中国医疗器械杂志

文章编号 :1000 - 6974 (2000) 05 - 0289 - 06 膜片钳技术(三) 细胞分泌活动的实时监测技术 张春光 ,瞿安连 ,康华光 华中科技大学生物物理与生物化学研究所 , (湖北 ,武汉 ,430074) 　　提要 　分泌活动是神经元和内分泌细胞进行化学通信的基本模式。各种研究细胞分泌活动的生物物理 技术的发展极大地加深了人们对细胞分泌机制的了解。简要介绍三种新近发展起来的实时监测细胞分泌活 动的生物物理技术。 　　提要 　细胞分泌 ;实时监测技术 ;荧光成像显微镜技术 ;膜电容监测技术 ;电化学技术 　　中图分类号 :Q6 - 33 　　　文献标识码 :A Real - time Techniques in Monitoring Secretion Activity in Cells ZHAN G Chun2guang ,QU An2lian , KAN G Hua2guang Huazhong University of Science and Technology 　　Abstract　Chemical communication for neurons and endocrine cells depends on their secretion activity. Development of variety of biophysical techniques have greatly promoted the understanding of the mechanism of cellular secretion. Here we will introduce three recently developed biophysical techniques which have been frequently used to monitor secretion activity in real - time. 　　Key words 　celluar secretion ,real - time monitoring technique ,fluorescent video microscopy ,membrane capaci2 tance technique ,electrochemistry technique. 　　分泌活动是细胞的一项重要生理功能 ,是 许多不同种类的细胞与其周围环境进行通信 的重要方式。特别是在神经和内分泌系统中 , 它是神经元和内分泌细胞与其它组织细胞进 行化学通信的基本模式 ,因此人们对揭示分泌 的生物化学与生物物理机制很感兴趣。这直 接导致了许多细胞分泌检测技术的出现。 　　早期人们对细胞分泌机制的研究主要采 用冰冻刻蚀电镜技术和普通光学显微镜技术 , 研究方法主要是非现场静态观察。近十年来 , 细胞分泌的监测技术得到了迅速的发展 ,尤其 是各种实时监测技术的发展 ,极大地增加了人 们对细胞分泌机制的了解。有关细胞分泌检 测技术的内容很多 ,由于篇幅所限 ,下面就目 前常用的三种细胞分泌实时检测技术的原理、 方法、应用范围以及优缺点作简要介绍。 1 . 荧光成像显微镜技术 　　在荧光显微镜技术出现之前 ,人们也曾用 普通光学显微镜技术来监测含特大囊泡细胞 的分泌过程。然而 ,普通光学显微镜的分辨率 受到衍射极限限制 ,不能监测小囊泡细胞的分 泌。近年来共聚焦荧光显微镜技术的发展使 实时监测小囊泡细胞的分泌成为可能。 　　根据激发光的特点 ,共聚焦荧光显微镜 可分为普通共聚焦荧光显微镜、激光共聚焦 荧光显微镜和多光子荧光显微镜[1 ] (表 1) 。 表 1 　共聚焦荧光显微镜的分类和特点 荧光显微镜 类型 光　源 检测器 成像方式 普通荧 光显微镜 单色光源 , 如氙灯 CCD 照相机 CCD 二维成像 + Z轴扫描 激光荧 光显微镜 普通激光器 光电倍增管 X - Y - Z三维扫描 CCD 照相机 CCD 二维成像 + Z轴扫描 多光子荧 光显微镜 ps 或 fs 激光器 光电倍增管 X - Y - Z 三维扫描 ·982· 　2000 年 24 卷第 5 期　　　　　　　　　　　　　 　　　　中国医疗器械杂志 Chinese Journal of Medical Instrumentation 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 © 1995-2007 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 　　如图 1a 所示 ,在显微镜腔的中部有一个 双束分离器 ( dichroic beamsplitter) 。