bFGF诱导人晶状体上皮细胞增殖过程中细胞外信号调节激酶的作用

bFGF诱导人晶状体上皮细胞增殖过程中细胞外信号调节激酶的作用 bFGF诱导人晶状体上皮细胞增殖过程中细胞外信号调节激酶的作用 作者：孔 珺1,孔 玮2,汪亚伦3,张雪岩1, 张劲松1 作者单位：中国辽宁省教育厅科技攻关资助项目(No.05L564) 1(110005)中国辽宁省沈阳市，中国医科大学附属第四医院眼科 辽宁省高校晶状体重点实验室; 2(110005)中国辽宁省沈阳市，中国医科大学附属第四医院眼科 沈阳市第四人民医院眼科;3(110034)中国辽宁省沈阳市，沈阳医学院生化教研室 【摘要】 目的：检测细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase,ERK)在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)诱导的人晶状体上皮细胞增殖过程中的表达与活化;检测ERK1/2特异性阻断剂PD98059对人晶状体上皮细胞增殖的影响。方法：人晶状体上皮细胞系SRA01/04体外培养，采用MTT比色法和[3H]TdR掺入法检测ERK阻断剂PD98059对人晶状体上皮细胞活力和DNA合成的影响;Western blot法测定bFGF对培养的人晶状体上皮细胞ERK,cJun氨基末端激酶(JNK),P38蛋白表达及PD98059对环氧合酶2(COX2)表达的影响。结果：10μg/L bFGF能显著刺激人晶状体上皮细胞增生，1μmol/L PD98059 即能显著抑制bFGF启动的HLEC增殖，其效应呈浓度依赖性(P<0.01)。10μg/L bFGF可激活ERK信号通路, 诱导COX2蛋白表达，其效应在30min内达到高峰，6h后逐渐减弱，此作用可被10μmol/L PD98059阻断;10μg/L bFGF对非磷酸化ERK,磷酸化和非磷酸化JNK及P38表达无明显影响。结论：有丝分裂原活性蛋白激酶信号传导通路中ERK磷酸化对bFGF启动的人晶状体上皮细胞增殖具有重要的调节作用。 【关键词】 晶状体上皮细胞;ERK;COX2;PD98059;抑制 　Activation of extracellular regulated kinase in the proliferation process of human lens epithelial cells induced by bFGF 　　Jun Kong1, Wei Kong2, YaLun Wang3, XueYan Zhang1, JinSong Zhang1 　　Foundation item:Key Problems Foundation in Science and Technology of the Department of Education of Liaoning Province,China(No.05L564) 　　1Department of Ophthalmology, the 4th Affiliated Hospital of China Medical University; Lens Key Lab of Institution of Higher Learning of Liaoning Province, Shenyang 110005, Liaoning Province,China; 2Department of Ophthalmology, the 4th Peoples Hospital, Shenyang 110005, Liaoning Province,China; 3Department of Biochemistry, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, Liaoning Province,China 　　AbstractAIM: To investigate MAPKsERK signal transduction in the proliferation process of human lens epithelial cell (HLEC) induced by basic fibroblast growth factor (bFGF) and to detect the inhibition effect of ERKs blocker PD98059 on the proliferation of HLEC.METHODS: HLEC line SRA01/04 was cultured in vitro. MTT and [3H]thymidine incorporation were used to observe the inhibition effect of PD98059 on the cultured cells and the synthesis of