第 22卷第 1期
2 0 0 6年 1月
Vo1.22,No.1
Jan.,2 00 6
酸性蛋白酶提取大米水解蛋白的研究
Study on the extraction method of rice protein hydrolysate with acidic protease
葛 娜 易翠平 姚惠源
GE Na y,Cui-ping YAO Hui—yuan
(江南大学食品科学与安全教育部重点实验室 ,江苏 无锡 214036)
(Key Laboratory ofFood Science and Safety,Min~try ofEducation,Southern Yangtze
University,Wuxi,Jiangsu 214036,China)
摘要:研究了用酸性蛋白酶提取大米水解蛋白的工艺及所获
水解蛋白的功能性质。
了温度、pH值、加酶量、液 固比、
提取时间对蛋白提取率的影响,并通过正交实验优化了酸性
蛋白酶提取大米水解蛋白的工艺条件 ,确定了工艺
。其
最佳工艺条件为:温度45℃、pH3.0、加酶量 l%(E/S)、液固
比 8:l、提取时间为 4 h。
关键词:酸性蛋白酶;提取;大米蛋白
Abstract:The extraction method of rice protein hydrolysate with acidic
pmtease enzyme and some functionalities of it were studied,and the effects
of temperature,pH,enzyme/substract,material—liquid ratio and time On
extraction efficiency of rice protein were analysed.The optimum conditions
of the extraction were determined by orthogonal experiment.Th e results
were as follows:temperature:45 ℃ ,pH:3.0,enzyme/substract:1.O% ,
martial·liquid ratio:1:8 and time:4 h.
Keywords:Acidic pmtease;Extraction;Rice protein hydmlysate
大米蛋白以其合理的氨基酸组成,较高的生物利用率及
特有的低过敏性等特点被公认为优质植物蛋白。传统上,胚
乳蛋白的提取大多采用碱法或作为淀粉水解的副产品,高浓
度的碱液可以提取大部分米谷蛋白,但同时碱的处理也会引
起化学性质的变化,降低营养成分,产生有毒物质赖氨酰丙
氨酸,对肾脏功能有一定的损害。蛋白酶提取大米蛋白是利
用蛋白酶对大米蛋白的降解和修饰作用,使其变成可溶的肽
而被提取出来。酶法提取反应条件比较温和,蛋白质多肽链
可水解为短肽链,提高了蛋白质的消化率,同时其反应的液
固比小 ,节省了酸碱和水的消耗量。1985年 日本的《特许公
报》提及用酸性蛋 白酶抽提大米蛋 白,抽提率可达 90% 以
上⋯。大米除去蛋白后用来制作淀粉、淀粉糖 、清酒等,可使
产品质量有明显提高 ;王胜林用 961米曲霉酸性蛋 白酶和
537宇佐美曲霉变种酸性蛋白酶,蛋白提取率分别达到75%
作者简介:葛娜(1979一),女,江南大学食品学院在读研究生。
E·mail:gena790123@ 163.corn
收稿日期:2005—10—26
和80%_2 ;黄绐华用胃蛋白酶从米渣中提取蛋白质 ,提取率
达 72% ;此外,也有人对胰蛋 白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白
酶对大米蛋白的提取进行了研究。
水解蛋白质所用的酶为蛋白酶。从其来源讲可分为动
