。 在 DNA∶DNA 或 DNA∶RNA 异源杂合双链核酸分 子中 ,错配的 C 被羧胺和哌啶切割 ,错配的 T 能被 四氧化饿所切割 ,切割产物通过电泳即可确定是否 存在突变。该方法最大的优点是能对长至 2kb 的 片段进行分析 ,并能确定突变位置。缺点是步骤 多 ,费时 ,且需接触有毒化学物质。 31213 　碳化二亚胺检测 　与化学切割错配法相 似 ,碳化二亚胺能够对错配的 G和 T 进行修饰 ,当 用标记的引物对碳化二亚胺修饰过的双链 DNA 进 行 DNA 合成时 ,延伸会在修饰过的碱基处终止下 来 ,合成产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检 测出是否有突变。该方法最大的优点是能对 1～ 2kb 的片段进行分析 ,突变检出率达 100 % ,并能确 定突变的位置 ,且碳化二亚胺是一种没有毒性的物 质。有报道曾用该法检测了下 2kb DNA 片段中的 一个小突变。但当一个 DNA 片段中存在多个突变 时 ,该方法就不适用了。 31214 　RNase A 切割 　在一定的条件下 ,异源双 链核酸分子 RNA∶RNA 或 RNA∶DNA 中的错配碱 基可被 RNase A 切割 ,切割产物可通过变性胶电泳 得到分离。RNA 探针可通过将相应的 DNA 片段 克隆至含有 SP6 或 T7 启动子的载体中得到 ,当 RNA 探针上错配的碱基为嘌呤时 ,RNase A 在错配 处切割效率很低 ,甚至不切割。而当错配碱基为嘧 啶时 ,则其切割效率很高。所以 ,如果仅分析被检 DNA 的一条链 ,其突变检出率只有 30 % ,而如果同 时分析被检 DNA 的正链和负链 ,则有效率可达 79 %。尽管 RNase A 切割法有其局限性 ,如需使用 同位素 ,需将 PCR 产物克隆至表达载体上 ,从而增 加了操作的复杂度 ,但由于它能对 1～2 kb 的片段 进行检测 ,并能确定突变的位置 ,且无须使用有害 化学试剂 ,故仍被频繁使用。 31215 　酶促切割错配 　酶促切割错配是一种与 RNase A 切割相类似的方法 , T4 核酸内切酶 Ⅶ是 一种不解酶 ,能够识别 12 种错配的碱基 ,并能在错 配的碱基附近进行切割 ,酶切产物通过变性胶电泳 或中性胶电泳即可检测出是否有突变。电泳产物 的检测可用放射自显影 ,也可用银染。由于该法能 对 DNA∶DNA 异源杂合子进行分析 ,因而省去了体 外转录的步骤。该法的缺点是存在非特异性切割 现象 ,并且有些错配碱基的识别不是 100 % ,因此 , 在每次检测时都必须设 1 个对照。 31216 　DNA 测序 　由各种突变检测技术检测到 的突变最后都由测序来确定突变的类型及突变的 位置 ,而且测序方法检测突变的效率可达 100 %。 基于此 ,有人提出一些比较小、外显子比较少的基 因突变检测直接用测序来进行。如 E. coli 的 bla 基 因。 31217 　错配结合蛋白检测 　从 E. coli 中分离的一 种 DNA 错配结合蛋白能在异源杂合双链 DNA 中 的错配碱基处接合 DNA ,接合后产物可通过顺序 胶电泳迁移率检测是否有突变。该方法的优点是 操作简单 ,可 1 次处理大量的样品 ,但据报道这种 DNA 错配结合蛋白对单碱基错配的接合程度不如 对几个碱基错配的接合那么强。最近有人建议将 几种 DNA 错配结合蛋白联合使用会提高突变检测 的准确率。 31218 　DNA 蕊片技术 　DNA 蕊片技术是 90 年代 以来发展起来的一项新技术 ,该技术结合了集成电 路计算机、半导体、激光共聚集扫描 ,荧光标记探 针 ,DNA 合成等技术 ,在基因定位、DNA 测序、核酸 图谱等方面具有重要意义 ,同样 ,在基因突变方面 前景也令人鼓舞。此外 ,还有变性梯度凝胶电泳、 单链构象多变性 ,切割片段长度多态性 ,双脱氧指 纹图谱、变性高效液相色谱等方法用于细菌基因突 变的检测。 4 　细菌基因突变体的分离技术 411 　抗药性突变体的分离 几乎对每一种抗生素 ,均可找到能产生越来越 强的抗性突变株。并且 ,由于抗性突变株可在能抑 制药物敏感性细胞生长的药物浓度下生长 ,因此很 容易在实验室里将它们分离出来。 412 　营养缺陷型突变体的分离 通过观察它们在不加特殊代谢物培养基上的 生长能力来判断其是否为营养缺陷突变体。 413 　代谢型突变体的分离 有些基因的突变可通过在特殊培养基中培养 细胞 ,观察菌落中间或周围的颜色加以分离。 研究细菌的基因突变 ,对于了解细菌的表型变 异、毒力变异提供了科学的依据。为临床用药、药 物开发提供了基础理论 ,为整个基因组的进化提供 了有力的证明。相信细菌基因突变的研究将会取 得巨大进展。 〔参考文献略〕 (收稿日期 :2000 —07 —14) 13文献综述