外周血K_ras基因突变和CA19_9的联合检测在胰腺癌诊断中的作用

�胰腺外科� 作者单位: 100730 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协 和医院普外科 通信作者:赵玉沛,电话: 010�65296021 外周血 K�ras基因突变和 CA19�9的联合 在胰腺癌诊断中的作用 戴梦华 � 赵玉沛 � 蔡力行 � 朱预 � � 摘要! � 目的 � 研究 K�r as 基因突变和 CA19�9 联合检测在胰腺癌诊断中的作用。 � 方法 � 选 择同期的 15 例胰腺癌和 33非胰腺癌病人, 同时行外周血 K�ras 基因突变和 CA19�9 的检测, 利用统 计学方法进行数据分析。 � 结果 � 外周血 K�r as 基因突变和 CA19�9 联合检测诊断胰腺癌的敏感性、 特异性分别为 66�67%和 97% ,研究组和对照组之间差异具有显著性意义( P = 0�001)。 � 结论 � 外 周血 K�ras 基因突变和 CA19�9的联合检测显著提高了胰腺癌诊断的特异性, 弥补了单一 K�ras 基因 突变和 CA19�9 检测的不足, 可用于胰腺癌的辅助诊断。 关键词! � 胰腺肿瘤; � 基因, ras; � 突变; � 肿瘤标记, 生物学 Combined detection of K�ras mutation and CA19�9 level in plasma of patients with pancreatic cancer � DAI Meng�hua, ZH AO Yu�p ei , CA I Li�x ing, ZH U Yu . Depar tment of General Surger y . Peking Union Medical College Hosp ital , Chinese A cademy of Medical Sciences , Beij ing 100730, China Abstract! � Objective � To confirm t he effect of combined detect ion of K�ras gene mutation and CA19�9 level in plasma in the diagnosis of pancr eatic cancinoma. � Methods � In 33 pat ients without pancreat ic carcinoma and 15 patients wit h pancreatic carcinoma, the value o f K�ras mutation and CA19�9 level were examined by enr iched polymerase chain reaction ( PCR ) restriction fr agment leng th polymorphism( RFLP) and radioimmunoassay respectively . T he data were analysed with � 2 test, F isher∀s exact test and Kruekal�w all∀s test. All patients were confimed pat holog ically. � Results� Eleven o f the 15 patients w ith pancreatic carcinoma and 2 of 10 patients with chronic pancr eatitis were found K�ras mutation. CA19�9 level in patients w ith pancreatic cancer w as significantly higher than that in those with benign disease but wit h a low specificity. The sensitivity, specificity of combined detection o f K�r as gene mutation and CA19�9 level in the plasma of patients