物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋 白酶。相 比较而言,微生
物蛋白酶具有活性高、价格低廉、适合工业化生产等优点。
所以本试验选取了现阶段我国几种已经商品化的微生物蛋
白酶进行研究,使研究更具有现实意义。
1 材料与方法
I.I 材料与设备
籼米:水分 12.63%。市售;
蛋白质:7.84%(干基);
脂肪:0.44%(干基);
酸性蛋白酶:活力单位 50 000 U/g,无锡酶制剂厂;
中性蛋白酶:活力单位 0.5 AU/g,丹麦诺维信公司;
碱性蛋白酶:活力单位 2.4 AU/g,丹麦诺维信公司;
复合蛋白酶 :活力单位 1.5 AU/g,丹麦诺维信公司;
风味蛋白酶 :活力单位500 LAPU/g,丹麦诺维信公司;
722光栅分光光度计、CS501恒温槽、81—2型恒温磁力
搅拌 器、PHS一3C精密 一pH 计、LXJ— II离 心沉 淀机 、
SF一100型粉碎机。
1.2 试验方法
1.2.1 蛋白质的提取 称取 25 g米粉于酶反应器中,根据
试验条件加去离子水,调节 pH至适宜;加酶,在既定温度的
恒温槽连续水循环下用磁力搅拌器搅拌进行反应;水解完毕
后在 80℃下灭酶 15 min;然后离心分离,取上清液备用。
1.2.2 蛋白质含量的测定 Folin一酚比色法。
1.2.3 蛋白质提取率的计算 原料中蛋白质含量用凯氏定
氮法测定。
大米蛋白提取率(%)=上清液蛋白质的含量/原料中的
蛋白质含量 X100%
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粮食深/jn-r 2006年第1期
1.2.4 蛋白质溶解性能的测定 以不同 pH溶液配制 10%
的蛋 白酶水解 物悬 浮液,于 30℃ 振 荡保 温 1 h后 ,在
1 500 r/min转速下离心 10 min,倾出上清液并测量体积,用
Folin一酚试剂法测定其中蛋白质浓度。计算溶出蛋 白占总
蛋 白的百分比。
1.2.5 蛋白质起泡性及起泡稳定性的测定 以不同 pH溶
液配制 4%的蛋白溶液,取 100 mL放入250 mL烧杯中,用高
速分散器于 10 000 r/min转速下搅拌 2 min,立即记录此时溶
液起泡体积 (Vo)和溶液体积,静止 30 min后再次记录泡沫
体积 ( )。
Fs:(Vo一 )/Vo X 100%
— — 起泡稳定性;
— — 起泡能力,F ;
— — 泡沫体积 ,mL。
1.2.6 蛋白质乳化活性和乳化稳定性的测定 采用浊度
法。配制 30 mL0.25%的蛋 白液 ,调不同 pH后分别加入
10 mL大豆油,于 10 000 r/min转速下分散 30 s后 ,立即用微
量注射器从溶液底部吸取 40 乳浊液,加到 5 mL0.1%
SDS溶液中,于 500 nm处测定光吸收值 A ,静置 15 min后
重新从乳浊液取样测定光吸收值 A。。则乳化活性指标(EAI)
用A 值
示:
Es=A0×T/(A0一A )
式中:
— — 乳化稳定性,mm’;
A。—— 乳化活性指标单位(EAI);
两次测定乳化活性的时间间隔,这里 T=15。
2 结果与讨论
2.1 不同蛋白酶对大米蛋白质提取率的影响
不同蛋 白酶对大米蛋白质提取率的影响见表 1。表 1的
结果表明,用酸性蛋白酶提取大米蛋 白的提取率最高 ,碱性
蛋白酶次之 ,风味蛋白酶和中性蛋白酶的提取效果最差。这
是由于酸性蛋白酶能较好地与大分子米谷蛋白发生界面作
用同时使淀粉结构变得疏松,从而使蛋 白酶能够扩散进入淀
粉质内部促使蛋白的降解和溶解,达到较好的提取效果。
表 1 不同蛋白酶对大米蛋白的提取率
十 液固比 4:1(v/w),提取时间4 h
2.2 工艺研究
2.2.1 加酶量对蛋 白提取率的影 响 分别选择加酶量
(E/S,%)为0.2%,0.5% ,0.8%,l%,2%进行实验。其它
