高产酸性蛋白酶黑曲霉菌种选育

2005年 2月 第42卷第1期 四川大学学报(自然科学版) Journal of Sichuan University(Natural Science Edition) Feb．2005 Vo1．42 NO．1 文章编号 ： 0490—6756(2005)01—0158—04 高产酸性蛋白酶黑曲霉菌种选育 刘 鑫，李 佳，刘克武，黄新河，赵 巍 (四川大学生ecN-学学院，成都，610064) 摘要：从麸醋醋母中分离出黑曲霉Asp 5609，用15W 紫外灯照射 8min，照射距离30cm，在暗 处30℃培养3d后挑取透明圈大的茵落用亚硝基胍诱变处理，筛选出高产酸性蛋白酶变异株 Asp 5609 7．在培养基 pH 5．0，含水量50％，培养时间60h，变温培养等优化条件下获得固体发 酵达 35000U／g．干基的酸性蛋白酶物料． 关键词：黑曲霉：酸性蛋白酶；选育 中图分类号：Q93 文献标识码：A 酸性蛋白酶是一类在低 pH(1．8～4．3)条件下水解蛋白质转变为氨基酸的蛋白酶．因其具备耐高盐浓 度(2mol／L)特性，微生物源酸性蛋白酶具有用于酱油和食醋酿造增加其产品中氨基酸含量的应用潜力 ． 培育高产酸II生蛋白酶菌种，并探索其优化发酵条件，可为工业发酵提供菌种和参数． 1 材料和 1．1 材料 菌种来源：以本项 目组从四川阆州优质麸醋的醋母中分离筛选出黑曲霉菌株 (AsperiUus niger 5609， Asp 5609)为诱变出发菌株，该菌株已由四川大学微生物研究中心鉴定． 斜面培养基：察氏培养基_2 ；分离培养基：在察氏培养基中加入 0．8％的酪蛋白；固体发酵基础培养 基：每 100g麸皮中加水 50mL，加 NI-~C1 1．5％，pH 5．0，分装于 500mL三角瓶中；液体发酵培养基(％)： 豆饼粉 4．0，玉米粉 0．8，鱼粉0．8，NH,C1 1．0，CaC12 0．05，K2HPO4 0．1，豆饼水解液 6．0，pH 5．5；以上培 养基的灭菌条件均为 121℃，30min． 1．2 方法 1．2．1 菌种的分离和纯化 采用常规稀释分离法．菌悬液的制备：称取醋母 1g，放人盛有 99mL无菌水 的三角瓶中，震荡 5min充分摇匀，使细菌分散．这样将样品稀释成为 10 菌悬液．稀释：取 6支装有 9mL 无菌水的试管，编好号从 10～～10～．用无菌移液管从 10I2菌悬液中吸取 1mL，放人编号 10-3的试管中， 制成 10I3菌液．用同一支移液管吸 lmL10I3的菌液，放人编号 10 试管中混匀，重复以上操作制成 10I4 菌液．依此类推，直到第六管即编号 10 的试管，制成不同稀释度的菌液．接种：准备好经灭菌的、温度为 45--50"C的牛肉膏蛋白胨培养基 140mL；经灭菌的培养皿(直径 9cm)九套，分别标上 10一，10～，10喵(每 个稀释度三套)．用经灭菌的移液管吸取 1mL菌液，倒人相应编号的培养皿中，然后即可倒人培养基 15mL．倒人后立即轻轻摇动培养皿，使培养基与菌液充分混匀，立即静止，水平放置待其冷却、凝固．培养 观察：将制作的平板放人30～37℃的恒温箱中培养 1--2d．选择所需要的单个菌落，接种到斜面培养基上 进一步培养后，进行镜检，如无杂菌，即成为纯种；如有杂菌，可再稀释分离，直到纯种． 收稿日期：2004—02—16 作者简介：刘鑫(1980一)，女，2002级硕士研究生．研究方向：蛋白质化学与分子生物学 *通讯作者 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 1期 刘 鑫等：高产酸性蛋白酶黑曲霉菌种选育 159 1．2．2 菌株的诱变处理 紫外线诱变处理：用接种环取新鲜 PDA斜面上的黑曲霉 Asp 5609孢子少许， 加入无菌水中进行稀释，用血球计数板进行计数，使每毫升溶液中孢子量约为 5000个，取 0．1mL涂布初 筛平板．30℃恒温培养4h，让孢子萌发，然后用 15W 紫外灯照射 8min后(紫外灯与平板垂直距离 30cm)， 在黑暗的培养箱中继续培养 3d，挑取透明圈大的菌落用作亚硝基胍诱变处理菌株[3 ；亚硝基胍诱变处理： 用接种环取新鲜 PDA斜面上经紫外线诱变处理的黑曲霉孢子少许，加入无菌水中进行稀释，用血球计数 板计数，使每毫升溶液中孢子量约为 5000个，取 3mL孢子悬液，加入等体积的亚硝基胍溶液(3×10 g／ mL)，充分混合，于30℃振荡处理 1h，取出稀释涂平板，30℃培养3d，挑取透明圈大的菌落分别进行发酵试验I3】． 1．2．