ER、CyelinD1蛋白在青春期乳房肥大症乳腺组织中的表达4

一304一 中华内分泌外科杂志2009年lO月第3卷第5期ChinJEndoerSurg，October2009，V01．3，No．5 ER、CyclinD1蛋白在青春期乳房肥大症 乳腺组织中的表达 任敏汪英滕利王本忠 【摘要】 目的探讨ER、CyclinDl蛋自在青春期乳房肥大症乳腺组织中的表达及意义。方法应 用Western—blot法检测15例青春期乳房肥大症(实验组)、15例正常乳腺(对照组B)及lO例原发性小乳 症(对照组A)乳腺组织中ER、CyclinDl蛋白的表达情况。结果ER、CyclinDl蛋白在实验组乳腺组织中 的表达与对照组A乳腺组织中的表达比较差异有统计学意义(P<0．01)，ER、CyclinD!蛋白在实验组乳 腺组织中的表达与对照组B组织中的表达比较差异有统计学意义(P<0．01)，ER、CyclinDl蛋白在对照组 B组织中的表达与对照组A乳腺组织中的表达比较差异无统计学意义(P>0．05)。结论ER、CyclinDl 蛋白在实验组乳腺组织中的表达明显高于对照组B和对照组A乳腺组织中的表达乳房肥大症的发生可 能与乳腺组织中ER、CyclinDl蛋白表达有关。 【关键词】 青春期；乳房肥大症；ER；CyclinDl蛋白 【中图法分类号】 R655．8 【文献标识码】B ExpressionofER，CyclinDIinglandulartissueofpubertalmammaryhypertrophyRENMin，WANG 托昭，TENGLi，WANGBen-zhong．DepartmentofBreastSurgery，theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedical Unive船ity，Hefei230022，China Correspondingauthor：RENMin，Email：renminl977@yahoo．corn．cn 【Abstract】0bjectiveToinvestigatetheexpressionoftheER，CyclinDlinbreasttissueofpubertal mammaryhypertrophyandexplorethepossibleetiologyofpubertalmammaryhypertrophy．MethodsTheexpres— sionofER，CyclinDlwasdetectedbyWestern—blotin15casesofpubertalmammaryhypertrophy，15normal breasttissueand10Casesofmieromastia．ResultsThereWassignificantdifferenceoftheexpressionofER，Cy— clinD!withinbreasttissuebetweenpubertalmammaryhypertrophyandmicromastia(P<0．01)．ThereWassignif- icantdifferenceoftheexpressionofER，CyclinDlwithinbreasttissueinpubertalmammaryhypertrophyandin normalbreasttissue(P<0．01)．ThereWasnodifferencebetweentheexpressionofER，CyclinD!withinbreast tissueinmieromastiaandinnormalbreasttissue(P>0．05)．ConclusionsTheexpressionofER，CyclinDlin pubertalmammaryhypertrophyalesignificantlyhisherthaninmicromastiaandnormalbreasttissue．