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酸性蛋白酶提取大米水解蛋白的研究

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酸性蛋白酶提取大米水解蛋白的研究 第 22卷第 1期 2 0 0 6年 1月 Vo1.22,No.1 Jan.,2 00 6 酸性蛋白酶提取大米水解蛋白的研究 Study on the extraction method of rice protein hydrolysate with acidic protease 葛 娜 易翠平 姚惠源 GE Na y,Cui-ping YAO Hui—yuan (江南大学食品科学与安全教育部重点实验室 ,江苏 无锡 214036) (Key Laboratory ofFood Science...
酸性蛋白酶提取大米水解蛋白的研究
第 22卷第 1期 2 0 0 6年 1月 Vo1.22,No.1 Jan.,2 00 6 酸性蛋白酶提取大米水解蛋白的研究 Study on the extraction method of rice protein hydrolysate with acidic protease 葛 娜 易翠平 姚惠源 GE Na y,Cui-ping YAO Hui—yuan (江南大学食品科学与安全教育部重点实验室 ,江苏 无锡 214036) (Key Laboratory ofFood Science and Safety,Min~try ofEducation,Southern Yangtze University,Wuxi,Jiangsu 214036,China) 摘要:研究了用酸性蛋白酶提取大米水解蛋白的工艺及所获 水解蛋白的功能性质。了温度、pH值、加酶量、液 固比、 提取时间对蛋白提取率的影响,并通过正交实验优化了酸性 蛋白酶提取大米水解蛋白的工艺条件 ,确定了工艺。其 最佳工艺条件为:温度45℃、pH3.0、加酶量 l%(E/S)、液固 比 8:l、提取时间为 4 h。 关键词:酸性蛋白酶;提取;大米蛋白 Abstract:The extraction method of rice protein hydrolysate with acidic pmtease enzyme and some functionalities of it were studied,and the effects of temperature,pH,enzyme/substract,material—liquid ratio and time On extraction efficiency of rice protein were analysed.The optimum conditions of the extraction were determined by orthogonal experiment.Th e results were as follows:temperature:45 ℃ ,pH:3.0,enzyme/substract:1.O% , martial·liquid ratio:1:8 and time:4 h. Keywords:Acidic pmtease;Extraction;Rice protein hydmlysate 大米蛋白以其合理的氨基酸组成,较高的生物利用率及 特有的低过敏性等特点被公认为优质植物蛋白。传统上,胚 乳蛋白的提取大多采用碱法或作为淀粉水解的副产品,高浓 度的碱液可以提取大部分米谷蛋白,但同时碱的处理也会引 起化学性质的变化,降低营养成分,产生有毒物质赖氨酰丙 氨酸,对肾脏功能有一定的损害。