总大肠菌群说明

总大肠菌群 在饮用水的微生物安全监测中，普遍采用正常的肠道细菌作为粪便污染指标，而不是直 接测定肠道致病菌。 总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在 37℃生长时能使乳糖发酵，在 24h 内产酸 产气的革氏阴性无芽胞杆菌。总大肠菌群系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。 总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。 一 多管发酵法 1 应用范围 1.1 本法适用于饮用水、水源水，特别是浑浊度含量高的水质中总大肠菌群的测定。 1.2 水样中总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染程度，而且间接地表明有肠道致病菌 存在。 2 原理 根据总大肠菌群应具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在 37℃24h内能发酵乳糖 并产酸产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。 3 仪器 3.1 显微镜 3.2 革兰氏染色用有关器材。 3.3 高压蒸汽灭菌器。 3.4 干热灭菌箱。 3.5 恒温箱。 3.6 冰箱。 3.7 放大镜。 3.8 试管、平皿（直径 9cm）、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中 160℃灭菌 2h。 4 培养基 4.1乳糖蛋白胨培养液 4.1.1 成分 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 乳糖 5g 氯化钠 5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 蒸馏水 1000ml 4.1.2 制法 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于 1000ml蒸馏水中加热溶解，调整 pH为 7.2~7.4， 再加入 1ml 1.6% 溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置高压蒸汽灭 菌器中，以 115℃灭菌 20min，贮存于冷暗处备用。 4.2 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。 4.3 品红亚硫酸钠培养基（供多管发酵法用） 4.3.1 成分 蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 3.5g 琼脂 15~30g 蒸馏水 1000ml 无水亚硫酸钠 5g左右 5%碱性品红乙醇溶液 20ml 4.3.2 储备培养基的制备 先将琼脂加至 900蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解， 再以蒸馏水补足至 1000ml，调整 PH值为 7.2~7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖， 混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌中以 115℃灭菌 20min，贮存于冷暗处备用。 4.3.3 平皿培养基的配制 将上法制备的储备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取 一定量的 5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置 于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸 10min以灭菌。 用灭菌吸管吸取已灭菌的严硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色褪成淡粉 红色为止。将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基内，并充分混匀 （防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入于已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰 箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周，如培养基已由淡红色变成深红 色，则不能再用。 4.4 伊红美蓝培养基 4.4.1 成分 蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 2g 琼脂 20~30g 蒸馏水 1000ml 2%伊红水溶液 20ml 0.5 %美蓝水溶液 13ml 4.4.2 储备培养基的制备 先将琼脂加至 900ml蒸馏水，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解， 再以蒸馏水补足至 1000ml，调整 PH为 7.2~7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖， 混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器内以 115℃灭菌 20min，贮存于冷暗处备用。 4.4.3 平皿培养基的制备 将上法制备的储备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取 一定量已灭菌的 2%伊红水溶液及一定量已灭菌的 0.5%美蓝水溶液，加入已融化的储备琼脂 内，并充分混匀（防止产生气泡）立即将此种培养基适量倾入于已灭菌和空平皿内，待其冷 却凝固后置冰箱内备用。 5 步骤 5.1 生活饮用水 5.1.1 初发酵试验：在 2个各装有已灭菌 50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（4.2）的大试 管或烧瓶中（内有倒管）内，以无菌操作各加入水样 100ml；在 10支装有已灭菌 5ml三倍 浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作各加入水样 10ml，混匀后置于 37 ℃恒温箱内培养 24h。 5.1.2 平板分离：经培养 24h后，将产酸产气及只产酸的发酵管，分别接种于品红亚硫酸 钠培养基或伊红美蓝培养基上，再置于 37℃恒温箱内培养 18~24h，挑选符合下列特征的菌 落，取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏试验、镜检。 品红亚硫酸钠培养基上的菌落： 紫红色，具有金属光泽的菌落。 深红色，不带或略带金属光泽的菌落。 淡红色，中心色较深的菌落。 