(重要)何首乌中二苯乙烯苷的醇提工艺()

何首乌中二苯乙烯苷的醇提 吕丽爽 汤 坚 （江南大学食品学院，无锡，!"#$%&） 摘 要 探索了从何首乌中提取二苯乙烯苷的工艺流程。在比较不同提取的基础上 ，确定选 用乙醇为提取溶剂。通过单因素和中心组合实验，对影响何首乌中二苯乙烯苷提取的因素进行了 探讨和研究，运用响应面法确定了提取工艺的最优化条件：料液比（’()*）为"(+，提取时间为 &&),-，乙醇体积分数为&"."/，提取次数为!次。在此条件下，二苯乙烯苷的得率可达&.%+/。 关键词 何首乌，二苯乙烯苷，提取 第一作者：博士研究生，讲师。 收稿时间：!$$#0$&0$1，改回时间：!$$#0$20"" 何首乌!"#$%"&’((’#)*+#",’( 345-6， 为蓼科多年生草本植物何首乌的块根［"］。自古 以来，何首乌被人们认为具有益寿延年、延缓衰 老之功效，系著名的滋补中药。现代医学表明， 何首乌具有增强免疫功能，抗氧化作用，延缓大 脑衰老，提高789修复功能，延长寿命，降低 胆固醇，改善脂肪代谢等多项功能［%，#］。 二苯乙烯苷是何首乌中特有的生物活性成 分，它具有良好的水溶性，同时具有抗氧化清除 自由基，降低胆固醇，保肝等多重功能，作为抗 衰老的标的组分极具研究的价值。 二苯乙烯苷（全称为!，%，:，#’;四羟基二 苯乙烯;!;<;!;7;葡萄糖苷）为白色无定形粉末， 易溶于水、甲醇、乙醇，相对分子质量为 #$&.%+［!］ !! ! ! "" ，结构式为： ## !! !! "" =< >= >= <= <=<’?5 二苯乙烯苷作为糖苷类抗氧化剂，其自身 稳定性值得探讨。张纯［:］通过采用高温实验 和酸解实验得出二苯乙烯苷在水溶液中较稳 定，但高温（2$@）对其有一定影响，在酸性溶液 中很不稳定。刘振丽［&］通过高温实验表明，随 着温度升高制首乌中二苯乙烯苷含量降低，尤 其在溶液状态下。而干燥条件下二苯乙烯苷 经&$>A;"射线辐射保持稳定。 " 试验材料与方法 !"! 试验材料 何首乌：贵州安顺；8B<=：国营南京化学 试剂一厂；=>?：国营南京化学试剂一厂；乙醇 （体积分数+:/，下同）：国营南京化学试剂一 厂；>=%<=：国营南京化学试剂一厂。 !"# 试验方法 ".!." 二苯乙烯苷含量的测定 ".!."." 标准曲线的绘制 精密称取1.1)’二苯乙烯苷的标准样品， 用+:/的乙醇溶解定容于!:)*容量瓶。准 确吸取二苯乙烯苷标准液".$、!.$、%.$、#.$、 :.$、&.$、1.$、2.$)*，分别于2个"$)*容量 瓶中以+:/乙醇定容。用紫外分光光度计于 %!#-)测定吸光度值。得出方程如下： $C$.$&!&-D$.$$&&，.C$.+++% ".!.".! 二苯乙烯苷含量的测定 准确吸取提取液")*，稀释到一定比例， +:/乙醇定容。用紫外分光光度计，于%!#-) 测定吸光值。根据标准曲线方程计算二苯乙烯 苷含量。 ".!.! 几种提取方法的比较分析 ".!.!." 室温冷浸法 精确称取!$.$$$$’何首乌粉!份放入锥 形瓶，分别加入!$$)*甲醇和1$/乙醇，室温 下磁力搅拌!4，于#$$$E／),-离心!$),-，分 !%" 食品与发酵工业 !""#$%#!&’(&%)$)*"%+%#,-)’*&- （ ） !$$#FA?G%$8AG"$（3AHB?!$!） 离上清液，残渣同样方法重复提取一次，最后将 上清液及洗涤液合并，蒸馏水定容至!""#$， 取!#$用蒸馏水定容至%""#$，再取%#$用 乙醇定容至%"#$，于&’()#处测定吸光值， 根据标准曲线计算二苯乙烯苷得率。 %*’*’*’ 碱浸酸沉法［%+］ 精确称取’"*"""",何首乌粉放入锥形 瓶，加入’""#$蒸馏水，以(#-.／$的/012 调324%%*"，在5"6恒温磁力搅拌%7，冷却到 室温，再以5#-.／$的28.调324(*&，于( """9／#:)条件离心’"#:)，分离上清液，残渣 以同样方法提取’次，将上清液与洗涤液合并 蒸馏水定容至%"""#$，取%#$至离心管中， 加入(#$+!;乙醇沉淀蛋白质，于&"""9／#:) 条件离心%"#:)，再取%#$用+!;乙醇定容 至%"#$，于&’()#处测定吸光值，根据标准 曲线计算二苯乙烯苷得率。 %*’*’*& 加热回流法 精确称取’"*"""",何首乌粉’份放入锥 形瓶，分别加入’""#$甲醇或<";乙醇，在沸 水浴回流%7，于("""9／#:)条件离心’"#:)， 分离上清液，残渣以同样方法重复提取%次，将 上清液与洗涤液合并蒸馏水定容至!""#$，取 !#$用蒸馏水定容至%""#$，再取%#$用 +!;乙醇定容至%"#$，于&’()#处测定吸光 值，根据标准曲线计算二苯乙烯苷得率。 %*’*’*( 水浸提法 精确称取%"*"""",何首乌粉，加入%"" #$蒸馏水，5"6恒温磁力搅拌%7，在("""9／ #:)条件离心’"#:)，残渣重复提取%次，将上 清液及洗涤液合并，蒸馏水定容至’!"#$，取! #$用蒸馏水定容至%""#$，再取%#$用乙醇 定容至%"#$，于&’()#处测定吸光值，根据 标准曲线计算二苯乙烯苷得率。 %*’*’*! 超声波法 精确称取%"*"""",何首乌粉，加入5"; 乙醇’""#$，置于超声波槽进行超声波提取!" #:)，在("""9／#:)条件离心’"#:)，将上清液 及洗涤液合并，蒸馏水定容至’!"#$，取!#$ 用蒸馏水定容至%""#$，再取%#$用+!;乙 醇定容至%"#$，于&’()#处测定吸光值，根 据标准曲线计算二苯乙烯苷得率。 %*’*& 以乙醇为提取溶剂的提取工艺研究 %*’*&*% 料液比对提取的影响 精确称取%"*"""",何首乌粉!份，分别 按料液比为%=!、%=<、%=+、%=%’、%=%!（,／#$） 加入(";乙醇中，于("6恒温磁力搅拌器加热 5"#:)，在("""9／#:)条件下离心’"#:)，同样 条件重复提取%次，将’次提取掖合并，减压蒸 馏，最终定容于%""#$的容量瓶。按照%>’>% 方法测定二苯乙烯苷的含量。 %*’*&*’ 温度对提取率的影响 精确称取%"*"""",何首乌粉!份，分别 加入到<"#$(";的乙醇中，于&"、("、!"、5"、 <"6恒温水浴加热，一定转速下搅拌5"#:)，在 ("""9／#:)条件下离心’"#:)，残渣以同样方 法重复提取%次，将’次上清液合并，减压蒸馏 （!&<6），最终定容于%""#$的容量瓶。按照 %*’*%方法测定二苯乙烯苷的含量。 %*’*&*& 乙醇体积分数对提取率的影响 精确称取%"*"""",何首乌粉!份，分别 加入到<"#$乙醇中，体积分数分别为(";、 !";、5";、<";、、?";、+!;，于!"6恒温水 浴加热，一定转速下搅拌5"#:)，在("""9／#:) 条件下离心’"#:)，如上述条件重复提取%次， 将’次上清液合并，减压蒸馏（!&<6），最终定 容于%""#$的容量瓶。测定二苯乙烯苷的含 量。 %*’*&*( 时间对提取率的影响 精确称取%"*"""",何首乌粉!份，各加 入5";乙醇中，分别于!"6恒温水浴中加热， 一定转速下搅拌，提取’"、&"、("、5"、+"#:)，在 ("""9／#:)条件下离心’"#:)，如上述条件重 复提取%次，将’次上清液合并，减压蒸馏（! &<6），最终定容于%""#$的容量瓶。