蛋白酶提取大米蛋白是利 用蛋白酶对大米蛋白的降解和修饰作用,使其变成可溶的肽 而被提取出来。酶法提取反应条件比较温和,蛋白质多肽链 可水解为短肽链,提高了蛋白质的消化率,同时其反应的液 固比小 ,节省了酸碱和水的消耗量。1985年 日本的《特许公 报》提及用酸性蛋 白酶抽提大米蛋 白,抽提率可达 90% 以 上⋯。大米除去蛋白后用来制作淀粉、淀粉糖 、清酒等,可使 产品质量有明显提高 ;王胜林用 961米曲霉酸性蛋 白酶和 537宇佐美曲霉变种酸性蛋白酶,蛋白提取率分别达到75% 作者简介:葛娜(1979一),女,江南大学食品学院在读研究生。 E·mail:gena790123@ 163.corn 收稿日期:2005—10—26 和80%_2 ;黄绐华用胃蛋白酶从米渣中提取蛋白质 ,提取率 达 72% ;此外,也有人对胰蛋 白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白 酶对大米蛋白的提取进行了研究。 水解蛋白质所用的酶为蛋白酶。从其来源讲可分为动 物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋 白酶。相 比较而言,微生 物蛋白酶具有活性高、价格低廉、适合工业化生产等优点。 所以本试验选取了现阶段我国几种已经商品化的微生物蛋 白酶进行研究,使研究更具有现实意义。 1 材料与方法 I.I 材料与设备 籼米:水分 12.63%。市售; 蛋白质:7.84%(干基); 脂肪:0.44%(干基); 酸性蛋白酶:活力单位 50 000 U/g,无锡酶制剂厂; 中性蛋白酶:活力单位 0.5 AU/g,丹麦诺维信公司; 碱性蛋白酶:活力单位 2.4 AU/g,丹麦诺维信公司; 复合蛋白酶 :活力单位 1.5 AU/g,丹麦诺维信公司; 风味蛋白酶 :活力单位500 LAPU/g,丹麦诺维信公司; 722光栅分光光度计、CS501恒温槽、81—2型恒温磁力 搅拌 器、PHS一3C精密 一pH 计、LXJ— II离 心沉 淀机 、 SF一100型粉碎机。 1.2 试验方法 1.2.1 蛋白质的提取 称取 25 g米粉于酶反应器中,根据 试验条件加去离子水,调节 pH至适宜;加酶,在既定温度的 恒温槽连续水循环下用磁力搅拌器搅拌进行反应;水解完毕 后在 80℃下灭酶 15 min;然后离心分离,取上清液备用。 1.2.2 蛋白质含量的测定 Folin一酚比色法。 1.2.3 蛋白质提取率的计算 原料中蛋白质含量用凯氏定 氮法测定。 大米蛋白提取率(%)=上清液蛋白质的含量/原料中的 蛋白质含量 X100% 53 维普资讯 http://www.cqvip.com 粮食深/jn-r 2006年第1期 1.2.4 蛋白质溶解性能的测定 以不同 pH溶液配制 10% 的蛋 白酶水解 物悬 浮液,于 30℃ 振 荡保 温 1 h后 ,在 1 500 r/min转速下离心 10 min,倾出上清液并测量体积,用 Folin一酚试剂法测定其中蛋白质浓度。计算溶出蛋 白占总 蛋 白的百分比。 1.2.5 蛋白质起泡性及起泡稳定性的测定 以不同 pH溶 液配制 4%的蛋白溶液,取 100 mL放入250 mL烧杯中,用高 速分散器于 10 000 r/min转速下搅拌 2 min,立即记录此时溶 液起泡体积 (Vo)和溶液体积,静止 30 min后再次记录泡沫 体积 ( )。 Fs:(Vo一 )/Vo X 100% — — 起泡稳定性; — — 起泡能力,F ; — — 泡沫体积 ,mL。 1.2.6 蛋白质乳化活性和乳化稳定性的测定 采用浊度 法。