DNA. Westernblot was employed to detect the expression ERK1/2, JNK, P38 and COX2 protein in HLEC.RESULTS: PD98059 treatment at different concentrations (1,5,10μmol/L) resulted in significantly inhibition on cell proliferation and DNA synthesis of HLEC induced by bFGF in a dosedependent manner. The results of Westernblot showed that expression of phosphoERK1/2 protein increased in HLEC after treated with 10μg/L bFGF in a timedependent manner, and negative effect occured after cotreated with 10μmol/L PD98059. bFGF at 10μg/L concentration had no impact on the expression level of nonphosphoERK1/2, JNK and P38 protein.CONCLUSION: The phosphorERK is an important regulator of the signal transdution in the proliferation process of HLEC induced by bFGF. 　KEYWORDS: human lens epithelial cell; extracellular regulated kinase; cyclooxygenase2; PD98059; inhibition 　　Kong J, Kong W, Wang YL, et al. Activation of extracellular regulated kinase in the proliferation process of human lens epithelial cells induced by bFGF. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi) 2009;9(9):16651667 　0引言 　　细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase,ERK)是有丝裂原活性蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases，MAPK)家族5个亚类之一[1,2]。ERK可被生长因子、激素、神经递质、细胞应激反应等激活, 在细胞生长、发育、分裂、死亡及恶性转化过程中发挥重要作用[3]。ERK在多种眼组织中有分布，参与了眼的生理和病理过程。我们以往的研究表明碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)可通过激活细胞内多种信号传导途径启动晶状体上皮细胞的增殖、移行及纤维化[4,5]。我们研究细胞外信号调节激酶在bFGF诱导的人晶状体上皮细胞增殖过程中的表达与活化;检测ERK1/2特异性阻断剂PD98059对人晶状体上皮细胞增殖的影响，其结果有助于进一步阐释后发性白内障形成的相关信号传导机制。 　　1材料和方法 　　1.1材料 人晶状体上皮细胞(HLEC)系SRA01/04细胞。NAPCO 5410型CO2培养箱(美国);苏州净化设备厂超净工作台;倒置相差显微镜 OLYMPUS IMT2;BioRAD PAC 3000 型电泳仪;HermleZ383K型低温高速离心机;Kodak1D型凝胶自动成像系统;美国BeckMan LS 3801型液闪仪;奥地利泰肯公司Sunrise Remote酶标仪。DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶及Trizol 试剂盒均为Gibco公司生产;bFGF(Sigma);SP免疫组化试剂盒、兔抗人环氧合酶2(COX2)多克隆抗体和生物素标记的羊抗兔IgG抗体(北京中山生物技术有限公司);[3H]TdR(北京原子能公司);MAPKs试剂盒及碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体(Santa Cruz公司);PD98059(Promega);其它试剂均为分析纯试剂。PD98059药液的配制：用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配成20mmol/L和10mmol/L储存液，用DMEM稀释至1，5，10μmol/L，20℃保存备用。 　　