测定二 苯乙烯苷的含量。 %*’*( 运用中心组合实验优化提取工艺 在单因素试验的基础上，选出影响1@8’A 提取率的&个主要因素，时间、浓度、料液比进 行优化组合（试验方法参照%*’*&*%） &&% 分离与提纯 ’""(年第&"卷第%"期（总第’"’期）（ ） 考察指标：!"#’$的提取率。因素水平安 排如下： 表! 试验的设定 水 平 时间／%&’ 乙醇体积分数／( 料液比（)*%+） , -. /. ,*0 1 2. 3. ,*4 - 3. 0. ,*,1 1 试验结果和分析 "#! 不同提取方法的提取结果 表" 不同提取方法试验结果 ( 提取方法 第,次 得率 第1次 得率 总计 得率 室温冷浸 0.(乙醇 25/43 .5/-3 /5,-1 甲 醇 -533, .5/-. 25,4, 加热回流 4/(乙醇 256.2 256.2 甲 醇 2506- 2506- 碱浸酸沉法 水 25/60 25/60 超声波 3.(乙醇 /50,. /50,. 由表1结果可知，以超声波的提取效果最 好，其次是乙醇提取，考虑到设备的成本，本文 选用乙醇为溶剂对提取工艺进行优化。 "#" 乙醇提取工艺的单因素试验结果 1515, 料液比对提取二苯乙烯苷的影响 表$ 料液比对二苯乙烯苷得率的影响 料液比（)*%+） ,*/ ,*0 ,*4 ,*,1 ,*,/ 二苯乙烯苷得率／( /5140/5-44/5661/536,/501. 一般来说，溶剂用量越大提取效率越高，但 是，过大的料液比会造成溶剂和能源的浪费，并 给后工序的浓缩带来困难。当料液比大到一定 程度时，溶剂已将有效成分基本溶出完全。再 增大料液比，杂质成分会竞争溶出而不利于有 效成分的提取。由表-可知，最适料液比为,* 4。 15151 温度对提取二苯乙烯苷的影响 表% 温度对二苯乙烯苷得率的影响 温度／7 -. 2. /. 3. 6. 二苯乙烯苷得率／( /8/4./83.-/83.//83,0/830, 通常温度增高提取效率高，而二苯乙烯苷 极性较强，溶解性能较好，即常温即可溶出完 全。故而温度对提取效率的影响不大。如表2 数据可知，常温提取即可取得较好效果。 1515- 乙醇体积分数对提取二苯乙烯苷的影 响 表& 乙醇体积分数对二苯乙烯苷得率的影响 乙醇体积分数／( 2. /. 3. 0. 6. 二苯乙烯苷得率／( /822,/8/04/8643/80,-/8.3, 乙醇的溶解性能好，穿透细胞能力强。如 表/所示，随着乙醇体积分数的增加，提取率增 大。当乙醇体积分数达到一定程度时，二苯乙 烯苷溶解度最大，提取率最高。而后，乙醇体积 分数再增加，极性降低，二苯乙烯苷的溶解度减 少，同时一些醇溶性杂质、亲脂性强的成分溶出 量增加，这些成分与二苯乙烯苷竞争同乙醇9水 分子结合。从而导致二苯乙烯苷的提取效率下 降。乙醇的最适体积分数为3.(。 15152 提取时间对提取二苯乙烯苷的影响 表’ 提取时间对二苯乙烯苷得率的影响 提取时间／%&’ 1. -. 2. 3. 4. 二苯乙烯苷得率／( /5-1,/5200/53.2/5/02/5//0 从表3结果可知，二苯乙烯苷的提取效率 随时间不同而不同，当提取达到一定时间时，有 效成分浓度达到平衡，提取率最高。随着时间 的进一步延长，其提取率有所下降，可能是杂质 成分竞争溶出的结果。但是，如果提取时间过 短，二苯乙烯苷则从何首乌细胞中溶出，影响提 取率。 "8$ 中心组合试验方案和结果 指标：!,———二苯乙烯苷的提取率（(）； 因素：",———料液比（)*%+），"1———乙 醇体积分数（(），"-———时间（%&’）。 