配制 30 mL0.25%的蛋 白液 ,调不同 pH后分别加入 10 mL大豆油,于 10 000 r/min转速下分散 30 s后 ,立即用微 量注射器从溶液底部吸取 40 乳浊液,加到 5 mL0.1% SDS溶液中,于 500 nm处测定光吸收值 A ,静置 15 min后 重新从乳浊液取样测定光吸收值 A。。则乳化活性指标(EAI) 用A 值示: Es=A0×T/(A0一A ) 式中: — — 乳化稳定性,mm’; A。—— 乳化活性指标单位(EAI); 两次测定乳化活性的时间间隔,这里 T=15。 2 结果与讨论 2.1 不同蛋白酶对大米蛋白质提取率的影响 不同蛋 白酶对大米蛋白质提取率的影响见表 1。表 1的 结果表明,用酸性蛋白酶提取大米蛋 白的提取率最高 ,碱性 蛋白酶次之 ,风味蛋白酶和中性蛋白酶的提取效果最差。这 是由于酸性蛋白酶能较好地与大分子米谷蛋白发生界面作 用同时使淀粉结构变得疏松,从而使蛋 白酶能够扩散进入淀 粉质内部促使蛋白的降解和溶解,达到较好的提取效果。 表 1 不同蛋白酶对大米蛋白的提取率 十 液固比 4:1(v/w),提取时间4 h 2.2 工艺研究 2.2.1 加酶量对蛋 白提取率的影 响 分别选择加酶量 (E/S,%)为0.2%,0.5% ,0.8%,l%,2%进行实验。其它 54 提取条件为:时间3 h,液固比 8:1,温度 40 oC,pH3.0。结果 见图1,由图 1可以看出在加酶量较低时提取率随着加酶量 的增加而增加,因为酶量的增加提高了酶对不溶性蛋白的作 用能力。当加酶量增加到一定程度时,即当全部底物均与蛋 白酶结合的时候,提取率就不再提高了。酶对不溶性蛋白的 降解能力也不再是提高蛋白质提取率的限制因素了。 1娶 皿 咖 图1 加酶量与蛋白质提取率的关系 2.2.2 液固比对蛋白提取率的影响 分别选择 5:1、6:1、 8:1、9:1、10:1和 12:1的液 固比进行试验。其它提取条件 为:时间3 h,加酶量 0.8%,温度40℃。pH3.0。液固比也是 影响蛋白质水解提取率的一个因素,加水量的多少直接影响 酶与蛋白质互相作用机率的大小,也影响相互作用的传质速 度。结果见图 2。由图2可以看出,采用液固比8:1较为适 中,适当提高液固比提取率比较高,但提取液中总固形物含 量降低,不利于工业化生产。 1娶 正 咖 图2 液固比与蛋白提取率的关系 2.2.3 pH值对蛋白质提取率的影响 分别选择 2.0、3.0、 4.0、5.0、6.0和 7.0的pH进行试验。其它提取条件为:时间 3 h,加酶量0.8%,温度 40℃ ,液固比8:1。酶的活力受 pH 的影响很大,酸性蛋白酶在酸性条件下充分显示它的活性 , 结果见图3。由图3可以看出此酶解最适 pH值为2~3。 1娶 咖 图3 pH值与蛋白质提取率的关系 维普资讯 http://www.cqvip.com 第22卷第 1期 葛 娜等:酸性蛋白酶提取大米水解蛋白的研究 2.2.4 时间对蛋白质提取率的影响 分别经过 1,2,3,4,5, 6,7 h的提取,其它提取条件为:pH 3.0,加酶量 0.8%,温度 40℃,液固比8:1,结果见图4。由图 4可知 ,提取开始后蛋 白质的提取率随着时间的延长而增加,其原因为此时未溶出 的蛋白质多 ,即酶促反应中的底物浓度相对较高 ,并且此时 淀粉的结构是随时间的延长而松散 ,因此有利于酶降解的传 质过程 ,但随着时间的进一步延长,4 h后的提取率提高趋于 缓慢 。 罂f 皿 嘲 时I圃/h 图 4 时间与蛋 白提取率的 关系 2.2.5 温度对蛋白质提取的影响 分别在 30,35,45,50, 55℃下提取,其它提取条件为:pH 3.0,加酶量 0.8%,时间 3 h,液固比8:1,结果见图5。由图5可以看出,酶在此反应 中的最适温度在40~50℃之间。 跚 温度/℃ 图5 温度与蛋白质提取率的关系 2.3 选择正交试验及结果 选择 (3 )正交表进行实验,所取各因素水平见表 2, 正交实验结果见表3。 