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提取条件为:时间3 h,液固比 8:1,温度 40 oC,pH3.0。结果
见图1,由图 1可以看出在加酶量较低时提取率随着加酶量
的增加而增加,因为酶量的增加提高了酶对不溶性蛋白的作
用能力。当加酶量增加到一定程度时,即当全部底物均与蛋
白酶结合的时候,提取率就不再提高了。酶对不溶性蛋白的
降解能力也不再是提高蛋白质提取率的限制因素了。
1娶
皿
咖
图1 加酶量与蛋白质提取率的关系
2.2.2 液固比对蛋白提取率的影响 分别选择 5:1、6:1、
8:1、9:1、10:1和 12:1的液 固比进行试验。其它提取条件
为:时间3 h,加酶量 0.8%,温度40℃。pH3.0。液固比也是
影响蛋白质水解提取率的一个因素,加水量的多少直接影响
酶与蛋白质互相作用机率的大小,也影响相互作用的传质速
度。结果见图 2。由图2可以看出,采用液固比8:1较为适
中,适当提高液固比提取率比较高,但提取液中总固形物含
量降低,不利于工业化生产。
1娶
正
咖
图2 液固比与蛋白提取率的关系
2.2.3 pH值对蛋白质提取率的影响 分别选择 2.0、3.0、
4.0、5.0、6.0和 7.0的pH进行试验。其它提取条件为:时间
3 h,加酶量0.8%,温度 40℃ ,液固比8:1。酶的活力受 pH
的影响很大,酸性蛋白酶在酸性条件下充分显示它的活性 ,
结果见图3。由图3可以看出此酶解最适 pH值为2~3。
1娶
咖
图3 pH值与蛋白质提取率的关系
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第22卷第 1期 葛 娜等:酸性蛋白酶提取大米水解蛋白的研究
2.2.4 时间对蛋白质提取率的影响 分别经过 1,2,3,4,5,
6,7 h的提取,其它提取条件为:pH 3.0,加酶量 0.8%,温度
40℃,液固比8:1,结果见图4。由图 4可知 ,提取开始后蛋
白质的提取率随着时间的延长而增加,其原因为此时未溶出
的蛋白质多 ,即酶促反应中的底物浓度相对较高 ,并且此时
淀粉的结构是随时间的延长而松散 ,因此有利于酶降解的传
质过程 ,但随着时间的进一步延长,4 h后的提取率提高趋于
缓慢 。
罂f
皿
嘲
时I圃/h
图 4 时间与蛋 白提取率的 关系
2.2.5 温度对蛋白质提取的影响 分别在 30,35,45,50,
55℃下提取,其它提取条件为:pH 3.0,加酶量 0.8%,时间
3 h,液固比8:1,结果见图5。由图5可以看出,酶在此反应
中的最适温度在40~50℃之间。
跚
温度/℃
图5 温度与蛋白质提取率的关系
2.3 选择正交试验
及结果
选择 (3 )正交表进行实验,所取各因素水平见表 2,
正交实验结果见表3。
表2 正交试验水平因素表
由表3可知试验号4为最佳结果。其工艺条件为45℃,
pH2.5,加酶量(E/S,%)0.8% ,提取时间 4 h。由极差分析
可知,影响酶解反应的最主要因素是提取时间,其次是温度,
再次为加酶量,影响最小的为 pH值(试验中 pH值范围选的
比较小)。
2.4 验证试验
根据确定的最佳条件在一定范围内进行重复性试验 ,最
终确定提取条件为 45℃,pH3.0,加酶量 1%,提取时间4 h,
蛋白提取率为91.25%。
2.5 不同 pH的功能特性的测定结果
不同 pH条件下的功能性质的测定结果见表4。由表 4
可以看出,除起泡稳定性外 ,pH值对大米水解蛋 白的溶解
性、起泡性、乳化性以及乳化稳定性都有较大影响。在
pH4~6范围内,大米水解蛋白的溶解性最低,这可能是大米
水解蛋白的等电点范围。在实验测定的 pH范围内,大米水
解蛋白的起泡能力随着 pH的增大而增大,但是其起泡稳定
性却并没有显著的变化。大米水解蛋 白乳化能力和乳化稳
定性随 pH的变化趋势,与大米水解蛋白溶解性随 pH的变
化趋势有些类似,都是在 pH4~6范围内最低。在以蛋白为
配料的产品中,蛋白的功能特性往往比营养价值更重要 ],