Thepubertal mammaryhypertrophymayberelatedtotheexpressionstatusofER，CyclinDlwithinbreasttissue． 【KeyWords】Puberty；Mammaryhypertrophy；ER；CyclinDl 乳房肥大症多在青春期和妊娠期女性中发病。 对乳房肥大症的手术治疗已有近百年历史，并取得了 很大进展，但有关其病因学的研究却很少。迄今为 止，乳房肥大症的病因及其发生机制尚不完全清楚。 乳腺作为性激素的靶器官，其生长发育和功能均依赖 DOI：10．3760／(。)ha．j．issn．1674—6090．2009．05．004 作者单位：230022合肥，安徽医科大学第一附属医院乳腺外科 (任敏、王本忠)；安徽医科大学附属安徽省市医院二南病Ⅸ(if英)； 100144北京，中国医学科学院中国协和医科人学整形外科医院整形 五科(滕利) 通讯作者：任敏，Email：renminl977@yahoo．eom．ca ·论著 于性激素的支持，其中雌激素尤为重要，乳腺的发育 与其密切相关。本研究应用Western—blot方法，并加 人正常乳腺组织对照，研究雌激素受体(ER)、细胞周 期蛋白Dl(CyclinD1)与青春期乳房肥大症发生、发 展的关系，探讨青春期乳房肥大症的发病机制。 1材料与方法 1．1标本来源 1．1．1实验组 青春期乳房肥大症(青春期发 万方数据 中华内分泌外科杂志2009年lO月第3卷第5期ChinJEndocrSurg，October2009，Y01．3，No．5—305一 病，出现乳房异常增大)，每侧乳腺切除重量>3509 的患者。排除术后经病理诊断和病史回顾有下列情 况之一者：①乳腺纤维腺瘤病史；②月经周期不规 律；③2个月内服用雌激素类药物史；④有妊娠史； ⑤有乳腺癌家族史或病史；⑥乳头溢液；⑦穿刺针吸 或切除组织标本有囊肿、积液或积乳；⑧组织病理学 检查有非典型增生。本组共15例，均为女性；年龄15 —26岁，平均21．8岁；手术Et期均为月经周期的第2 ～3周；每侧切除乳腺重量3509一16309，平均7389。 1．1．2对照组A原发性tJ,乎L症经乳晕切口行 隆乳术的患者；原发性小乳症隆乳术后效果不佳，经 乳晕切口行假体更换的患者。排除同实验组。 本组共10例，均为女性；年龄20～28岁，平均23．6 岁；手术日期均为月经周期的第2～3周。 1．1．3对照组B乳房大小形态正常，伴有单纯 性乳腺纤维腺瘤行手术切除的患者，术中于病灶旁 开3cm处切取少量乳腺组织，作为正常对照组。排 除标准除第①、⑦两条外，余同实验组。本组共15 例，均为女性；年龄18—27岁，平均22．5岁；与实验 组比较两组间年龄差异无统计学意义，手术El期同 样均为月经周期的第2～3周。 1．2标本采集、处理 将手术切下的标本39～59，经生理盐水冲洗干 净后，置于液氮中保存备用。 1．3主要试剂及仪器 ER、CyclinDl兔抗人单克隆抗体，辣根过氧化 物酶标记的羊抗兔和羊抗鼠IgG均购自北京中衫公 司；Western印迹化学发光检测试剂盒为NEB公司 产品；ECL显色系统购自SantaCruz公司；DYY6C 型电泳仪、电泳槽及电泳玻璃板、水平摇床购自北京 市六一仪器厂。 1．4 Western印迹检测 按常规方法提取细胞总蛋白，经12％聚丙烯酰 胺凝胶电泳(SDS—PAGE)后转移至聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜上，5％脱脂牛奶室温封闭2h后加入一 抗4(c过夜，用TBST缓冲液洗涤3次，每次10min， 接着加入二抗于室温孵育2h，再用TBST缓冲液冲 洗3次，每次10min，然后加入化学发光试剂(ECL) 进行检测。