激发光 (excitation light ) 以垂直于发射光的方向进 入显微镜后被双光束分离器全部反射到标本 上 ,由此产生的荧光即发射光 ( emission light)则能完全透过它进入检测器中。为了 获得合格的激发光 ,从光源出来的光在进入 显微镜之前必须经过严格的滤波、聚焦、延迟 等处理。因此光路的和滤光片 (filter) 的 选择是很关键的问题。同样 ,发射光在进入 检测器之前也要经过严格滤波和聚焦处理。 如表 1 所示 ,普通共聚焦荧光显微镜使用普 通单色光源 ,因此其检测和成像装置普遍采 用 CCD 照相机 ;普通激光共聚焦荧光显微镜 以激光为光源 ,检测和成像装置采用 CCD 照 相机或者多个光电倍增管 ( PM T) 加 X - Y 扫描器 (旋转反射镜) ;多光子荧光显微镜以 皮秒 (ps) 或飞秒 (fs) 激光器为光源 ,检测和 成像装置普遍采用多个光电倍增管加 X - Y 扫描头。在多光子荧光显微镜技术中 ,一个 分子必须同时吸收两个或三个光子才能产生 一个荧光光子。因此多光子荧光显微镜技术 必须采用 ps(10 - 12 s) 或 fs (10 - 15 s) 激光器作 为光源 ,激发光波长 (λ) 在红外或近红外区 , 而发射光波长 ( Ελ/ n ,n 为吸收的光子数) 在 可见及近紫外区 (图 1b) 。 图 1 (a)激光扫描共聚焦荧光显微镜结构示意图 图 1 (b)多光子荧光显微镜机构示意图 　　用荧光显微镜技术进行观察的一个先决 条件是被研究对象必须在受到激发后能发射 荧光。如果分泌物或囊泡内物质本身具有荧 光 ,就可用荧光显微镜对其胞吐分泌过程进 行直接观察。5 - HT 就是这样的一种物质 , 它在肥大细胞中的胞吐过程可直接观察到。 在 RBL 细胞的 5 - HT 储库检测表明 ,三光 子技术更适合于这方面的研究 ,因为它能量 低 ,对细胞损伤小 ,能进行长时间观察[2 ] 。 　　然而在大多数情况下 ,囊泡本身是没有 荧光的 ,必须用荧光染料或荧光探针对囊泡 膜或囊泡内物质进行预先标记。目前在囊泡 分泌研究中常用的荧光标记方法有以下几 种 : 　　(1) 　免疫荧光标记[3 ] 　该技术可用来 定量分析与胞吐有关的形态变化和蛋白运 动。例如 ,多巴胺β羟化酶 (DBH) 在嗜铬细 胞分泌囊泡中是一种主要的膜蛋白 ,由于它 在胞吐中会出现在细胞膜的表面 ,随着它与 胞外液中荧光标记的 DBH 抗体的结合 ,就能 观察到胞吐位点在细胞膜上的分布以及囊泡 膜的回收过程。 　　(2) 　荧光染料标记[425 ] 　有两种方法 , 一是使用能选择性地标记膜表面的荧光标记 物 ,如 styryl dye FM1 - 43 和 FM4 - 64。由于 这种染料在水相中没有荧光 ,但是当它嵌入 脂质膜后显示较强的荧光 ,因此 ,当细胞外液 中存在此染料时 ,融合到胞浆上的囊泡膜会 ·092·　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中国医疗器械杂志Chinese Journal of Medical Instrumentation 　　　　　　　　　　　　　 　2000 年　 24 卷第 5 期 © 1995-2007 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 使细胞表面荧光增加 ,通过胞吞回收的囊泡 因吞进此染料而被荧光标记 (图 2a) 。因此 利用此染料标记细胞后能够实时观察细胞的 胞吐及胞吞过程。二是使用丫啶橙 (acridine orange)负载嗜铬细胞。因它只在酸性环境 中才有荧光 ,因此胞吐后囊泡荧光会消失。 用全内反射显微镜跟踪囊泡的移动过程 ,就 可实现对囊泡转运、停定、锚定和分泌的整个 过程机制的研究。 图 2a 利用囊泡对 FM1 - 43 荧光染料的摄取能力来研 究不同神经末梢的生理功能。(A1) FM1 - 43 染色标 记 , (A2) FM1 - 43 和 Texas Red 双染色标记。 