酶法合成研究进展

β-内酰胺抗生素的酶法合成研究进展 β-内酰胺抗生素经过多年的发展，己成为抗生素中的最主要类型之一。由 于具有良好的抗菌效力，较低的毒副作用，在临床上广泛应用，其发展非常迅速。 现全世界耗用量已过万吨，预计今后还会增长。其中，青霉素和头孢菌素为最重 要的两大类β-内酰胺抗生素。酶法合成技术始于 20世纪 60年代末 70年代初， 经过 30多年的发展，现在酶缩合反应技术、产品分离以及固定化酶技术等方面 取得很大的发展，配套技术日益完善，具备了大规模工业化生产的条件。 全球著名的β-内酰胺抗生素生产厂家如荷兰 DSM 公司已有酶法合成的商 品头孢氨苄、阿莫西林等产品面世。由于酶法应用于β-内酰胺抗生素合成，不 仅可减少反应，而且还可减少废弃物的产生，有利于保护环境，降低生产成 本，产品质量优异，所含杂质极少。因此，21世纪β-内酰胺抗生素的酶法合成 将是发展的必然趋势。 我国酶法合成研究起步并不晚，但至今仍未形成大规模工业化生产，与国外 先进厂家差距较大。随着我国经济快速发展，人们对自身居住环境的要求，政府 对环保的重视，政府和越来越多的企业加大“绿色化学制药”的研究开发，特别 是加快工业化生产的推进进程。现将近年来β-内酰胺抗生素合成研究、产品的 分离纯化、酶反应器研究进行概述。 1 现状 青霉素中如氨苄西林、阿莫西林等，头孢菌素中如头孢氨苄、头孢羟氨苄、 头孢克洛、头孢丙烯、头孢唑林等，这些产品有化学半合成法（简称化学法）和 酶半合成法（简称酶法）。化学法是将母核与侧链以化学法缩合，现在世界上绝 大多数生产这些产品的企业使用的是化学法，常用的方法有酰氯法、混合酸酐法、 Vilsmeier 法及活性醋法。酶法则是将母核与侧链通过酶催化缩合。化学法需要 较多的有机化学原料（如溶剂二氯甲烷、吡啶、二甲苯胺），反应条件苛刻，如 需无水条件，反应温度低（有的需低至零下 90℃），反应步骤多，产生大量的三 废需处理。 这些产品酶法合成技术自 1969年开始报道，但由于当时酶的性能较差，分 离纯化技术也一直未能很好的解决，因此多年来酶法合成技术仍处于研究和试生 产阶段。近年来，随着生物工程技术和固定化酶技术的快速发展，酶法制备β- 内酰胺抗生素的技术也不断得到提高。 2 酶催化合成研究进展 2.1 酶催化酰胺化缩合反应 酶法制备β-内酰胺抗生素酰胺化缩合反应的研究涉及的品种有氨苄西林、 阿莫西林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢丙烯、头孢克洛 等。 酶催化缩合反应类型一般有两类，一类为热力学控制的酶催化缩合反应，另 一类为动力学控制的酶催化缩合反应。 (1)热力学控制的酶催化缩合反应 其特点是不必活化酰基配体，废物产生少。Schroen 等研究了不同 pH、溶 剂浓度和温度条件下，热力学控制的头孢氨苄酶法合成。pH 5－8，酶的稳定性 较好；pH 4，酶的活性大大减弱；在水中直接合成，只有很少量的头孢氨苄生成， 加入与水互溶的有机溶剂（甲醇和三甲醇二甲醚）有一定好的效果，头孢氨苄平 衡浓度增加 2－3倍，最大为 0.25mmo1/L (36%三甲醇二甲醚，30℃，3d)。研 究了不同侧链对产品平衡浓度影响，侧链有苯乙酸、α-溴苯乙酸、L-马来酸、 D-马来酸、对羟基马来酸、吲哚乙酸。研究发现，当侧链为苯乙酸，产品平衡浓 度最大 (2.8mmol/L)，当侧链带有α羟基苯乙酸（即马来酸），产品平衡浓度小 （最小 0.6mmol/L）。结果表明，侧链结构对产品平衡浓度影响很大。酶可以是 游离酶，也可以是固定化酶，来源 E.coli。虽然，热力学控制的头孢氨苄酶法生 产头孢氨苄，由于产品平衡浓度低，应用价值不大，但提示对某些β-内酰胺抗 生素，由于侧链结构特性，热力学控制的酶催化缩合有可能实施。 