表2 正交试验水平因素表 由表3可知试验号4为最佳结果。其工艺条件为45℃, pH2.5,加酶量(E/S,%)0.8% ,提取时间 4 h。由极差分析 可知,影响酶解反应的最主要因素是提取时间,其次是温度, 再次为加酶量,影响最小的为 pH值(试验中 pH值范围选的 比较小)。 2.4 验证试验 根据确定的最佳条件在一定范围内进行重复性试验 ,最 终确定提取条件为 45℃,pH3.0,加酶量 1%,提取时间4 h, 蛋白提取率为91.25%。 2.5 不同 pH的功能特性的测定结果 不同 pH条件下的功能性质的测定结果见表4。由表 4 可以看出,除起泡稳定性外 ,pH值对大米水解蛋 白的溶解 性、起泡性、乳化性以及乳化稳定性都有较大影响。在 pH4~6范围内,大米水解蛋白的溶解性最低,这可能是大米 水解蛋白的等电点范围。在实验测定的 pH范围内,大米水 解蛋白的起泡能力随着 pH的增大而增大,但是其起泡稳定 性却并没有显著的变化。大米水解蛋 白乳化能力和乳化稳 定性随 pH的变化趋势,与大米水解蛋白溶解性随 pH的变 化趋势有些类似,都是在 pH4~6范围内最低。在以蛋白为 配料的产品中,蛋白的功能特性往往比营养价值更重要 ], 因此 ,对大米水解蛋白的功能性质进行深入的研究对大米水 解蛋白的实际应用具有一定的指导意义。 表 3 正交试验结果 试验号 A温度 B pH值 C加酶量 D提取 提取率 时间 /% pH 溶解性 起泡性 起泡稳定性 乳化性 乳化稳定性 值 /% /mL /% (OD值) /min 3 结论 大米蛋白质是优质谷物蛋白,虽然其在稻谷 中含量不 高,但诸多的优良特性决定了其广泛的前景,(下转第58页) 55 维普资讯 http://www.cqvip.com 第22卷第 1期 张瑞字:超声波处理对糙米发芽生理影响的研究 静止期 ,各项生理指标均处于低水平 ,随后生理活跃期来临, 并因超声波处理而加强。 - = 县 N 0 U 图4 不同时间超声处理糙米 RI的变化 4 讨论 4.1 -淀粉酶活力。还原糖含量与 RI之间的关系 一淀粉酶是发芽过程中诱导合成的淀粉分解酶,在淀粉 酶的活性中占有主要地位 』,它使淀粉分解为可溶性糖,提供 呼吸作用消耗。 -淀粉酶的作用加强必然使组织中可溶性糖 积累,呼吸底物的积累又将直接剌激呼吸作用加强,消耗底 物 ,产生能量,满足发芽生长的需要,所以 .淀粉酶,还原糖, RI三者之间存在着必然的相关性,即相互促进,相互依赖的关 系。它们在糙米新的生命体萌动和突破种皮阶段显然应保持 旺盛的上升趋势。本实验在0—9个时段的动态观测结果基 本上符合种子萌芽生理的规律性。 -淀粉酶活力,还原糖含 量与RI之间呈现协调一致 的关系。7 min处理效果最为明 显,第 5时段还原糖出现峰值,而 一淀粉酶活性变化曲线在第 4时段陡然上升,表明 一淀粉酶开始大量形成,此后酶活力继 续上升,呼吸强度从第 4时段持续升高,在第 8时段达到峰 值,一直保持远高于对照的水平;14 min处理三项指标变化趋 势与7 min相同,仅产生的效应程度略低 ;3.5 min处理 .淀粉 从第 5时段开始增加,此后一直快速上升,并在第 9时段达到 最高值,作为对此的响应 ,还原糖在前期保持缓慢增长的基础 上,在第9时段也出现最高值,其呼吸强度与还原糖趋势十 分相似,慢速上升后在第8时段加快。 4.2 关于糙米的含水量变化 前人研究和预试结果表明,萌芽之初,吸水是一切生理 反应能否起动的先决条件。充分吸水使原生质胶体从凝胶 态转变成溶胶态,为呼吸作用和水解反应提供反应原料,并 为物质扩散、运输提供介质,这样生命活动才得以正常进行。 在糙米发芽中简单地确定浸泡时间,不一定能达到最大含水 量 ,会直接影响发芽效率。