图 2b 激光扫描共聚焦荧光显微镜跟踪 INS - 1 细胞中 phogrin - e GFP 标记囊泡的运动。(B1) 外液中含 3mM glucose , (B2)外液中含 30mM glu2 cose. 图中标尺为 2μm。上图为某一时刻囊泡所 处的空间位置 ,下图为囊泡的运动轨迹。 　　(3) 　绿荧光蛋白 ( GFP)标记[627 ] 　通过 基因转染方法将 GFP 基因转入标本细胞中 并使它在囊泡中特异性表达 ,用激光扫描共 聚焦荧光显微镜特别是多光子荧光显微镜可 监测囊泡的运动过程。例如将 GFP 基因与 囊泡特异的蛋白基因 (如嗜铬颗粒蛋白 B、神 经肽 Y、phogrin 或 proinsulin 基因) 整合在一 起并转入 PC12 细胞或胰岛 INS - 1 β- 细 胞中进行表达 ,用激光扫描共聚焦显微镜或 多光子显微镜就能够时间分辨地追踪分泌囊 泡的转移、入坞和胞吐过程 (图 2b) 　　用荧光成像显微镜技术监测细胞的分泌 活动具有如下优点 : ①非侵入性检测 ,对细胞 没有损伤 ; ②由于使用动态成像检测技术 ,给 人的感觉更直观、逼真。③通过长时间三维 立体成像 ,不仅可观察囊泡从转运到与细胞 膜融合的整个过程 ,还可观察囊泡的回收过 程。④多光子技术 ,空间分辨率高 ,能进行长 时间实时动态监测。缺点是 : ①不能检测囊 泡中信息物质的化学性质和量子含量 ; ②时 间分辨率不够高 ,不能检测囊泡与细胞膜融 合瞬间的动力学过程。 2 . 细胞膜电容检测技术 　　在全细胞记录模式下 (具体方法见本讲 座二) ,电极与细胞构成如图 3 所示的等效电 路[10 ] 。细胞膜在等效电路中相当于一个电 容器 ( Cm ) 与一个电阻 ( R m ) 并联。由于细胞 分泌的最后一步是囊泡膜与胞浆膜融合的过 图 3 膜电容检测时细胞的等效电路图。RS 、 R m、Cm 、Cp 和 Er 分别代表串联电阻、膜 电阻、膜电容、电极电容和膜电位。 ·192· 　2000 年 24 卷第 5 期　　　　　　　　　　　　　 　　　　中国医疗器械杂志 Chinese Journal of Medical Instrumentation 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 © 1995-2007 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 程。因此当分泌发生时细胞膜的表面积会增 加。又由于细胞膜的电容大小正比于细胞膜 的表面积 (～1μF/ cm 2) ,因此囊泡与细胞膜 的融合引起细胞膜电容的增加。 　　目前 ,膜电容的监测普遍采用 DC + 正弦 信号分析法[829 ] 。如图 4a 所示 ,其具体方法 是在外加保持电压上叠加正弦波激励电压 (频率 0. 3 - 1. 5kHZ ,振幅 10 - 25mV) 。在 正弦波激励电压的前后或中途可插入一个引 起细胞分泌的刺激信号 ,如去极化、光解释放 的钙离子和激动剂刺激等[10212 ] (图 4) 。通过 “相敏检测器”对由此产生的电流正弦波进行 分析 ,就可估算出细胞膜电容的变化。由于 采用软件法进行相角补偿 ,因此相角的设置 很重要 ,必须通过预实验对相角的变化进行 正确地估计。通常在膜电容记录之前通过电 流放大器的内部等效电路对串联电导 Gs ( Rs 的倒数) 和慢电容 Cslow (主要是膜电容 Cm ) 进行自动补偿和估计。如果等效电路与实际 细胞的电特性不相符合 ,也会使测量结果产 生误差。比如对于有突起的神经元 ,其等效 电路比图 3 更复杂。通常情况下串联电导 Gs 对膜电容的计算影响最大 ,因此在监测膜 电容变化的同时要监测 Gs 的变化。只有当 Gs 变化很小时 ,所记录的膜电容变化才是可 靠的。一般地 ,当 Rm > 1 GΩ或远远大于 Rs (～10MΩ)时 ,膜电位 Er 的变化对膜电容的 估计影响很小 ,因此为了使 R m 值最大通常 将 Er 设置在零电流电位。 　　现在 ,膜电容监测技术能够分辨单个囊 泡与细胞膜融合引起的膜电容变化。对囊泡 融合的时间分辨率达毫秒级。由于胞吐后囊 泡膜的回收会导致膜电容的减少 ,因此采用 毫秒事件分辨率的膜电容检测技术能提供囊 泡膜从融合到回收整个过程的详细信息。