因此 ,对大米水解蛋白的功能性质进行深入的研究对大米水
解蛋白的实际应用具有一定的指导意义。
表 3 正交试验结果
试验号 A温度 B pH值 C加酶量 D提取 提取率
时间 /%
pH 溶解性 起泡性 起泡稳定性 乳化性 乳化稳定性
值 /% /mL /% (OD值) /min
3 结论
大米蛋白质是优质谷物蛋白,虽然其在稻谷 中含量不
高,但诸多的优良特性决定了其广泛的前景,(下转第58页)
55
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第22卷第 1期 张瑞字:超声波处理对糙米发芽生理影响的研究
静止期 ,各项生理指标均处于低水平 ,随后生理活跃期来临,
并因超声波处理而加强。
- =
县
N
0
U
图4 不同时间超声处理糙米 RI的变化
4 讨论
4.1 -淀粉酶活力。还原糖含量与 RI之间的关系
一淀粉酶是发芽过程中诱导合成的淀粉分解酶,在淀粉
酶的活性中占有主要地位 』,它使淀粉分解为可溶性糖,提供
呼吸作用消耗。 -淀粉酶的作用加强必然使组织中可溶性糖
积累,呼吸底物的积累又将直接剌激呼吸作用加强,消耗底
物 ,产生能量,满足发芽生长的需要,所以 .淀粉酶,还原糖,
RI三者之间存在着必然的相关性,即相互促进,相互依赖的关
系。它们在糙米新的生命体萌动和突破种皮阶段显然应保持
旺盛的上升趋势。本实验在0—9个时段的动态观测结果基
本上符合种子萌芽生理的规律性。 -淀粉酶活力,还原糖含
量与RI之间呈现协调一致 的关系。7 min处理效果最为明
显,第 5时段还原糖出现峰值,而 一淀粉酶活性变化曲线在第
4时段陡然上升,表明 一淀粉酶开始大量形成,此后酶活力继
续上升,呼吸强度从第 4时段持续升高,在第 8时段达到峰
值,一直保持远高于对照的水平;14 min处理三项指标变化趋
势与7 min相同,仅产生的效应程度略低 ;3.5 min处理 .淀粉
从第 5时段开始增加,此后一直快速上升,并在第 9时段达到
最高值,作为对此的响应 ,还原糖在前期保持缓慢增长的基础
上,在第9时段也出现最高值,其呼吸强度与还原糖趋势十
分相似,慢速上升后在第8时段加快。
4.2 关于糙米的含水量变化
前人研究和预试结果表明,萌芽之初,吸水是一切生理
反应能否起动的先决条件。充分吸水使原生质胶体从凝胶
态转变成溶胶态,为呼吸作用和水解反应提供反应原料,并
为物质扩散、运输提供介质,这样生命活动才得以正常进行。
在糙米发芽中简单地确定浸泡时间,不一定能达到最大含水
量 ,会直接影响发芽效率。关于糙米的最大含水量文献报道
不同,由于不同糙米干物质的化学组成,含量和性质等均要
影响糙米的含水量,因此研明不同温度下糙米吸水规律和最
大含水量 ,对于保证糙米发芽的质量是十分必要的。
4.3 浸泡发芽工艺的一体化
很多研究均采用浸泡、发芽分开进行的方式。预试中发
现,当其对糙米最大含水量把握不准时,有时会出现浸泡中
就有籽粒发芽的情况 ,在温度波动和处理量较大时较易出
现,这不便于进行发芽生理和发芽工艺参数的研究。本实验
将浸泡和发芽联合进行 ,采用下述
来保证糙米对氧的需
求;① 振荡培养;② 发芽前期每4 h换液一次;③ 发芽中、后
期每2 h断水 1 h;④ 中、后期控制浸泡液加入量。如此尝
试,取得了较好的发芽效果。
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(上接第55页)目前受到国内外的极大重视。酶法具有作用
条件温和,很少产生毒害物质,其有效应用是目前植物蛋白
工业的发展方向。本研究优化了酸性蛋白酶提取大米水解
蛋白的工艺条件,蛋白提取率可达91.25%,并对其一些功能
性质进行了研究。酸性蛋白酶不但有较好的抽提效果.而且
获得的水解大米蛋白的功能性质也有较为明显的改善。
参考文献
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