with pancreat ic cancer were 66� 67% and 97% . There w as a significant difference between patients w ith pancreatic cancer and those without pancreatic cancer. Patholog ical examination showed atypical hyperplasia in one patient wit h chronic pancr eatit is w ho had K�ras mutation and higher CA19�9 level. � Conclusions� Combined detection o f K�ras gene mutation and CA19� 9 can be used for adjuvant diagnosis of pancreatic cancer. It is mo re specific than detection of single K�ras g ene mutation or CA19�9 level in the plasma. The method is complementary to single detection of K�ras g ene mutation o r CA19�9 level because it decr eases the rate of false�positive diagnosis. Key words! � Pancreatic neoplasms; � Genes, ras; � Mutation; � Tumor markers, biolog ical � � 目前尚无早期诊断胰腺癌的有效方法, 虽然 K� ras基因突变和肿瘤标记物的检测可用于胰腺癌的 诊断, 但是单一的检测结果并不理想。有研究发现 将上述指标进行联合检测可以弥补单一检测的不 足,并可将诊断率提高到 90%以上[ 1, 2]。因此,基因 突变和肿瘤标记物的联合检测可能成为临床分子生 物学诊断胰腺癌的基本模式。基于此点, 我们进行 了前瞻性研究, 探讨联合检测外周血 K�ras 基因突 变和 CA19�9在胰腺癌诊断中的作用。 资料和方法 1.病例选择及标本:选择 1999年 10 月~ 2000 年 6月北京协和医院外科连续住院病人 48例, 分成 2组, 胰腺癌组 15例, 其中导管腺癌 12 例, 黏液性 囊腺癌 3 例, 男#女为 8#7,平均年龄 56岁。非胰腺 癌组 33例, 其中慢性胰腺炎 10例,壶腹部癌 14例, 胰岛素瘤 5例,胰腺交界性粘液性囊腺瘤 1例, 胰腺 假性囊肿 3例,平均年龄 51岁。所有病人均有病理 诊断。术前抽取病人外周血 5 ml,肝素或乙二胺四 乙酸( EDTA)抗凝, 2 000 ∃ g 离心 12 min,分离血浆 �332� 中华外科杂志 2003年 5月第 41卷第 5期 � Chin J Surg, May 2003, Vol. 41, No. 5 表 1 � 15例胰腺癌病人临床特征、K�ras基因突变结果和 CA19�9 值 序号 性别 年龄(岁) 肿瘤部位 肿瘤大小( cm) 分期 血浆K�ras基因突变 病理诊断 CA19�9值( U/ L) 1 男 43 胰头 � 7. 0∃ 8. 0 % + 高分化腺癌 � 232 2 女 54 胰头 � 7. 0∃ 8. 0 % - 腺癌 � � � � 62 3 男 65 胰体尾 10. 5∃ 9. 5 % - 粘液性囊腺癌 > 500 4 男 68 胰头 � 5. 0∃ 8. 0 % - 导管腺癌 � � 358 5 男 43 胰头 � 5. 0∃ 6. 0 % + 腺癌 � � � � 357 6 女 65 胰头 � 6. 0∃ 8. 0 % + 腺癌 � � � � > 500 7 男 58 胰颈 � 5. 0∃ 5. 0 % + 腺癌 � � � � 36 8 女 67 胰尾 � 2. 5∃ 2. 5 & + 粘液性囊腺癌 272 9 男 46 胰头 � 5. 5∃ 3. 0 ∋ + 高分化腺癌 � 67 10 女 45 胰头 � 5. 5∃ 3. 5 ( + 高分化腺癌 � 305 11 女 65 胰头 � 3. 