由试验数据计算机程序回归拟合得回归方 程 ! :35-0/;.5.1/0/",<.5.,6/"1< .5.341/"-; .5,//,1/",1; .5,,/31/"11; .5,.4,1/"-1;.5.131/","1<.5.060/","- <.5.,01/"1"- 由方程得出最佳提取工艺条件为：料液比 为,*4，提取时间为33%&’，乙醇体积分数为 3,5,(，在此条件下二苯乙烯苷得率可达 2-, 分离与提纯 （ ） 1..2=>?8-.@>8,.（A>BC?1.1） !"#$%。 表! 试验方案和试验结果 序 号 !& !’ !# " & ( )& )& *+$*# ’ ( )& & !+(!, # ( & )& !+’(’ , ( & & !+#-’ * )& ( )& !+&$( ! )& ( & !+’(, . & ( )& *+$(( - & ( & !+&,$ $ )& )& ( !+&,- &( )& & ( *+$$& && & )& ( !+’.( &’ & & ( !+((- &# ( ( ( !+,(( &, ( ( ( !+,’. &* ( ( ( !+’$- # 结 论 通过对不同几种提取方法的选取，确定采 用乙醇为提取溶剂。选用单因素及中心组合实 验，得出最优化工艺条件为，料液比（/012）为 &0$，提取时间为!!134，乙醇浓度为!&"&%提 取次数为’次。在此条件下二苯乙烯苷得率可 达!"#$%。 参 考 文 献 & 江苏新医学院编+中药大辞典上册［5］+上海：上海 人民出版社，&$.*"* ’ 孙文基，谢世昌+天然药物成分定量分析［5］+北 京：中国医药科技出版社，’((#+& # 673893:，;31<7=>"?@@A8BCD@CB3EFA4A8D1GD4A4BC D@B9A7DDBCD@GDEH/D4<18，L9134=13:+?@@A8BCD@CB3EFA4A8D1GDQ 4A4BCD@B9A7DDBCD@#$%"&$’()CGG"D4E3RA734S<7H34 GA7DT3I3UAID3EQ@AI7=BC［M］"OE=4B=5AI，&$-#，,$：*& !*, * 张 纯，杨少麟+高效液相色谱法测定何首乌中二 苯乙烯甙的含量及其稳定性考察［M］+中国中药杂 志，&$$$，’,（!）：#*.!#*$ ! 刘振丽，宋志前+不同地区制首乌中二苯乙烯苷含 量测定及稳定性考察［M］+中成药，’((’，’,（$）：!-, !!-* "#$%&’()*+,#-./#&)*#0’"#&12’*’31$/)(&%’4-)5 !"#$%"&’((’#)*+#",’(60$*227+#0.*)1 2R23C9<=4/ V=4/M3=4 （J89DDED@WDDIJ83A48A=4IVA894DED/H，JD=4/BUAX43RA7C3BH，Y　　 采用胶束电动毛细管色谱法（MECC）同时分离检测了制何首乌中二苯乙烯苷和5种游离蒽醌物质（大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚和 大黄素甲醚）。考察了缓冲液的pH值、SDS浓度、硼砂浓度、甲醇浓度和运行电压等因素对电泳分离的影响。优化后的分离检测条件为：运 行缓冲液组成为15 mmol/L硼砂-30 mmol/L SDS-10％甲醇（v/v），pH9．60、检测波长和分离电压分别为254 nm和25 kV。在此条件下，二 苯乙烯苷和五种游离蒽醌在18 min内达到基线分离；迁移时间和峰面积的日内RSD值分别为0．43-0．79，0．