Diender等报道了热力学控制阿莫西林酶法合成，在水溶液中，加入青霉素 G酰化酶（来源 E.coli），同时加入有机溶剂，提高阿莫西林合成平衡常数和合成 缩合收率。 Ulijn 等报道，以青霉素酰化酶（粗酶，游离态）为催化剂，通过沉淀产品 制备酸性和两性离子β-内酰胺抗生素的研究。将苯乙酸和氨水溶液、底物 6-APA （悬浮物）直接加入到反应器中，加入酶催化剂，一边反应一边将产品沉淀。这 种热力学控制酶催化反应对青霉素 G可行，但对两性β-内酰胺抗生素阿莫西林 则不行。研究发现，通过加人某些相反离子，使其有利沉淀。阿莫西林阴离子与 Zn2+阳离子形成溶解性差的盐。 Zn2+离子加入尽管使β-内酰胺降解，但使缩 合收率增加至少 30倍，产品平衡浓度可达 30mmol/L。 由于热力学控制的酶催化缩合β-内酸胺抗生素反应，现阶段缩合收率还较 低，应用价值还不大。 (2)动力学控制的酶催化缩合反应 此类反应酰基配体需活化，而酰基配体活化一般是形成酰胺类化合物或酯类 化合物。Vroom 报道，将苯甘氨酸、对羟基苯甘氨酸制成相应的酰胺衍生物， 在青霉素酰化酶作用下，此酶固定在包含凝胶和由氨基酸组成的多聚体上，酶来 源于 Escherichia coli、Acetobacter pasteuri- anum、Xanthomonas citrii、Kluyvera citrophila、Bacillus megaterium、Alcaligenes faecalis, 反应温度 0－35℃，最适 为 10℃，pH5－9，合成了头孢氨苄、头孢羟氨苄、氨苄西林、阿莫西林。用此 方法，也可合成头孢拉定、头孢克洛、头孢丙烯。Boesten 等报道，7-ADCA 与 苯甘氨酰胺缩合得到头孢氨苄，并将母核 7-ADCA 从母液中回收。 van Doren报道将底物母核通过 pH调节，使其达到过饱和浓度，在青霉素 酰化酶（最好固定化）作用下（酶来源 Acetobacter pasterurianuyn、Alcaligenes faecalis、 Bacillus megaterium、 Escherichia coli、 Fusarium oxysporum、 Xanthomonas citri等），与相应侧链酰胺缩合，得到产品。这种方法比不将底物 母核调到过饱和浓度的转化率高 10%左右，母核与侧链摩尔比不大于 2.5。用此 方法合成了头孢克洛、头孢氨苄。 侧链形成酯类化合物中，形成甲酯的较多。Youshko等报道，6-APA与侧链 苯甘氨酸甲酯在青霉素酰化酶 ATCC11105（游离态，来源 Escherichia coli ）作 用下，合成氨苄西林。青霉素酰化酶催化水溶液中氨苄西林合成主要由初始底物 浓度决定。比较了均相体系中和非均相体系中酶合成反应。在“水溶液-沉淀” 非均相体系中，通过形成过饱和溶液进行，然后沉淀产品氨苄西林使得生物催化 过程良好进行，使得氨苄西林转化率由 6-APA 计为 93%。最近还有报道，侧链 与多醇（如乙二醇）形成含羟基的酯，再与母核在酶的催化下缩合，转化率高达 99%，此方法尤适于头孢丙烯、头孢羟氨苄的合成。 在酶法制备β-内酰胺抗生素的过程中，一般使用经固定化技术处理得到的 固定化青霉素酰化酶，而早期使用的固定化细胞等形态的酶，因其形态结构和性 能方面的缺陷，目前已不再使用。随着固定化酶技术进步，和对固定化酶在反应 中失活原因的深人研究，固定化酶的使用寿命已经大大延长，半数失活(half-life) 已经达到 50-100批次。 