关于糙米的最大含水量文献报道 不同,由于不同糙米干物质的化学组成,含量和性质等均要 影响糙米的含水量,因此研明不同温度下糙米吸水规律和最 大含水量 ,对于保证糙米发芽的质量是十分必要的。 4.3 浸泡发芽工艺的一体化 很多研究均采用浸泡、发芽分开进行的方式。预试中发 现,当其对糙米最大含水量把握不准时,有时会出现浸泡中 就有籽粒发芽的情况 ,在温度波动和处理量较大时较易出 现,这不便于进行发芽生理和发芽工艺参数的研究。本实验 将浸泡和发芽联合进行 ,采用下述来保证糙米对氧的需 求;① 振荡培养;② 发芽前期每4 h换液一次;③ 发芽中、后 期每2 h断水 1 h;④ 中、后期控制浸泡液加入量。如此尝 试,取得了较好的发芽效果。 参考文献 l 黄寿恩.功能性发芽糙米制品市场前景看好 [J].食品与机械, 2004(1):50~51. 2 顾振新,陈志刚,段颖.钙处理对发芽糙米中淀粉酶活力的影响 [J].食品与发酵工业 ,2002(11):4~7. 3 顾振新,陈志刚,蒋振晖.赤霉素处理糙米发芽力及其主要成分变 化的影响[J].南京农业大学学报,2003,26(1):22—23. 4 陆美莲,郑慧明.理化处理促进冬瓜种子萌发[J].作物杂志,2003 (6):17—18. 5 齐华生.超生处理兴安落叶松种子的实验[J].林业科技,1999 (3):24. 6 西北农学院.基础生物化学实验指导(初稿)[M].陕西 :西北农学 院.1985. 7 Daussant J,Miyatas M,Itsui T,et a1.Enzymatic mechanism of starch breakdown in germinating rice seed[J].Plant Physiol,1983(71): 88~95. (上接第55页)目前受到国内外的极大重视。酶法具有作用 条件温和,很少产生毒害物质,其有效应用是目前植物蛋白 工业的发展方向。本研究优化了酸性蛋白酶提取大米水解 蛋白的工艺条件,蛋白提取率可达91.25%,并对其一些功能 性质进行了研究。酸性蛋白酶不但有较好的抽提效果.而且 获得的水解大米蛋白的功能性质也有较为明显的改善。 参考文献 1 特许公报 昭60—2023,1985. 2 王胜林.酶法提取大米蛋白的研究[D].无锡:无锡轻工学院硕士 论文。1988. 3 黄绐华,温辉良.胃蛋白酶提取大米蛋白质的研究[J].西部粮油 科技,1996(3):6o~61. 4 王文高,陈正行,姚惠源.不同蛋白酶提取大米蛋白质的研究[J]. 粮食与饲料工业,2002(2):41—42. 58 5 王金华,邱雁临,蒋爱蛾,等.蛋白酶水解米渣蛋白的研究[J].粮 食加工与食品机械,2002(4):42—45. 6 席文博,赵思明,刘友明.大米蛋白分离提取的研究进展[J].粮食 与饲料工业,2003(10):45~47. 7 王章存,姚惠源.大米蛋白质提取技术研究[J].粮食与饲料工业, 2003(8):37—38. 8 孙庆杰,杨明毅,陈小延.酶法提取大米浓缩蛋白工艺条件的研究 [J].食品科学,2003,24(10):83—85. 9 郭荣荣,潘思铁,王可兴.碱法与酶法提取大米蛋白工艺及功能特 性比较研究[J].食品科学,2005,26(3):173—177. 10 柳学文.酶法制取大豆浓缩蛋白的生产实践[J].中国油脂,1999 (1):56~59. 1l 郑铁松,龚院生.粮油食品生物化学实验[M].郑州:河南医科大 学出版社,1996. 12 吴有炜.试验设计与数据处理[M].苏州:苏州大学出版社, 2002. 维普资讯 http://www.cqvip.com
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