0∃ 3. 0 ∋ + 中低分化腺癌 30 12 男 46 胰头 � 5. 0∃ 5. 0 ∋ + 高分化腺癌 � > 500 13 男 59 胰头 � 3. 0∃ 2. 0 ∋ + 中低分化腺癌 > 500 14 男 64 胰头 � 5. 0∃ 4. 0 % - 囊腺癌 � � � 324 15 女 59 胰体尾 5. 0∃ 5. 0 ∋ + 腺癌 � � � � > 500 和白细胞 - 70 ) 冻存。术前常规抽取外周血查 CA19�9,所得数据均重复一遍。 2.标本制备: 用 QIAamp 公司的 DNA Blood M idi Kit ( QIAGEN, cat log No. 51183 Germany )提 取血浆 DNA,取 1 m l血浆加入 15 ml离心管内。用 蛋白酶 K 溶解蛋白, Buffer AW1、AW2和无水乙醇 分离沉淀 DNA, 高速离心下分离出 DNA, 离心液 - 20 ) 保存。白细胞 DNA 采用酚氯仿方法提取, DNA用 AE溶解, - 20 ) 保持。 3. K�ras基因突变的检测:采用两步RFLP�PCR方 法[ 3]检测血浆和白细胞 K�ras基因突变,第一次 PCR 反应 体 积为 50 �l。引物 Pr1 和 Pr2 的 序列 为 TCAAAGAATGGTCCTGGACC 和 ACTGAATAT AAACTTGTGGTAGT TGGACCT。取 PCR 产物 5 �l用限制性内切酶MvaI1�5 U(加拿大MBI公司)进行 酶切,取 2 �l酶切产物作为,用0�5 �mol引物 Pr2 和Pr3( TAATAT GTCGACTAAAACAAGATTTAC� CTC)进行第二次 PCR扩增。再用 MvaI 对第 2 次 PCR产物进行酶切,酶切后 DNA片断在 3%琼脂糖 凝胶中进行电泳, 80 V 电压 1 h, 用 Pun�pan1 细胞 株DNA 做阳性对照, SW1990细胞株 DNA 做阴性 对照, 电泳结果在紫外线透射仪下观察并拍照。部 分 RFLP�PCR产物进行测序。 4. CA19�9的检测:采用放免法测定, 正常值为 37 U / ml。 5.统计学处理:应用计算机 SASS软件进行数据 处理,采用 �2 Test、Fisher∀s Exact Test 和Kruekal�Wall∀ s Test 方法分析不同组间的统计学差异。 结 果 一、K�ras基因突变的检测结果 1.胰腺癌组: 15例中有 11 例胰腺癌病人被检 测出外周血浆 K�ras基因突变, 阳性率为 73%。突 变类型为 TGT 和 GAT。其中导管腺癌 10例, 囊腺 癌 1例,具体见表 1。根据 TNM 分期, %期病人的 外周血浆 K�ras基因突变率为 50%, &、(、∋期病 人为 100%, 在各期均可发生, 与肿瘤分期、部位及 体积无明显相关性。 2. 非胰腺癌组: 10例慢性胰腺炎病人中有 2例 检测出 K�ras基因突变, 均为胰头肿块型胰腺炎。 其中 1例术前腹部 B超和 CT 均提示胰头区实性占 位,胆总管扩张。CA 系列中 CA19�9为 282 U/ ml, 术前诊断胰头占位病变。行胰十二指肠切除术, 术 中见胰头肿大,约 4 cm ∃ 5 cm ∃ 4 cm ,边缘呈结节 状。术后病理回报:重度慢性胰腺炎,部分上皮增生 及不典型增生;免疫组化 IgA( + ) , AE1/ AE3( + ) ; 淋巴结呈慢性炎症。壶腹部癌, 胰岛素瘤,胰腺交界 性囊腺瘤和胰腺良性疾病病人的外周血浆中未检测 出 K�ras基因突变。1例腹膜后肿物的病人,既往有 肺癌和食管癌切除手术病史;术中发现肿瘤位于腹 膜后胰尾部,已侵及周围脏器无法切除,术中取淋巴 结送病理,回报为腺癌, 检测外周血浆亦未发现 K� ras基因突变,初步除外肿瘤来源于胰腺。 3. 白细胞 DNA: 所有标本中均无 K�ras基因突 变。 二、CA19�9的检测结果 �333�中华外科杂志 2003年 5月第 41卷第 5期 � Ch in J Surg, May 2003, Vol. 41, No. 5 1. 胰腺癌组: 15例胰腺癌病人中 12例大于正 常值, 其中 5例> 200 U/ ml, 5例> 500 U/ ml, 阳性 率为 83%,平均值为 359 U/ L。