近 十年来 ,全膜电容检测技术在研究细胞胞吐 和胞吞机制方面得到了越来越广泛的应用 , 取得了丰硕的研究成果。 　　用膜片钳技术监测细胞分泌的优点是 : (a) 电压去极化刺激引起耳蜗内毛细胞膜电容增 加。正弦波刺激电压幅度为 20mV , 频率为 1kHz ,去极化电压为 - 50mV , 钳制电压为 - 80mV。 (b) 光解笼型化合物 DN - nitrophen 释放 的钙引起 PC12 细胞膜电容的增加 图 4 细胞分泌活动的膜电容监测。 ①能定量监测细胞释放的囊泡总量 ; ②不管 是慢的还是快的释放过程 ,均可以用它来监 测 ; ③无论囊泡中的信息物质是什么 ,都可以 用它来检测。缺点是 : ①不能排除胞吞对胞 吐检测的影响 ; ②不能分辨直径小于 200nm 的单个囊泡与细胞膜的融合过程 ; ③等效电 路中 Rs 和 R m 的较大变化会影响膜电容的 正确估算。由于离子通道激活后 R m 与激活 电压成非线性依赖关系 ,因此在离子通道激 活期间无法正确估算膜电容的变化。 3 . 电化学技术 　　用电化学技术监测细胞分泌的原理是 : 当电极尖端临近存在容易氧化的化学信使物 质时 ,它们可通过扩散到达电极表面。这时 如果在电极尖端施加一定的电压 ,这些信使 物质就会在电极尖端释放出电子而发生氧 化 ,电极可俘获释出的电子并在电路中产生 一定的电流 (图 5a) 。通过电流放大器和计 算机就可监测电极上氧化电流的变化。由于 ·292·　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中国医疗器械杂志Chinese Journal of Medical Instrumentation 　　　　　　　　　　　　　 　2000 年　 24 卷第 5 期 © 1995-2007 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 不同物质的氧化电位不同 ,因此电化学技术 能在一定程度上鉴别细胞释放的信息物质的 化学性质 ,具有一定的选择性。目前用电化 学方法可检测的激素或递质有 :儿茶酚胺、5 - HT、胰岛素、组胺、NO 以及含色氨酸或酪 氨酸残基的多肽等。 (a)电化学技术监测细胞分泌的示意图 (b)用 CFE 检测到的由 60mM 高钾刺激诱发的 嗜铬细胞分泌的电流峰 图 5 细胞分泌活动的电化学检测 　　根据施加电压的波形 ,电化学技术可分 为恒电位法和高速循环伏安法。在恒电位法 中 ,电极电压保持恒定 ,而在高速循环伏安法 中 ,电极电压以三角波形式周期性地扫描 ,扫 描速率在 800V/ s 以上。恒电位法的优点是 它提供了敏锐的时间分辨率。但是 ,它不能 提供有关被测物质化学性质的信息。在高速 循环伏安法中 ,虽然时间分辨率较低 ,却能提 供信息分子的化学信息。因此恒电位法和高 速循环伏安法两种技术提供了互补的信息而 且在单细胞胞吐中应该同时应用。 　　在单细胞电化学实验中 ,微电极一般用 半径 2. 5～5μm 的碳纤维制作。它被包裹在 拉制的玻璃毛细管或合适的绝缘材料中。电 极尖端最好切成斜面以增大表面积。电极尖 端表面的大小应该与细胞大小相近。在正常 的生理溶液中 ,微电极的时间常数为μs 级。 微电极的电流大小与电极尖端面积和实验类 型有关 ,一般在 pA 到 nA 范围。因此 ,通常 采用象膜片钳放大器那种具有低噪声的仪器 来检测。 　　在分泌检测实验中 ,通常将碳纤微电极 取代玻璃微电极安置在合适的三维微操纵器 上 ,使微电极尽量靠近培养皿中的单个细胞 (距离一般 < 2μm) 。由于微电极表面靠近分 泌细胞 ,所以微电极能俘获由电极敏感头下 方的细胞区域释放的激素或递质 ,记录到簇 发式的峰状电流 (图 5b) 。根据法拉第电解 定律 ,对恒电位检测时的单个分泌电流峰积 分即可估算出每个囊泡中包含的递质分子 数 ,即量子包装的大小。微电极电化学技术 具有良好的时间和空间分辨率 ,最适合于单 个细胞胞吐的高分辨检测[13215 ] 。在牛的肾 上腺髓质嗜铬细胞上的实验第一次显示微电 极能够测量单个细胞的分泌。每个嗜铬细胞 包含大约 150fmol 儿茶酚胺 ,分布在 30 ,000 个囊泡中[15 ] 。 　　