GBT 19438.3-2004 H7亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR 检测方法

ICS 11.220 一 一 B 4’ 药羚 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB/T 19438.3-2004 H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR 检 测 方 法 Method of real-time RT-PCR for the detection of the avian influenza virus subtype H7 2004-02-14发布 2004-02-15实施 率督斜臀瓣臀澄臀暴发布 ww w. bz fx w. co m 免费下载网(www.freebz.net) 免费标准下载网(www.freebz.net) 无需注册 即可下载 GB/T 19438.3---2004 前 言 GB/T 19438-2004《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分： — GB/T 19438.1-2004禽流感病毒通用荧光 RT-PCR检测方法》； — GB/T 19438.2-2004K H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》； — GB/T 19438.3-2004K H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》； — GB/T 19438.4-2004((H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。 本部分的附录A为资料性附录。 本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本部分起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。 本部分主要起草人：高志强、张鹤晓、郭晋优、刘继红、吴丹。 ww w. bz fx w. co m 免费标准下载网(www.freebz.net) 免费标准下载网(www.freebz.net) 无需注册 即可下载 GB/T 19438.3-2004 H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR 检 测 方 法 1 范围 本部分了荧光RT-PCR检测 H7亚型禽流感病毒的操作方法。 本部分适用于活禽及其产品中H7亚型禽流感病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。 GB/T 19438.1-2004 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本部分。 3. 1 荧光RT-PCR 荧光反转录一聚合酶链式反应。 3.2 Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的闭值时所经历的循环数。 3.3 RNA 核糖核酸。 3.4 Taq酶 Taq DNA聚合酶。 3.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水。 3.6 DEPC 焦碳酸乙二醋。 4 原理 采用TagMan方法，通过比对禽流感病毒血凝素基因，一对仅在H7亚型禽流感病毒血凝素基 因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其 中5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（R),3`端标记的TAMRA荧光素（Q）在近距离内能吸收5‘端 荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团。反应在退火时，引物和探针同时与目的基因片段结合， ww w. bz fx w. co m 免费标准下载网(www.freebz.net) 免费标准下载网(www.freebz.net) 无需注册 即可下载 GB/T 19438.3-2004 探针上R基团发出的荧光信号被 Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时， Taq酶发挥5'-3‘的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再 为Q所吸收而被检测仪所接收。随着 PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应 关系。 5 试剂和材料 5.1 试剂 除特别说明外，本标准所用试剂均为纯，所用液体试剂均须使用无RNA酶的容器（用DEPC 水处理后高压灭菌）进行分装。 5.1.1 H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒”：试剂盒的组成、说明及使用参见附 录Ao 5.1.2 三氯甲烷。 5.1.3 异丙醇。 5. 1.4 75％乙醇，用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水配制。 5.1.5 0. 01 mol/L (pH7. 2）的PBS：配方见GB/T 19438. 1-2004中附录Ao 121 C士2 *C, 15 min 高压灭菌后，无菌条件下按10 000 IU/mL加人青霉素和链霉素。 5.2 仪器设备 5.2.1 高速台式冷冻离心机：要求最大离心力在12 000 r/min以上。 5.2.2 荧光PCR仪。 5.2.3 计算机。 5.2.4 2 'C-8℃冰箱。 5.2.5 一20℃冰箱。 5.2.6 微量加样器：0.5 ftL-10 fiL;5 pL-20 pL;20 N.L^-200 fiL;200 IAL-1 000 p.La 5.2.7 混匀器。 5.2.8 可移动紫外灯：要求近工作台面。 6 样品的采集与前处理 采样过程中样本间不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。 6.1 取样工具 需要下列取样工具： — 棉拭子； — 剪刀、镊子； — Eppendorf管； — 研钵。 以上取样工具必须经 121℃士2 'C,15 min高压灭菌并烘干。 6.2 采样方法 6.2.1 活禽样品 取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法为： 一一 对于咽喉拭子，采取时要深人喉头及上额裂来回刮3次～5次取咽喉分泌液； — 取泄殖腔拭子时，将拭子深人泻殖腔转一圈沾取粪便； 1)由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果，则可使用这些等效产品。 ww w. bz fx w. co m 免费标准下载网(www.freebz.net) 免费标准下载网(www.freebz.net) 无需注册 即可下载 GB/T 19438.3-2004 — 将咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放人盛有1. 0 mI. PBS的Eppendorf管中备用。 6.2.2 肌肉或脏器样品 用无菌的剪刀、镊子取待检样品2. 0 g于研钵中充分研磨，加10 ml. PBS混匀，1 000 g离心10 min 后，取上清液转人Eppendorf管中备用。 