3 变异菌株的培养方法 固体培养方法：挑取一环生长在 PDA斜面上的新鲜孢子接入装有 5og固体培 养基的500mL三角瓶中，培养温度为30℃，培养时间3d，测定酶活；液体培养方法：挑取一环生长在PI)A斜面上 的新鲜孢子接入装有50mL液体培养基的500ml三角瓶中，培养温度为30℃，培养时间3d，测定酶活． 1．2．4 酸性蛋白酶活性测定 用Folin法测定，规定在 pH 3．0，温度 47℃条件下，每分钟水解酪蛋白产生 1飕 酪氨酸所需的酶量为 1个蛋白酶活性单位． 1．2．5 黑曲霉菌株Asp 5609．7稳定性实验 将Asp 5609—7菌株连续传代 8代，8代菌株同时进行发酵实 验，测定菌株发酵 60h后的产酶活性．每个菌株5个重复，结果取平均值，比较其产酶活性变化Hj． 1．2．6 黑曲霉菌株 Asp 5609—7固体发酵条件的优化 分别采用不同发酵条件，包括：碳源、氮源、培养基 碳氮比、培养温度、培养时间、培养基pH、培养基含水量、无机盐．研究这些因素对黑曲霉菌株 Asp 5609．7 产酸性蛋白酶能力的影响 5】，并对其中影响较大的因素采取正交试验确定最佳培养条件组合． 2 结果与讨论 2．1 黑曲霉菌株 Asp 5609诱变结果 用紫外灯照射后的菌株涂布平板进行初筛，共挑取60株；经液体发酵培养基摇瓶复筛得到产酶高的 菌株 10株，此 10株再经过固体发酵复筛，其中3株产酶活性较高．Uv0(对照，未用紫外线照射)酶活平均 值 13689 U／g．干基，Uv2酶活15131 U／g．干基，Uv4酶活 18690 U／g．干基，Uv 酶活 16245 U／g．干基．可 见，经紫外线照射后酶活最高的菌株 Uv4产酶活性比出发菌株Uv0提高了36．5％．选择 Uvd株用亚硝 基胍作进一步诱变处理，由酪蛋白平板初筛得到菌株 49株，经摇瓶复筛得到菌株 16株，此 16株再经三角 瓶固体发酵复筛．酶活超过 2万 U ．干基的菌株有 5株，其中两株产酶活性最高，分别为 一7株35240 U／g．干基、U 一13株 30851U／g．干基．亚硝基胍诱变后酶活最高的变异株U 一7比紫外线照射后的变异株UV4 酶活平均值提高88．6％，比出发菌株提高 1．6倍．选择 U 一7进行后续试验，并将其命名为Asp 5609—7． 2．2 黑曲霉菌株 Asp 5609—7的产酶活性稳定性 用斜面孢子培养基将突变株 Asp 5609—7多次传代(30℃下培养 3d)，得不同代次的斜面．将不同代次 的斜面孢子接种发酵培养基(500mL三角瓶装 50mL)，在 220r／min旋转式摇床 30℃培养 60h，再进行固 体发酵60h．测得突变株发酵产酶活性第一代至第八代依次为 34976、35210、35264、35660、34765、35631、 33968、34213 U／g．干基．传接 8代后，突变株产酶仍维持在原来的水平，表明突变株 Asp 5609．7产酸性蛋 白酶性能比较稳定． 2．3 Asp 5609—7固体发酵条件的优化 2．3．1 不同碳源对菌株产酶活性的影响 在以麸皮为主要原料的基础培养基中添加不同碳源(不同碳源 添加量均为 1％)，考察其对酶活产生的影响．以麸皮为基本培养基所产酶活为 100％计，添加玉米粉的相 对酶活为82％，添加葡萄糖的相对酶活为 89％，添加蔗糖的相对酶活为79％．培养基中加入 1％玉米粉、 葡萄糖或蔗糖，Asp 5609—7所产酸性蛋白酶相对酶活明显降低，表明麸皮中碳源已能完全满足菌株生长产 酶之需，不必再添加其余碳源． 2．3．2 麸皮与豆饼比例对菌株产酶活性的影响 麸皮中含氮量为21．41％，基本能满足菌株Asp 5609-7生 维普资讯 http://www.cqvip.com 160 9)1l大学学报(自然科学版) 第 42卷 长需要，为使菌株生长更好并对菌株产酶进行诱导，在培养基中添加不同有机氮源，选择麸皮和豆粕比例分别为 10：0、9：1、8：2、7：3、6：4、5：5，考察其对酶活产生的影响．结果表明麸皮和豆饼比例以6：4为宜． 2．3．3 培养温度对菌株产酶活性的影响 用 6：4的麸皮豆饼培养基，在不同温度下进行产酶试验．采用 前期(1～30h)30"C，后期(30～60h)25"C的变温培养方法，产酶活性最高．若全期低于25℃培养，菌丝生长 缓慢，发酵周期延长；全期 30℃培养则菌丝生长较快，后期品温不易控制，产酶活性较低． 2．3．4 培养时间对菌株产酶活性的影响 在麸皮豆饼固体发酵培养基中，采用上述变温培养方法试验了该 菌株发酵产酶周期．结果表明，发酵培养至48h--60h时已达到产酶活性高峰，继续延长发酵时间，酶活力基本不 再增加．而且随着发酵时间的延长，干曲得率略有下降．从综合因素考虑，在48h--60h中止发酵为宜． 2．3．5 培养基 pH对菌株产酶活性的影响 用 lmol／L的HCI或 NaOH调节培养基的起始 pH值，接种培养 3d后测酶活性．