荧光PCR乙型肝炎病毒定量诊断试剂盒

热线电话：021－5446 0832 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址：www.shinegene.org.cn 1 荧光PCR乙型肝炎病毒定量诊断试剂盒 PCR-Fluorescence Quantity Diagnostic Kit for Hepatitis B Virus 使用说明书 【前言】 本试剂盒采用聚合酶链式反应（PCR）结合 Taqman 荧光探针技术，对血清中的乙型肝 炎病毒（Hepatitis B Virus）的特异性 DNA 核酸片段进行定量的检测，本品对 HBV 的检测 灵敏度为 500copy/ml(供研究使用)。 【规格】 20 人份，－20℃保存，有效期 6 个月 【试剂盒组成】 1 核酸提取液 600ul 5 阴性对照(HBV) 10ul 6 HBV定量阳性对照 1 号 1.0×106copy/ml 10ul 3 HBVPCR 反应液 480μ l 7 HBV定量阳性对照 2 号 1.0×105copy/ml 10ul 4 混合酶 40μl 8 HBV定量阳性对照 3 号 1.0×104copy/ml 10ul 【适用仪器】 本试剂盒适用于 PE5700、7700、LightCycler、FTC-2000 等荧光 PCR 仪。 【标本处理和加样】 血清标本各取 30μl（冻存血清使用前在室温融解，振荡混匀 10 秒钟），加入 30ul 核酸提取 液, 振荡混匀 10 秒种,100℃沸水浴 10 分钟，然后 12,000rpm 离心 5 分钟，最后取上清作 PCR 扩 增。处理后的样品应在 1 小时内使用，或在-20℃～-80℃最长保存 1 个月（不宜反复冻融）。注： 定量阳性对照、阴性对照不要处理，可直接使用。 【试剂准备】 按样品数（样品数＝血清标本数＋对照品数＋定量阳性对照 3 个）n 取 HBV PCR 反应液 n ×24ul、混合酶 n×2ul 混于一离心管中，旋涡振荡器上振荡混匀 10 秒，按每管 26ul 分装于反 应管中。将上述处理好的标本上清液和定量阳性对照 1 至 3 号（务必振荡混匀数秒）各取 4ul 分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，立即进行 PCR 扩增反应。 【PCR 扩增】 PE5700、7700、icycler、FTC2000 荧光仪的程序设置先在 37℃反应 2 分钟，然后 93℃保温 5 分钟，再按 93℃30 秒→60℃60 秒 循环 40 次。 z lightcycler 荧光仪的程序设置 热线电话：021－5446 0832 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址：www.shinegene.org.cn 2 反应管置于 LightCycler 自动荧光 PCR 仪上，37℃反应 2 分钟，93℃2 分钟，再按 93℃5 秒→60℃30 秒 循环 40 次，每个循环的升降温速率为 20℃/S，每个循环在 60℃30 秒处进行荧 光检测设置。 【结果分析与判断】 1、 基线设定 1.1 PE5700、7700、FTC2000： 分析前把参比荧光定为TAMRA，如果没有Ct<16 的强阳性标本，就选 3-15 个循环的平均荧光 信号为基线分析；如果有Ct<16 的强阳性标本，就将此标本定为HBV DNA>1010 copy/ml，并将此 样品从数据库中剔除，再以 3-15 个循环的平均荧光信号为基线再分析Ct。 1.2 iCycler 基线一般按照自设值（2-10）即可，在实验结束后，选择PCR baseline substract选项扣除 基线值。若某些曲线出现了的剧烈的跳动，应视为非正常情况，将其从结果中剔除（击活 select wells,将此孔彩色点去，然后选择display wells）并注意调整坐标，使所有曲线都在 坐标以内。 1.3 lightcycler 用荧光记数值 F1/F2 读取结果。基线设定原则以超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且 Ct 值不出现任何数值为准（一般在 0.001-0.05 范围内）。 2、阈值设定 以刚好高于阴性对照品的扩增曲线最高点，且阴性对照品 Ct=40 或 0 为原则，调整起始阈值。 3、结果分析 3.1 Ct<16 的强阳性标本，为HBV DNA>1010 copy/ml。 3.2 38>Ct>16 的标本，按参比曲线计算浓度报告。 3.3 当 Ct=40 或 0 时，报告为阴性。 上海闪晶分子生物科技有限公司 地址：上海市吴河路328号A座2楼 邮编：201109 联系：市场部 电话：021-54460832 800-988-1995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址：www.shinegene.org.cn