以条带的大小及深浅判断检测蛋白表达 水平，并经GelProAnalyser3．1图像分析软件分析。 以GAPDH表达水平为内参对照，分别测定ER、Cy． clinDl蛋白条带与GAPDH蛋白条带的灰度(A)值， 以A值的比值表示蛋白表达水平，比值大则表明组 织中蛋白表达高。 1．5统计学处理 使用SPSS11．5软件进行统计分析处理。实验 组与对照组阳性表达率的比较用独立t检验，检验 水准0．05。 2结果 2．1 ER的表达 ER蛋白在实验组、对照组A和对照组B中的 表达见图1—3，测定结果见表1和2。在实验组的 乳腺组织中ER蛋白检测值在0～0．677之间，平均 值为0．463±0．175，对照组A乳腺组织中ER蛋白 的检测值在0—0．221之间，平均值为0．112-t- O．095，对照组B乳腺组织中ER蛋白的检测值在0 —0．153之间，平均值为0．095-I-0．076。实验组乳 腺组织中的ER蛋白含量明显高于对照组A，两者 比较差异有统计学意义(P<0．01)；实验组乳腺组 织中的ER蛋白含量明显高于对照组B，两者比较 差异有统计学意义(P<0．01)；对照组A乳腺组织 中的ER蛋白含量与对照组B乳腺组织中的ER蛋 白含量相比较，差异无统计学意义(P>0．05)。 图1肥大乳房组织ERWestern—blot结果(66KD) 图2正常乳房组织ERWestern—blot结果(66KD) 图3小乳房组织ERWestern—blot结果(66KD) 万方数据 一306一 中华内分泌外科杂志2009年10月第3卷第5期ChinJEndocrSurg，October2009，V01．3，No．5 2．2 CyclinDl的表达 CyclinDl在实验组、对照组A和对照组B中的 表达见图4～6。测定结果见表3和4。CyclinDl检 测值在实验组的乳腺组织中为0～0．719之间，平均 值为0．456±0．190；在对照组A乳腺组织中为0～ 0．369之间，平均值为0．194±0．145，在对照组B乳 腺组织中为0～0．304，平均值为0。168±0．097。实 验组乳腺组织中的CyclinDl含量明显分别高于对 照组A和对照组B，其组间比较差异均有统计学意 义(P<0．01)；比较对照组A与对照组B乳腺组织 中的CyclinDl含量，差异无统计学意义(P>0．05)。 图4肥大乳房组织CyclinDlWestern．blot结果(36KD) 图5正常乳房组织CyclinDIWestern—blot结果(36KD) 图6小乳房组织CyclinDlWestern—blot结果(36KD) 表1 ER蛋白的表达 组间比较 组问比较 组问比较 实验组 对照组A 对照组B 对照组A 对照组B 实验组 <0．Ol O．33l <0．Ol 表3 CyclinDl的表达 组别 组另Ⅱ P值 3讨论 3．1 ER在乳房肥大症、正常乳腺和小乳症组织中 的表达 乳腺作为性激素的靶器官，其生长发育和功能 均依赖于性激素的支持，其中雌激素尤为重要。目 前研究表明雌激素是通过靶器官中的ER介导发挥 作用。根据激素和受体之间消长关系，激素通过结 合受体而起作用，在非恶性乳腺疾病中ER高水平 的表达是乳腺组织对循环中雌激素敏感性增高的表 现。既往研究显示正常乳腺中ER呈低水平表达， 甚至低于所能检测的水平。Silva等⋯研究表明，在 正常乳腺中ER含量非常低(<10fmol／mg)，但却随 月经周期有较大的变化范围(0．6fmol／mg～ 7．5fmol／mg)。Speirs等旧。采用RT．PCR和免疫组化 方法分别从mRNA水平和受体蛋白水平证实，可在 正常乳房组织中检测到ER的表达。 迄今为止，乳房肥大症的发生原因尚不清楚，虽 有人认为可能与雌激素增多有关，但在以往文献中 未见青春期乳房肥大症患者有高雌激素血症的存 在。另一种观点认为乳房肥大症的发生可能与乳腺 组织中ER含量增高导致血循环中正常水平的雌激 素敏感性增高有关。