在制备β-内酰胺抗生素的酶缩合反应过程中，不可避免地会产生逆反应— —水解反应，即反应产物由于酶的作用再逆分解成原料，这对提高反应产率是很 不利的，为提高酶缩合反应的产率，侧链对母核的投料量大大过量，这造成了侧 链的过高消耗，并在产品中引入了不需要的杂质，对生产来说仍是不经济的。 MauriZi 报道酶缩合反应制备头孢氨苄，向反应体系中加人少量的酶抑制剂（苯 乙酸、苯氧乙酸、扁桃酸等），可降低酶解作用，同时又不会对酶催化缩合反应 产生太大的影响，从而可以得到较高的反应产率，大大降低侧链的投料量，使侧 链与母核的投料比例降到 2:1以下。 2.2 酶催化氯化反应 酶催化β-内酰胺抗生素合成研究，对其酰化缩合反应报道较多。最近，开 始对酶催化氯化反应有研究报道。从微生物 Rathayibacter种中分离制备对头孢 菌素氯化过氧化物有活性的酶，在 pH6.0磷酸盐缓冲液中，加人氯化钠和 3%过 氧化氢溶液，此种酶可将廉价的头孢氨苄转为价高的头孢克洛。仅有 Rathayibacter biopuresis能产生头孢菌素氯化过氧化物酶。现转化率不高，如能 提高转化率，将对头孢克洛的生产产生巨大的影响。 2.3“一锅法”酶法研究情况 酶法合成β-内酰胺抗生素，一般一步反应在一个反应器中进行，近年来， 有人将几步酶法反应（例如水解/缩合或缩合/缩合等）在一个反应器中进行，这 样，不需分离中间体，简化了过程，有利于工业化生产，这将是酶法合成的趋势 之一。 Ternadez-Lafuente等报道新型化学酶法合成头孢唑林，通过 D-氨基酸氧化 酶、戊二酰化酶和青霉素 G酰化酶催化作用，生物转化头孢唑林。以头孢菌素 C 为起始原料，在水溶性中，经三步酶法和一步化学法合成头孢唑林，不分离纯化 中间体，每步酶法收率接近 100%。先将头孢菌素 C酶法脱乙酰基，然后由 DAO 和 GA催化，再由 PGA固定化酶（来源 Esherichia coli ATCC11105）进一步催化 酰化 7-ACA，得到 7-[(1H-四氮唑)-乙酰氨基]-3-乙酰氧甲基-△3-头孢烷酸，最 后与 MMTD侧链化学法缩合得到头孢唑林。 Wegman 等报道，自苯甘氨酸腈二步酶法转化，一锅法制备头孢氨苄。腈 水解酶（来源 R. rhodochrous）催化水解 D-苯甘氨酸腈为酰胺，然后在青霉素 酰化酶(E.C.3.5.1.11)作用下，7-ADCA 与 D-苯甘氨酰胺缩合，得到头孢氨苄。 然后将 1，5-二羟基萘加至反应液中，与头孢氨苄一起结晶，这使得反应液头孢 氨苄浓度很低，避免了水解，收率 79%，合成/水解比 7.7。研究还显示 D-苯甘 氨酸腈对青霉素 G酰化酶有明显选择抑制作用。 Schnien等报道己二酰 7-ADCA水解和头孢氨苄酶法合成一锅法完成，所用 酶为固定酰胺化酶（来源 Escherichia coli），缩短了头孢氨苄制备过程。 酶水解 苯甘氨酸酯或酰胺 己二酰 7-ADCA————→7-ADCA————————→头孢氨苄 青霉素酰化酶 3 产品的分离与纯化 在酶法制备β-内酰胺抗生素的技术中，产品的分离及纯化是一项关键性技 术。由于所用原料侧链、母核和产品的理化性质相近，采用普通方法难以达到分 离提纯的目的，因此该问题一直是酶法合成β-内酰胺抗生素生产的一大障碍。 目前使用的回收纯化方法有多种，如：酸碱结晶法、浓缩结晶法、化学法（如萘 复合物法）、柱色谱法、纳米滤膜法、两相萃取法等。这些方法各有优缺点，还 需进一步的改进和完善。采用酸碱结晶法分离产品，可以不用有机溶剂，避免了 对环境的污染。但是此法不能把产品一次分离干净，母液中残留的产品仍需浓缩 结晶或其他方法加以回收处理，而且产品纯度也不够理想。 利用头孢菌素与萘类化合物形成复合物的方法比较简单可行，反应体系中的 产品几乎可以定量地与萘类化合物形成复合物，从而得到完全分离。此法非常适 合有酶存在的反应体系。