CA19�9与 TNM 分 期的关系: 随 T NM 分期的增加而升高。CA19�9 值> 500 U/ L 均在∋期以上, 但有 1例 ∋期、2例% 期胰腺癌病人 CA19�9值< 37 U/ L。 2. 非胰腺癌组: 33例非胰腺癌病人中, 10例慢 性胰腺炎中有 4例病人的外周血 CA19�9> 37 U/ L , 其中 1 例慢性胰腺炎病人的 CA19�9为 282 U / ml, 病理示慢性胰腺炎伴有导管上皮不典型增生的, 具 有癌变倾向。其余 3 例病人的 CA19�9 值均 < 100U / L。在慢性胰腺炎中 CA19�9 轻度升高, 平均 值为 68。14例壶腹癌中 9例 CA19�9升高, 平均值 为 236 U/ L。 3. 统计学分析: ( 1) Kruekal�Wall∀s test 分析研 究组和对照组 CA19�9 含量差异具有显著性, P = 0�000 2。胰腺炎、胰腺癌和其他癌之间的 P 均为 0�000 1, 3组之间差异有显著意义。而胰腺癌和其 他癌之间的 P = 0�032, 差异无显著意义。单一 CA19�9 的检测诊断胰腺癌的敏感性和特异性为 86�67%和 54�55%。( 2) � 2检验: 研究组和对照组 性别及年龄的 �2 值分别为 0�132和 6�358, P 值为 0�716和 0�100,差异无显著意义, 证明两组的性别 和年龄较为均衡。( 3) F isher∀s Exact T est结果示研 究组和对照组 K�ras基因突变的检出率差异存在极 显著性意义, P = 0�001。( 4)四格表法得出该方法 诊断胰腺癌的敏感性及特异性分别为 73%和 94%。 ( 5)以 K�ras基因突变阳性、CA19�9> 37 U / L 作为 诊断胰腺癌的,四格表法算出联合检测的方法 诊断胰腺癌的敏感性和特异性分别为 67%和 97%。 Fisher∀s Exact Test 检测 P = 0�001, 差异有极显著 意义。 讨 论 早期的胰腺癌无典型症状, 常常被误诊, 而使 85%的病人丧失了手术机会, 因此胰腺癌的早期诊 断是直接影响胰腺癌病人预后的主要因素。目前的 诊断手段较多, 包括影像学检查、肿瘤标记物和癌基 因突变的检测, 其中肿瘤标记物的检测主要有 CA 系列 (包括 CA19�9、CA242 和 CA50)和癌胚抗原 ( CEA)。由于胰腺的解剖学特点,使影像学方法对 胰腺癌的早期诊断受到限制, 而单一癌基因突变或 肿瘤标记物的检测又具有一定的局限性。本组选择 CA19�9作为研究变量,在不同的胰腺疾病中进行了 比较,发现在胰腺良性疾病中, CA19�9值轻度升高, 而在胰腺癌中 CA19�9值升高显著,且随着 TNM 分 期增加而增加, ∋期以上病人 CA19�9> 500 U / L, 这些结果说明 CA19�9的升高可以提示恶性肿瘤的 可能;四格表法计算其在胰腺癌诊断中的敏感性和 特异性分别为 83%和 55% ,说明特异性较差;采用 Kruekal�wall∀s Test 方法得出胰腺癌和其他癌之间 的 P= 0�032, 差异无显著意义, 提示 CA19�9 不能 对胰腺癌和壶腹周围癌做出鉴别诊断。 K�ras基因突变在胰腺癌中具有高表达,现已检 测出胰腺癌病人的组织、胰液、外周血和粪便的 K� ras基因突变。其中组织中 K�ras基因突变的阳性 率最高达 100% [ 4]。其次为胰液, 阳性率在 80%以 上[ 5�7] , 但上述方法大多具有创伤性而难以广泛开 展,另外,很多病人由于不能耐受 ERCP 和组织学检 查而失去诊断机会。外周血 K�ras 基因突变的检 测[ 3, 8]以其简便、可重复性强、无创伤等优点, 弥补 了组织和胰液 K�ras基因突变检测的不足, 但亦有 假阳性的结果。在研究中,我们排除了两组之间年 龄和性别的系统误差, 将外周血浆 K�ras基因突变 阳性、CA19�9> 37U/ L 作为胰腺癌的诊断标准, 四 格表法计算出诊断胰腺癌敏感性和特异性分别为 67%和 97%,特异性显著升高, 明显优于单一 K�ras 基因突变和 CA19�9 的检测, 弥补了单一检测的不 足。因此,外周血 K�ras基因突变和 CA19�9的联合 检测可用于胰腺癌的辅助诊断。另外研究还提示联 合 K�ras基因突变和 CA19�9的检测有助于胰腺癌 的早期诊断,在胰腺癌的&、(期均可检测出外周血 K�ras基因突变和 CA19�9的升高。