1.2方法 参照曲勃等[3]方法进行解冻和传代培养人晶状体上皮细胞系SRA01/04。取对数生长期的SRA01/04细胞，用2.5g/L胰酶消化后，制成单细胞悬液。用含150mL/L胎牛血清DMEM培养液调整细胞密度至2×108/L，分别接种于96孔培养板和24孔培养板中，继续培养24h后，换无血清培养液培养12h，使细胞进入生长停止期。用含10μg/L bFGF处理细胞24h，处理前1h分别加入不同浓度的PD98059干预细胞，依次进行细胞活力检测和DNA合成检测。实验分为空白组(无血清培养液)、对照组(bFGF组)、bFGF+PD1组、bFGF+PD2组、bFGF+PD3组，bFGF的浓度为10μg/L，PD1，PD2，PD3组的浓度依次为1，5，10μmol/L PD98059。 　　1.2.1细胞活力的检测 将SRA01/04细胞按每孔200μL接种于96 孔培养板中，每一浓度设6个复孔，继续培养24h。然后每孔加入5g/L MTT 溶液20μL继续孵育4h后终止培养。吸弃孔中的培养液, 加入二甲基亚砜溶液150μL,室温下微量振荡器振荡10min，用酶联免疫检测仪于492nm处测定吸光度A值。按公式[1(ca)÷(ba)]×100%计算细胞抑制率，以只加培养液不加细胞的空白对照孔调零。 　　1.2.2 DNA合成的检测 将SRA01/04细胞按每孔1mL接种于24孔培养板中，每一浓度设3个复孔，继续培养24h。处理结束前3h每孔加入1.4kBg [3H]TdR。处理结束后冷PBS洗2次，加2mL的100g/L三氯乙酸(TCA)，放置10min，若细胞松散，加甲醇固定10min;100g/L TCA洗2次×5min，沉淀DNA;每孔加入0.3mmol/L NaOH 0.5mL，在60℃条件下处理细胞30min，冷却至室温，收集细胞至乙酸纤维素膜上，烤干，将乙酸纤维素膜置于闪烁计数管中，每管加闪烁液10mL，闪烁仪测定半分钟脉冲数(cpm值);结果以cpm/5000细胞表示。 　　1.2.3 ERK1/2，P38，JNK蛋白表达的检测 含10μg/L bFGF无血清培养液孵育细胞，对照组使用不含bFGF的无血清培养液，孵育时间分别为5，15，30，60，180，360min。终止培养后，用冰冷的0.02mol/L PBS冲洗细胞3次，置于冰盒上，用细胞刮取器刮下细胞，离心，加入裂解液(2mmol/L EDTA，10mmol/L EGTA，20mmol/L TrisHCL pH7.5，2mmol/L PMSF，0.25mol/L蔗糖)300μL，超声粉碎，4℃离心，17500r/min离心2h;将蛋白样品用120g/L SDSPAGE分离而后电转移至硝酸纤维素膜上，含50g/L牛血清白蛋白的 TTBS封闭1h，加上特异性一抗(1∶400)4℃过夜,TBS洗10min×4次，加入碱性磷酸酶(1∶2000)室温孵育2h，加入显色剂;硝酸纤维素膜经Kodak1D型凝胶自动成像扫描仪分析,光密度。实验重复3次。 　　1.2.4 PD98059及阿司匹林对bFGF刺激下人晶状体上皮细胞COX2蛋白和磷酸化ERK1/2蛋白表达的影响 取对数生长期的SRA01/04细胞，用2.5g/L胰酶消化后制成单细胞悬液。用含150g/L FCS的DMEM培养液调整细胞密度至2×108/L，培养24h后换无血清培养液，加入10μmol/L PD98059或10mmol/L阿司匹林预处理细胞1h后，加入10μg/L bFGF继续孵育细胞6h，检测COX2和磷酸化ERK1/2蛋白的表达。实验分为对照组(无血清组)，bFGF组，bFGF+ PD组，bFGF+阿司匹林组，具体实验步骤同上。 　　统计学分析：SPSS 10.0统计软件包进行数据处理，均数比较采用Student t检验。 　　2结果 　　2.1人晶状体上皮细胞的增殖 10μg/L bFGF对人晶状体上皮细胞增殖具有明显促进作用(A:1.1±0.13 vs 0.75±0.05, P<0.01)。1μmol/L PD98059即可抑制bFGF启动的人晶状体上皮细胞增殖，具有显著统计学意义(vs A 0.74±0.04, P<0.01)，且抑制效应呈浓度依赖性(vs A 0.64±0.05, 0.44±0.03,P<0.01)。 　　2.2人晶状体上皮细胞 DNA的合成 10μg/L bFGF与0,1,5,10μmol/L PD98059共同孵育24h后，[3H]TdR掺入的结果分别为1 815，923，667，557cpm/5 000个细胞，人晶状体上皮细胞的DNA合成明显受到抑制，1μmol/L PD98059对bFGF启动的人晶状体上皮细胞DNA合成抑制率达48.6%，且抑制效应呈浓度依赖性。 　　2.3 ERK1/2,P38,JNK表达蛋白 Western blot检测结果显示，人晶状体上皮细胞(HLEC)体外培养过程中磷酸化和非磷酸化ERK有一定水平的基础表达。