结果表明：该菌株培养基的起始 pH值适宜范围为3～6，其中以pH 5．0时产酶活性最高． 2．3．6 培养基含水量对菌株产酶活性的影响 固体发酵物料与加水量比例(即持水量)对产酶影响较大， 若持水量少，由于发酵时间长，发酵中后期培养基易出现干化，菌株生长不良致使产酶活性降低；若持水量 过高，培养基灭菌后易结块发粘而使培养基内部缺氧，导致发酵不彻底．此外物料粒度的粗细也影响加水 量，物料粒度细，加水要少，反之则多．在本试验条件下培养基持水量为50％左右时产酶较好． 2．3．7 无机盐对菌株产酶活性的影响 添加 KH2PO．、ZnSO4和 NILC1对蛋白酶的合成有显著促进作 用．MgSO4对蛋白酶的合成也有一定促进作用．在此基础上通过正交优化实验，确定 Asp 5609—7发酵培养 基无机盐组成为：KH2PO．0．1％，ZnSO4 0．02％，MgSO4 0．05％，NH4(21 1．5％． 3．3．8 正交试验进一步优化培养条件 从上面的单因子考察可以看出，培养基的 pH、麸皮与豆饼的比 例、持水量对菌株产酶都有较大的影响，因此选择此三因素在基础培养基的基础上作正交试验，进一步考 察这三者对酶活产生的协同影响．实验如表 1，实验结果如表2 表 1 正交试验三个因素的水平 Table 1 Levels of the three factors in orthogonally designed experiment 维普资讯 http://www.cqvip.com 第1期 刘 鑫等：高产酸性蛋白酶黑曲霉茵种选育 161 由上表中极差 R可知，对酶活产生影响最大的是麸皮与豆饼的比例，其次是培养基 pH值，最后是持 水量．综合考虑得出最佳组合为麸皮豆饼比例为7：3，培养基 pH值为5，持水量为50％． 综上实验，黑曲霉菌株 Asp 5609．7的最佳培养基配方为：麸皮豆饼比例为 7：3，培养基 pH值为 5，持 水量为 50％，添加 KH2PO4 0．1％，ZnSO4 0．02％，MgSO4 0．05％，Nr-I,C1 1．5％．最佳培养条件为培养时 间60h，前期(30h前)30℃，后期(30h后)25℃变温培养． 参考文献： [1] 诸亮，袁耕瑾．发酵调味品生产技术[M]．北京 ：中国轻工业出版社，2002．245—296 [2] 邬显章．酶的工业生产技术[M]．吉林：吉林科技出版社，1988． [3] 黄遵锡，慕跃林，周晶．粮食与饲料工业，1999(3)：27—29． [4] 唐宝英，曹建民．食品与发酵工业，1998，24(3)：16—18． [5] 许尧兴，叶玲玲，钱玉英，等．工业微生物，1993，23(6)：15—20． Breeding of Asperillus niger with High Production of Acid Proteinase LfUXin ，Lf Jia，LfU Ke．W“，HUANG X ．he，ZHAO Wei (College of Life Science，Sichuan University，Chengdu，610064，China) Abstract：Asperillus niger 5609 was isolated from vinegar fermentation medium．Treatment with ultraviolet radiation of 15W was made for 8 min and with a distance of 30 cm．After 3 days of culturing at 30℃ ．1arge and transparent colonies were picked out and undergone mutation with nitrosoguan idine． And then mutant Asp 5609．7 with high production of acidity proteinase was selected．The acid proteinase of 35000u／g(dry cul— ture medium)was obtained under culture medium condition of pH 5．0，humidity of 50％，culturing period of 60h，and shifting the culture temperature according to the culturing stage． Key words：Asperillus niger：acid proteinase；breeding 维普资讯 http://www.cqvip.com