1例伴有导管上 皮不典型增生的慢性胰头肿块型胰腺炎病人的外周 血 K�ras基因突变阳性, CA19�9为282 U/ L ,明显升 高正常值。这些均表明联合 K�ras 基因突变和 CA19�9的检测可能对胰腺癌的早期诊断具有帮助, 但在临床上推广应用尚须进一步的探索和。 参 考 文 献 1 Futakawa N, Kimura W, Yamagata S, et al. Sign if icance of K�ras mutation and CEA level in pancreatic juice in the diagnosis of pancreatic cancer. J Hepatobiliary Pancreat Surg, 2000, 7: 63�71. 2 Myung S J, Kim MH, Kim Y, et al . Telomerase act ivity in pure pancreatic juice for the diagnosis of pancreat ic cancer may be complementary to K� ras mutat ion. Gast rointest i En dosc, 2000, 51: 708�713. 3 Mulcahy HE, Lyautey J, Lederrey C, et al. A prospect ive study of K�ras mutat ions in the plasma of pancreat ic cancer patients. Clin �334� 中华外科杂志 2003年 5月第 41卷第 5期 � Chin J Surg, May 2003, Vol. 41, No. 5 Cancer Res, 1998, 4: 271�275. 4 T ada M, Omta M , Ohto M , et al. Clinical applicat ion of ras gene mutat ion for diagnos is of pancreat ic adenocarcinoma. Gast roenterology, 1991, 100: 233�238. 5 Kimura W, Zhao B, Futakawa N, et al. Signif icance of K�ras codon 12 point mutat ion in pancreatic juice in th ediagnosis of carcinoma of the pancreas. Hepatogastroenterology, 1999, 46: 532�539. 6 Kaino M , Kondoh S, Okita S, et al. Detect ion of K� ras and p53 gene mutat ions in pancreat ic juice for the diagnosis of int raductal papillary mucinous tumors. Pancreas, 1999, 18: 294�299. 7 Yamashita K, Kida Y, Shinoda H , et al. K�ras point mutat ions in the supernatants of pancreatic juice and bile are reliable for diagnosis of pancreas and biliary t ract carcinomas complementary to cytologic examination. Jpn J Cancer Res, 1999, 90: 240�248. 8 戴梦华,赵玉沛,蔡力行, 等.外周血浆 K�ras基因突变的检测在 胰腺癌诊断中的应用. 中华肝胆外科杂志, 2001, 7: 530�532. Dai MH , Zhao YP, Cai LX, et al. Value of detect ing K�ras gene mutations in plasma of peripheral blood in diagnosis of pancreatic cancer. Chin J Hepatobiliary S urg, 2001, 7: 530�532. (收稿日期: 2002�12�25) (本文编辑:王莉) �病例� 作者单位: 247000 安徽,池州市人民医院 普外科 胰高血糖素瘤综合征一例报告 孔胜兵 � 吴心闩 � 汪开贵 � 朱少问 � � 患者 � 女性, 46 岁。