当给予10μg/L bFGF刺激时，磷酸化ERK蛋白电泳条带随bFGF作用时间的延长而逐渐颜色加深，30min达到最高峰，持续6h后减弱(图1A)，而非磷酸化ERK表达无明显变化(图1B)。人晶状体上皮细胞体外培养过程中磷酸化P38蛋白及非磷酸化P38均有一定表达。当给予10μg/L bFGF刺激后，磷酸化和非磷酸化P38 蛋白表达没有显著变化(图1C, D)。人晶状体上皮细胞体外培养过程中cJun氨基末端激酶(JNK)有一定水平的基础表达。当给予10μg/L bFGF刺激后，其表达水平在0～6h各时间段均未见上调。 　　2.4 COX2蛋白和磷酸化ERK1/2蛋白的表达Western blot检测结果 显示10μg/L bFGF作用后人晶状体上皮细胞出现COX2蛋白表达的条带，10μmol/L PD98059与10μg/L bFGF共同作用下COX2蛋白表达水平降低(图2A)，磷酸化ERK1/2蛋白表达呈阴性(图2B)。10mmol/L阿司匹林与10μg/L bFGF共同作用下COX2蛋白表达呈阴性(图2A)，磷酸化ERK1/2蛋白表达略降低(图2B)。 　　图1bFGF对ERK1/2和P38蛋白表达的影响 A:磷酸化ERK1/2;B:非磷酸化ERK1/2;C:磷酸化P38;D:非磷酸化P38 　　图2: PD98059及阿司匹林对HLEC COX2和磷酸化ERK1/2蛋白表达的影响 N:空白组，F:bFGF组，PD: bFGF+ PD98059组，AS:bFGF+阿司匹林组 A:COX2;B: ERK1/2 　　3讨论 　　晶状体囊膜赤道部残留的晶状体上皮细胞增殖、迁移、分化是后发性白内障形成的主要原因[6]。大量研究证明，bFGF与后发性白内障的形成密切相关[7,8]。白内障囊外摘除术中前囊膜及血房水屏障的破坏可导致眼前房bFGF的浓度大幅度升高。此外，生理状态下被前囊膜覆盖的晶状体上皮细胞一旦暴露于房水中，房水中正常存在的bFGF 浓度就足以促进晶状体上皮细胞增殖、移行、分化。目前bFGF启动的晶状体上皮细胞内信号传导机制尚不十分清楚。MAPK与细胞生长最密切也是近年研究最多的通路[9]。其中ERK1/2是MAPK家族的主要成员之一，参与调节细胞骨架、细胞生长及分化等，是信号转导通路的中枢部分[10]。ERK1/2以非磷酸化形式存在于胞质中，磷酸化后被激活，进而激活下游信号分子构成复杂的信号传导网络，产生生物学效应。ERK通路通过以下4条途径激活：(1)受体酪氨酸激酶Ras的激活[10];(2)Ca2+对Ras的激活[11];(3)蛋白激酶C对ERK通路的活化[12];(4)G蛋白偶联受体对ERK通路的激活[13]。我们以往的研究证实bFGF可诱导家兔晶状体上皮细胞酪氨酸蛋白激酶及蛋白激酶C磷酸化[14];bFGF通过激活酪氨酸激酶信号系统途径引起人晶状体上皮细胞内Ca2+浓度升高[5]。而酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶C, Ca2+均为ERK通路的上游启动因子。我们证实，bFGF作用后人晶状体上皮细胞磷酸化ERK1/2水平明显升高，此效应在作用30min时达到峰值，6h后逐渐减弱;COX2是这一通路的下游信号分子之一，而作为有丝裂原活性蛋白激酶家族的另一重要成员P38及有丝裂原活性蛋白激酶的靶蛋白之一JNK未参与此过程。本结果还表明，不同浓度的ERK特异性阻断剂PD98059可显著抑制bFGF启动的人晶状体上皮细胞增殖及COX2蛋白表达。PD98059本身不直接影响COX2的活性, COX2 表达量的降低可能是阻断ERK的结果。特异性地抑制ERK的磷酸化可阻止细胞外刺激信号转导至人晶状体上皮细胞及其核内，从而影响细胞的增殖、分化、转化或凋亡等一系列生物学效应。COX非选择性抑制剂阿司匹林可完全阻断bFGF启动的人晶状体上皮细胞COX2蛋白表达增高，对磷酸化ERK1/2表达也具有一定抑制作用，提示COX2作为ERK1/2磷酸化的下游分子对ERK1/2磷酸化具有反馈调节作用。我们也观察到，虽然PD98059对人晶状体上皮细胞的抑制作用随浓度的升高而增强，表现出浓度依赖性，但PD98059不能完全的抑制人晶状体上皮细胞的增殖。这可能是bFGF激活的人晶状体上皮细胞增殖过程涉及了多途径的复杂信号传导途径，ERK只是下游效应分子之一。 　　从信号传导通路入手探讨后发性白内障的发生机制受到越来越多的关注。深入研究后发性白内障发生的信号传导系统不仅能进一步阐明后发性白内障的发病机制，还可为开辟后发性白内障治疗的新途径提供理论和实验依据。关于多种生长因子、细胞因子及炎症介质启动的白内障术后晶状体上皮细胞异常增殖、移行、纤维化过程中所涉及的庞大而复杂的信号传导系统有待于我们进一步深入探索。 【参考文献】 　1 Ohori M. 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