6.2.3 血清或血桨 用无菌注射器直接吸取至Eppendorf管内备用。 6.2.4 保存与运送 采集或处理的样本在2 'C-8℃条件下保存应不超过24 h，长期保存须在一70℃以下，但应避免 反复冻融（冻融不超过三次）。 样品采集后，将采集的样品密封并编号，采用保温壶或泡沫箱加冰密封尽快运送到实验室。 7 操作方法 7.1 实验室的设置与管理 实验室的设置与管理见GB/T 19438. 1-2004中附录Co 7.2 样本的制备 7.2.1 在样本制备区进行。 7.2.2 样本的制备程序： 7.2.2.1取n个1. 5 mI，灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之 和，对每个管编号标记。 7.2.2.2 每管加人600川，裂解液，然后分别加人待测样本、阴性对照、阳性对照各200 IiL，一份样本 换用一个吸头；再加人200 p.1.三氯甲烷，混匀器上剧烈震荡混匀5s。于4℃条件下，12 000 r/min离 心15 min, 7.2.2.3 取与7.2.2.1中相同数量的1. 5 ml“灭菌Eppendorf管，加入500 flI_异丙醇(-20 C预冷）， 对每个管编号标记。 7.2.2.4 吸取7.2. 2. 2离心后各管中的上清液转移至已加人异丙醇的相应管中，上清液至少吸取 500川，，不要吸出中间层，颠倒混匀。 7.2.2.5 于4C条件下，12 000 r/min离心15 min,注意固定离心管方向，即将离心管开口朝离心机 转轴方向放置。轻轻倾去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品须在吸水纸不同地方沾干。 7.2.2.6 加入600 pL 75写乙醇，颠倒洗涤。于4℃条件下，12 000 r/min离心15 min。轻轻倾去上清 液，倒置于吸水纸上，沽干液体。 7.2.2.7 4 000 r/min离心10s将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器将其吸干，一份样本换 用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3 min。不宜过于干燥，以免RNA不溶。 7.2.2.8加人11 fcl_ DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA, 2 000 r/.min离心5s，冰上保存备用。 提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，长时间保存，须置于一70℃条件下。 7.3 靶核酸的反转录和扩增 7.3.1 扩增试剂准备与配制 7.3.1.1在反应混合物配制区进行。 7.3.1.2 从试剂盒中取出相应的RT-PCR反应液、Taq酶，待反应液室温下融化后，2 000 r/min离心 5s。设所需PCR反应数为n，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和。每个测试反 应体系需使用15川. RT-PCR反应液及0. 25 p1. Taq酶。计算各试剂的使用量，加人一试管中，向其中 加人0.25Xn颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装 15越.，转移至样本处理区。 7.3.2 加样 7.3.2.1在样本处理区进行。 ww w. bz fx w. co m 免费标准下载网(www.freebz.net) 免费标准下载网(www.freebz.net) 无需注册 即可下载 GB/T 19438.3-2004 7.3.2.2 在各设定的PCR管中分别加人7. 2.2.8制备的RNA溶液各10 IL，盖紧管盖后，500 r/min 离心30”。 7.3.3 荧光RT-PCR反应 7.3.3.1在检测区进行。 7.3.3.2 将7. 3.2.2中加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内并记录样本摆放顺序。 7.3.4 反应参数设置 荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的反应参数为： — 第一阶段，反转录42 0C/30 min; — 第二阶段，预变性92 'C/3 min: — 第三阶段，92 0C/10 s,45 0C/30 s,72 0C/1 min,5个循环； — 第四阶段，92 0C/10 s,60 0C/30 s,40个循环，荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火延伸 时进行。 8 结果判定 8.1 结果分析条件设定 8.1.1 读取检测结果，阑值设定原则以阑值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。 8.1.2 不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。 8.2 质控标准 阴性对照的检测结果应没有特异性扩增，阳性对照的Ct值应小于28.0, 8.3 结果描述及判定 8.3.1 阳性 Ct值小于等于30.0，而且出现明显的扩增线，表明样品中存在H7亚型禽流感病毒。 8.3.2 阴性 无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无H7亚型禽流感病毒。 8，4 有效原则 Ct值大于30.0的样本须重做，重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。 ww w. bz fx w. co m 免费标准下载网(www.freebz.net) 免费标准下载网(www.freebz.net) 无需注册 即可下载 GB/T 19438.3-2004 附 录 A （资料性附录） H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR试剂盒组成、说明、功能及使用时的注意事项 A. 1 试剂盒组成 每个试剂盒（规格为48反应／盒）包括以下成分： 裂解液 30 mLXl盒 DEPC水 1 m1, X 1管 H7亚型禽流感病毒RT-PCR反应液 750衅. X 1管 RT-PCR酶 1颗／管X12管 Taq酶 12 p.L X 1管 阴性对照 1 mL X 1管 阳性对照（非感染性体外转录RNA) 1 ml,X 1管 A. 2 说明 A. 2. 1 裂解液的主要成分为异硫氰酸孤和酚，为RNA提取试剂，外观为红色液体，于4℃保存，其他 试剂保存于一20℃。 A. 2.2 DEPC水，是用1％ DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA. A.2.3 RT-PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。 A. 3 使用时的注意事项 A. 3. 1 由于阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染。 A. 3.2 反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。 A.3.3 RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活，必须在室温条件下置于干燥器内保存，使用时取出所需数量， 剩余部分立即放回干燥器中。 ww w. bz fx w. co m 免费标准下载网(www.freebz.net) 免费标准下载网(www.freebz.net) 无需注册 即可下载