反复发作皮 炎、口角炎 16 个月, 于 2002 年 8 月 14 日拟 ( 1) 胰腺占位 ∗ ∗ ∗ 胰高血糖素瘤; ( 2) 全身泛发性皮炎收住本科。患者 2001 年 3 月~ 4 月出现双手对称性甲沟 红肿疼痛。初起仅限 1~ 2 个手指, 继之 波及其余诸指。7 月出现口角糜烂、口 腔溃疡� 鼻唇沟、外耳道等处皮肤湿疹 样改变。8 ~ 9 月双大腿内侧 � 会阴部 皮肤破溃。12 月因皮损加剧双足红肿 入住外院。尿糖 + + + , 空腹血糖 ( FBS ) 7�0 mmol/ L。诊断为糖尿病。 2002 年 4 月院外 CT 检查发现胰腺占 位。病程中体重下降约 5� 0 kg。 体检:贫血貌, 体重 51 kg。BP 114/ 63 mm Hg, P 85/ min。巩膜不黄, 甲状 腺无结节, 左锁骨上淋巴结不肿大。腹 平软, 肝脾不大, 无腹块。口角糜烂, 舌 面及口腔粘膜见小溃疡。双足背红肿, 双下肢外侧、腰骶部皮肤呈湿疹样 (图 1)。双大腿内侧、会阴部皮肤糜烂。 实验室检 查: Hb 78 g / L , HCT 0�240。Tpr 51�9 g/ L , A lb 31� 5 g / L。 K + 3�25 mmol/ L, Na+ 143� 31 mmol/ L, Cl- 105�92 mmol/ L。FBS 4� 78 mmol/ L ( 3�89~ 6�11) , PG�2 h 6�15 mmol/ L( 3� 89 ~ 11� 1 )。空 腹 血 胰 高 血 糖 素 29 2� 2ng / L ( < 2 00 ng / L ) 。CEA 2� 0 1 图 1 � 患者腿部皮肤有湿疹样改变及破溃 处 �g / L , CA19�9 15� 3 U / ml, CA50 9� 2 U / ml, AFP 30 以下。 特殊检查: BUS 胰颈癌累及肝总动 脉伴主胰管扩张。螺旋 CT 胰颈部肿块 ( 2� 5 cm ∃ 3� 0 cm) , 胰管扩张。MRI 胰 颈部肿块 ( 2� 5 cm ∃ 2�5 cm) , 胰体尾萎 缩。皮损处病理活检:游走坏死性红斑。 治疗经过: 入院后予抗炎 � 输注氨 基酸,皮损渐结痂。2002 年 8 月 26 日 行保留部分胰头保留脾脏的胰体尾切除 术。术中见肝质软无结节。肿块位于胰 颈部 (直径 3� 5 cm) , 胰头侧边界尚清 晰,尾侧边界不清, 体尾部萎缩呈薄片 状,胰管扩张(图 2)。肝动脉旁淋巴结 肿大。术后第 14 天痊愈出院。随访至 今无复发。病理报告: 胰岛细胞肿瘤 ( 4� 0 cm ∃ 2�0 cm)侵及周围胰腺组织, 切缘阴 性。肝动脉旁淋 巴结阴性。 Masson染色示局部红染。结合临床倾 向于胰高血糖素瘤 (恶性 )。肿瘤免疫 组化标记 NSE+ + , Cga + , S�100 + 。 图 2术中见胰管扩张 讨论 � 胰高血糖素瘤综合征表现以 皮肤迁徙性坏死性红斑、糖尿病等为主 要特征的一组征候群。徐少明等总结 1981 年~ 1994 年国内报道 9 例病例时 发现 90% 有明显糖尿、皮诊、舌炎、贫 血、消瘦等症状, 100%为恶性, 90%有转 移,肝脏是其常见转移部位。确诊前均 有误诊。肿瘤 90% 位于胰体尾部。本 例肿块位于颈体部。表现为血糖轻度升 高、皮炎、口角炎迁延不愈、体重减轻、贫 血,未确诊达 16 个月。 通常将血胰高血糖素测定值 > 1 000 pg/ ml作为诊断标准。本例空腹 血胰高血糖素 292� 2 ng/ L ( < 200 ng/ L)。BUS、CT、MRI、SAG 均能很好地显 示胰腺占位性病变。手术是唯一可以获 得根治的治疗方法。保留部分胰头保留 脾脏的胰体尾切除术可作为备选的术式 之一。 (收稿日期: 2002�10�08) (本文编辑:王莉) �335�中华外科杂志 2003年 5月第 41卷第 5期 � Ch in J Surg, May 2003, Vol. 41, No. 5