伊红美蓝培养基上的菌落： 深紫黑色，具有金属光泽的菌落。 紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落。 淡紫红色，中心色较深的菌落。 5.1.3 复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽胞杆菌，则挑取该菌落的另 一部分再接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养液中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵 管的最典型的菌落 1~3个，然后置于 37℃恒温箱中培养 24h，有产酸产气者（不论倒管内气 体多少皆作为产气论），即证实有总大肠菌群存在。 5.1.4 根据证实有总大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查表 1，每升水样中的总大肠菌 群数。 表 1 总大肠菌群数检数表 （接种水样总量 300ml—100ml 2份，10ml 10份） 0 1 2 100ml水量的阳性 管（瓶）数 10ml水量的阳性管数 每升水样中 总大肠菌群数 每升水样中 总大肠菌群数 每升水样中 总大肠菌群数 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ＜3 3 7 11 14 18 22 27 31 36 40 4 8 13 18 24 30 36 43 51 60 69 11 18 27 38 52 70 92 120 161 230 ＞230 5.2 水源水 5.2.1 将水样作 1：10稀释。 5.2.2 于各装有 5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（4.2）的 5个试管中（内有倒管），各加 入 10ml水样；于各装有 10ml乳糖蛋白胨培养液（4.1）的 5个试管中（内有倒管），各加入 1ml水样，于各装有 10ml乳糖蛋白胨培养液（4.1）的 5个试管中（内有倒管），各加入 1ml1： 10稀释水样。共计 15管，三个稀释度。以后的检验步骤同上述生活饮用水的检验方法。 5.2.3 根据证实有总大肠菌群存在的阳性管数查表 2报告每升水样中的总大肠菌群数。 表 2 总大肠菌群检数表 （接种水样总量 55.5ml ，其中 5份 10ml水样，5份 1ml水样，5份 0.1ml水样） 接种量，ml 接种量，ml 10 1 0.1 每 100ml水样中总大肠 菌群近似数 10 1 0.1 每 100ml水样中总大肠 菌群近似数 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 4 5 0 2 4 5 7 9 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 2 3 4 5 2 4 6 7 9 11 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 0 1 2 3 4 5 4 6 7 9 11 13 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 2 3 4 5 4 6 8 10 12 14 0 0 0 0 0 0 3 3 3 3 3 3 0 1 2 3 4 5 6 7 9 11 13 15 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 0 1 2 3 4 5 6 8 10 12 15 17 0 0 0 0 0 0 4 4 4 4 4 4 0 1 2 3 4 5 8 9 11 13 15 17 1 1 1 1 1 1 3 3 3 3 3 3 0 1 2 3 4 5 8 10 12 15 17 19 0 0 0 0 0 0 5 5 5 5 5 5 0 1 2 3 4 5 9 11 13 15 17 19 1 1 1 1 1 1 4 4 4 4 4 4 0 1 2 3 4 5 11 13 15 17 19 22 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 4 5 2 4 6 8 10 12 1 1 1 1 1 1 5 5 5 5 5 5 0 1 2 3 4 5 13 15 17 19 22 24 接种量，ml 接种量，ml 10 1 0.1 每 100ml水样中总大肠 菌群近似数 10 1 0.1 每 100ml水样中总大肠 菌群近似数 2 2 2 2 2 2 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 4 5 5 7 9 12 14 16 2 2 2 2 2 2 5 5 5 5 5 5 0 1 2 3 4 5 17 20 23 26 29 32 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 0 1 2 3 4 5 7 9 12 14 17 19 3 3 3 3 3 3 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 4 5 8 11 13 16 20 23 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 0 1 2 3 4 5 9 12 14 17 19 22 3 3 3 3 3 3 1 1 1 1 1 1 0 1 2 3 4 5 11 14 17 20 23 27 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 0 1 2 3 4 5 12 14 17 20 22 25 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 0 1 2 3 4 5 14 17 20 24 27 31 2 2 2 2 2 2 4 4 4 4 4 4 0 1 2 3 4 5 15 17 20 23 25 28 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0 1 2 3 4 5 17 21 24 28 32 36 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 0 1 2 3 4 5 21 24 28 32 36 40 4 4 4 4 4 4 3 3 3 3 3 3 0 1 2 3 4 5 27 33 39 45 52 59 3 3 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 0 1 2 3 4 5 25 29 32 37 41 45 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 0 1 2 3 4 5 34 40 47 54 62 69 接种量，ml 接种量，ml 10 