电化学技术监测分泌的优点是 : ①时间 分辨率高达 ms 级 ,能监测单个囊泡的释放 以及囊泡中的递质含量 ; ②能鉴别信息物质 的化学性质 ; ③对细胞无损伤 ,可进行长时间 监测。其缺点是 : ①只能监测细胞局部释放 的信息物质 ; ②被监测物质必须在电极上容 易释出或获得电子 , 因此不能直接监测 ACh、Glutamate、GABA 等递质的释放 ; ③电 极敏感头容易吸附污染物而使灵敏度下降 , 因此电极使用时间不能太长。 4 . 小结 ●　细胞的分泌活动是神经和内分泌细胞与 其它组织细胞进行化学通信的基本模式。 ●　目前常用的细胞分泌实时检测技术主要 有共聚焦荧光成像显微镜技术、膜电容检测 技术和电化学检测技术。用荧光成像显微镜 ·392· 　2000 年 24 卷第 5 期　　　　　　　　　　　　　 　　　　中国医疗器械杂志 Chinese Journal of Medical Instrumentation 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 © 1995-2007 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 技术监测细胞的分泌活动的必要条件是囊泡 必须能发射荧光。当囊泡本身没有荧光时 , 必须对囊泡进行荧光标记。标记方法有 :免 疫荧光标记、荧光染料标记和通过基因转染 方法的 GFP 标记。 ●　分泌时囊泡与细胞膜的融合导致细胞膜 表面积和膜电容的增加。细胞膜电容的检测 通常采用 DC + 正弦电压信号分析法。一般 地 ,当膜电阻 R m > 1 GΩ时 ,主要考虑串联电 导 Gs 对膜电容的影响。 ●　用电化学技术检测细胞分泌的必要条件 是囊泡释放的物质必须容易在电极被氧化。 电化学检测通常采用恒电位技术 ,它具有很 高的时间分辨率 ,对电流峰进行积分即可估 算出囊泡中激素或递质的含量。 ●　上述三种实时检测技术各有优缺点。三 种技术的联合运用已成为一种发展趋势。例 如膜电容监测技术检测的是整个细胞膜电容 的净变化 ,受胞吞的干扰 ;而电化学技术检测 的是局部囊泡释放的递质的量 ,不受胞吞的 影响 ;两者具有很强的互补性。 参 　考 　文 　献 [1 ] Kasten , F. H. The origins of modern fluorescence mi2 croscopy and fluorescent probes. In : Cell Structure and Function by Microspectrophotometry ( E. Kohen and J . G. Hirschberg , eds. ) . Academic Press , San Diego , CA. 1989 [2 ] Maiti S et al. Measuring serotonin distribution in live cells with three - photon excitation. Science ,1997 ;275 :530 - 532. [3] Betz WJ et al. Imaging exocytosis and endocytosis. Curr. Opin Neurobiol. 1996 ;6 :365 - 371. [ 4 ] Steyer JA et al. 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(上接第 288 页) 术的发现 ,开创了一个低温消毒的新领域 ,这 方面的开发及应用逐渐受到重视。约自 90 年代起 ,由此发展的消毒系统进入商业领域 , 在一些发达国家和地区 ,已有相当的医疗机 构开始应用该类装置。而目前我国此类消毒 系统的产品开发、引进和在医疗机构的应用 均处于空白 ,值得国内专业研究人员、技术开 发人员关注。 ·492·　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中国医疗器械杂志Chinese Journal of Medical Instrumentation 　　　　　　　　　　　　　 　2000 年　 24 卷第 5 期 © 1995-2007 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.