如能解决回收萘类化合物的问题，这将是一个非常好的 分离纯化工艺。 Wegman等报道一锅法制备头孢氨苄，将 1,5- 二羟基萘加至反应液，与头 孢氨苄一起结晶，这使得头孢氨苄浓度很低，避免了水解，收率 79%。 Schroen等报道，在酶法合成头孢氨苄过程中，同时将产品通过与萘类衍生 物形成复合物。这些复合物易结晶，复合物为复合剂与头孢氨苄按一定比例组成。 复合物的形成利于防止不需要的水解。优化了反应条件，pH7.5，温度 25℃为最 适宜条件。讨论了产物形成复合物对反应的影响，在大多情况下，有好的影响， 水解被抑制。特别是复合剂为 1，5-二羟基萘，酶为液态酶，这样可得到高浓度 的头孢氨苄。 采用两相萃取法分离提纯产品，是一个较好方法。Hernandez Justiz等报道 由动力学控制的酶法（自大肠杆菌的青霉素酰化酶）缩合头孢氨苄，通过连续萃 取水溶性产品（周围是酶），从而使收率提高，这样，可避免酶快速水解。将酶 以共价键固定于多孔载体上，反应开始前，孔状结构载体可以洗涤，用其中一相 填充，这样，当事先平衡好的生物催化剂与第二相混合（那里反应产物将被萃取）， 固相酶保留于开始选择的第一相中。首次评估了在不同二相体系中头孢氨苄分配 系数。在剧烈条件下，可获得高的分配系数。在 100%聚二乙醇 600-3mol/L， 硫酸铵体系中，头孢氨苄被萃取到聚乙二醇体系中，可获最佳分配系数。固定化 青霉素酰化酶在硫酸铵中，然后进一步悬浮于 100%聚乙醇 600 中，这样，可 得到 90%头孢氨苄合成收率，这里苯甘氨酸甲酯浓度 150mmol/L，7-ADCA 浓 度 l00mmo1/L。在这个反应体系中，固相酶留在硫酸铵水相中，由于将产品连 续萃取到聚乙二醇相中，使头孢氨苄的水解得到抑制。相反，在单相体系中，由 于头孢氨苄的快速水解，综合收率低于 55%。 4 酶反应器研究 酶催化法合成β-内酰胺抗生素生物反应器主要有填充床生物反应器、搅拌 槽式生物反应器、膜式生物反应器等，现研究较多的是膜式生物反应器。 Tarvascio 等报道非均热膜生物反应器用于酶法合成头孢氨苄的情况。一种 新的疏水性的催化膜，通过青霉素酰胺化酶 E.C.3.5.1.11（来源 Escherichia coli） 固定在尼龙膜上，尼龙膜与甲基丙烯酸丁酯相连接，六亚甲基二胺和戊二醛分别 作间隔基和偶合剂。以青霉素 G酰化酶作催化剂，7-ADCA和苯甘氨酸甲酯缩合， 对 pH、温度、底物浓度等反应条件进行了考查。结果显示事先处理的酶有较好 的结果，增加了固定化酶对 pH和温度的稳定性。活化能的计算显示，通过固定 化酶的生物催化制备头孢氨苄受到分散限制，导致酶活性和底物亲和性减弱。梯 度温度作为减少分散限制性一种方法。实验表明，随着温度梯度变化，头孢氨苄 呈线性增加，温度相差 3℃，头孢氨苄合成增加 100%，产品制备时间减少 50%。 非均热生物反应器克服了分散限制性，Km值降至接近自由酶的 Km值，减少由 于固定化过程酶的失活。 Wenten等报道网状纤维膜反应器的情况，青霉素酰化酶 E.C.3.5.1.11固定 在膜孔上，连续水解青霉素 G。研究了不同操作条件对固定化酶反应的影响。固 定化结果显示青霉素酰化酶可固定 90%以上。由于 6-APA 分子比膜孔小，溶质 通过膜自由分散。然而，固定化酶截留了 35%溶质。而且固定化酰化酶 Km （8.04mm）比游离青霉素酰化酶(7.75mm)略高。低流速可以避免胶体形成或酶 从膜孔释放，从而最大限度达到转化。 5 结束语 随着人们对β-内酰胺抗生素的酶法合成深人研究，相关的工业技术快速发 展，人类对自身生存环境状况日益重视，β-内酰胺抗生素的酶法合成将是 21世 纪 β-内酰胺抗生素发展的必然趋势之一。