1 0.1 每 100ml水样中总大肠 菌群近似数 10 1 0.1 每 100ml水样中总大肠 菌群近似数 4 4 4 4 4 4 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 4 5 13 17 21 25 30 36 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 0 1 2 3 4 5 41 48 56 64 72 81 4 4 4 4 4 4 1 1 1 1 1 1 0 1 2 3 4 5 17 21 26 31 36 42 5 5 5 5 5 5 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 4 5 23 31 43 58 76 95 4 4 4 4 4 4 2 2 2 2 2 2 0 1 2 3 4 5 22 26 32 38 44 50 5 5 5 5 5 5 1 1 1 1 1 1 0 1 2 3 4 5 33 46 63 84 110 130 5 5 5 5 5 5 2 2 2 2 2 2 0 1 2 3 4 5 49 70 94 120 150 180 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 0 1 2 3 4 5 130 170 220 280 350 430 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 0 1 2 3 4 5 79 110 140 180 210 250 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 4 0 1 2 3 4 5 240 350 540 920 1600 ＞1600 二、滤膜法 1 应用范围 1.1 本法适用于饮用水和水源水，特别是低浊度水样中总大肠菌群数的测定。 1.2 本法适用于较大量水样的测定。 1.3如检验原水样量过少，可加适量灭菌水稀释使体积加大后再测定。 2 原理 滤膜是一种微孔薄膜，孔径 0.45~0.65μm，能滤过大量水样，并将水中含有的细菌截留知 滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，直接计数滤膜上生长的典型大肠菌群 菌落，算出每升水样中含有的总大肠菌群数。 3 仪器 3.1 滤器 3.2 滤膜，孔径 0.45~0.65μm。直径根据滤器规格，目前常用的有 3.5cm和 4.7cm两种。 3.3 抽滤设备。 3.4 无齿镊子。 3.5 高压蒸汽灭菌器。 3.6 干热灭菌箱。 3.7 恒温箱。 3.8 冰箱。 3.9 放大镜。 3.10 试管、平皿（直径 9cm）、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中 160℃灭菌 2h。 4 培养基 4.1 品红亚硫酸钠培养基 4.1.1 成分 蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 3.5g 琼脂 15~20g 蒸馏水 1000ml 无水亚硫酸钠 5g左右 5%碱性品红乙醇溶液 20ml 酵母浸膏 5g 牛肉膏 5g 4.1.2 培养基的制备 先将琼脂加至 900蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解， 再以蒸馏水补足至 1000ml，调整 PH值为 7.2~7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖， 混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌中以 115℃灭菌 20min，贮存于冷暗处备用。 4.2 乳糖蛋白胨培养液 4.2.1 成分 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 乳糖 5g 氯化钠 5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 蒸馏水 1000ml 4.2.2 制法 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于 1000ml蒸馏水中加热溶解，调整 pH为 7.2~7.4， 再加入 1ml 1.6% 溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置高压蒸汽灭 菌器中，以 115℃灭菌 20min，贮存于冷暗处备用。 4.3 乳糖蛋白胨半固体培养基 4.3.1 成分 蛋白胨 10g 乳糖 10g 琼脂 5g左右 蒸馏水 1000ml 酵母浸膏 5g 牛肉膏 5g 4.3.2 制法 将上述成分置于 800ml蒸馏水中，加热溶解，调整 PH为 7.2~7.4，再用蒸馏水补充至 1000ml，过滤分装于小试管中，每管装入的培养基量约为试管容积的 1/3，115℃灭菌 20min， 冷却后置于冰箱内保存，以不超过二周为宜。 此培养基制成后，需用已知大肠菌群株进行鉴定，应在 6~8h产生明显气泡。 5 步骤 5.1 准备工作 5.1.1滤膜灭菌：将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次 15min。 前两次煮沸后需更换水洗涤 2~3次，以除残留溶剂。 5.1.2 滤器灭菌：用点燃的酒精棉球，火焰灭菌。也可用 121℃灭菌 20min。 5.2 过滤水样 5.2.1 用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，帖放已灭菌的滤床上，稳妥地 固定好滤器，将 333ml水样（如水样含菌数较多，可减少过滤水样量）注入滤器中，加盖， 打开滤器阀门，在负压 0.5大气压下抽滤。 5.2.2 水样过滤完后，再抽气 5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部 分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全帖紧，两者 间不得有气泡，然后见平皿倒置，放在 37℃恒温箱内培养 22~24h。 5.3 观察结果 5.3.1 挑选符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检。 紫红色，具有金属光泽的菌落； 深红色，不带或略带金属光泽的菌落； 淡红色，中心色较深的菌落。 5.3.1.1 凡系革兰氏染色阴性无芽胞杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养液或乳糖蛋白胨半固体 培养基（接种前应将此培养基放入水浴中煮沸排气，冷却凝固后方可使用）上，经 37℃培 养，前者于 24h产酸产气者；或经 6~8h培养后产气者，则判定为总大肠菌群阳性。 5.3.1.2 1L水样中总大肠菌群数等于滤膜上生长的大肠菌群落总数乘以 3。