98-1．87％，日间（6天 ）RSD值分别为0．74-1．53和1．18-2．39％；检测限（S/N=3）为0．26-0．56μg/mL；而加标回收率为98．5-104．0％。采用所建立的毛 细管电泳方法对来源于不同产地的5种制何首乌样品进行分析。结果表明，制何首乌中二苯乙烯苷和游离蒽醌的种类和数量随产地不同而异 ，特别是广西田阳样品中的二苯乙烯苷含量（2．23 mg/g）远远低于其他样品（7．87-12．02 mg/g），而大黄酸的含量（20．06 mg/g）却 大大高出其他样品（0-3．08 mg/g），提示何首乌的质量

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中若仅以某一类特征成分作为评价指标将有失偏颇，应对其中的几类活性成分 进行综合评判，方能得出较为科学、全面的结论。
　　 以二苯乙烯苷和游离蒽醌作为检测指标，对比研究了黑豆法、姜制法、酒制法和高压清蒸法四种炮制方法对何首乌中活性成分变化的影响 。结果表明，炮制时间对于炮制品中二苯乙烯苷和游离蒽醌的数量均影响显著。游离蒽醌随着炮制时间的延长不断增多，达到最高值后，随 着时间的继续延长反而开始明显下降；二苯乙烯苷在不同炮制过程中其数量均呈下降趋势，炮制时间越长，二苯乙烯苷损失越多。四种炮制 方法中，高压清蒸法得到的炮制品中转化生成的游离蒽醌量最多，分别为其他三种炮制方法的1．78～1．84倍，而在游离蒽醌最大生成点时 损失的二苯乙烯苷最少。
　　 以二苯乙烯苷和游离蒽醌为检测指标，在单因素实验基础上，采用响应面法优化超声波提取何首乌中活性成分的工艺条件。采用四因素三 水平Box-Behnken设计法研究了药材粒度、温度、甲醇浓度和固液比对提取率的影响。同时依据所得的实验数据建立相应的数学统计模型 ，并进行响应面分析，确定超声提取的最佳工艺参数为：粒度100目、固液比1：50、甲醇浓度80％（v/v）、提取时间15 min、提取温度 55℃，超声功率60W。在上述优化条件下，二苯乙烯苷和大黄素的提取率分别为9．67 mg/g和2．82 mg/g。与其他三种传统提取方法，即醇 浸渍法、醇回流法和索氏抽提法相比，超声波提取法耗时短，溶剂消耗量少，但有效成分提取率最高。
　　 本研究建立的胶束电动毛细管色谱法不仅能够同时分离检测何首乌中的二苯乙烯苷和游离蒽醌成分，而且简单、快速和高效。其为制定客 观合理地评价何首乌药材及其相关制剂质量的标准和方法奠定了基础。 引证文献(6条) 1.韩光.陈尚义.李景华.王钰涵 微滤法精制何首乌水提液的研究[期刊论文]-中南药学 2008(6) 2.刘新桥.高文远.陈海霞 何首乌中二苯乙烯苷提取物的制备工艺及含量测定[期刊论文]-中国中药杂志 2007(14) 3.张保顺.黄明.叶小利.屠大伟.李学刚 采用树脂吸附法纯化何首乌二苯乙烯苷的工艺研究[期刊论文]-食 品与发酵工业 2006(6) 4.千梅.何竞旻.方红美.陈从贵 何首乌中二苯乙烯苷的超声提取工艺研究[期刊论文]-农产品加工·学刊 2006(10) 5.鲁坚.侯双菊.千梅.陈从贵 二苯乙烯苷的研究进展[期刊论文]-安徽化工 2006(3) 6.鲁坚 大孔吸附树脂分离何首乌中二苯乙烯苷的工艺研究[学位论文]硕士 2006 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_spyfx200410028.aspx 授权使用：南京理工大学图书馆(wfnjlg)，授权号：21e19d7c-6bcb-48dc-a6d0-9e6000f80ff1 下载时间：2011年1月3日