众多学者对此有不同的研究结 果。Jabs等∞o用细胞液提取物放射性雌二醇技术检 测25份乳房肥大症标本中ER的含量，未检测到 ER(ER含量<3fmol／mg)，认为巨乳症与ER增加 无关。Morimoto等H1用葡聚糖炭吸附技术(DCC)， Noczynska等"1用免疫组化技术均在青春期巨乳症 患者中发现其乳腺组织中ER表达增加。秦映芬 等№1采用免疫组化sP法测定lO饲巨乳症组织中 ER的表达情况，显示ER的阳性表达率高达 万方数据 中华内分泌外科杂志2009年lo月第3卷第5期ChinJEndocrSurg，October2009，V01．3，No．5—307— 62．5％，而且在乳房大的患者中ER的阳性表达率 高。因此认为巨乳症的发生与乳腺组织对雌激素的 敏感性增强有关。 本研究观察到，ER在乳腺组织中的表达，在实 验组与对照组B和对照组A的组间比较，差异均有 统计学意义(P<0．01)；而在对照组B和对照组A 间比较差异无统计学意义(P>0．05)。由此提示青 春期乳房肥大症的发生可能与乳腺组织中ER的表 达有关。以往的研究表明，在乳腺增生、乳腺纤维腺 瘤患者的病变组织中也存在ER表达升高，然而乳 房肥大并不是这些病变的特征性伴随症状。因此认 为青春期乳房肥大症的发生是受多种因素共同调控 的一个复杂的病理过程，乳腺组织中ER的表达增 加可能是导致青春期乳房肥大症发生的一个因素， 对其他发病因素及其相互间的作用机制尚有待于进 一步研究。 3．2 CydinDl在乳房肥大症、正常乳腺和小乳症 组织中的表达 细胞增殖是巨乳发病过程中最重要的细胞活动 之一，由此提示可从细胞周期调控的角度来探讨乳 房肥大症的发病机制。CyclinDl是1991年自甲状 旁腺癌时首先分离的，主要包括CyclinDl、D2和D3 3个亚型。目前对CyclinDl的研究最为深入，编码 人类CyclinDl蛋白的基因CCNDl位于11q13染色 体上，全长约15kb，含有5个外显子和4个内含子， 编码含有295个氨基酸，分子量约为34kd的蛋白产 物，即CyclinDl蛋白。CyclinDl在人体正常组织中 表达水平较低。Bartkova等"1利用免疫组化方法检 测正常乳腺组织中CyclinDl的表达情况，发现乳腺 各期包括静止期、增殖期和哺乳期染色均很弱甚至 检测不到。虽然CyclinDl在正常乳腺组织中的表 达水平极低，但它却是乳腺组织生长发育过程中关 键的调控因子。研究发现【8’9J，CyclinDl缺失的雌 性小鼠在妊娠期时乳腺上皮细胞不能大量增殖，从 而导致乳腺小叶发育明显缺陷，不能哺乳。另外， Wang等¨刨通过对转基因小鼠的研究证实，乳腺组 织细胞中CyclinDl过表达将引起乳腺组织细胞的 异常增殖，促进乳腺组织形成导管分支和乳腺小叶。 本研究观察到，CyclinDl表达在实验组与对照 组B和对照组A的组间比较，差异均有统计学意义 (P<0．01)。而在对照组B和对照组A的组问比 较，差异无统计学意义(P>0．05)。由此提示青春 期乳房肥大症的发生可能与乳腺组织中CyclinDl 的表达情况有关。认为CyclinDl可能是乳腺组织 周围各种生长因子的感受器及信息传导者。另外， 由于CyclinDl本身也是细胞周期的正性调控因子 之一，因此它的表达增加可能会促进乳腺组织细胞 周期的进展，加速细胞增殖，形成乳房肥大。 对青春期乳房肥大症乳腺组织中CyclinDl蛋 白表达增加的原因我们认为可能与乳腺组织中ER 表达增加有关。研究显示，在乳腺癌组织中Cy— clinDl基因和蛋白的过度表达与ER的表达呈正相 关，因此有学者认为CyclinDl基因是ER调控的基 因，雌激素能在细胞周期Gl期的早至中期增加Cy— clinDl蛋白的水平，促进细胞的增殖。CyclinDl在 一定程度上依赖雌激素及其受体的存在。 参考文献 [1]SilvaJS，GeorgladeGS，DilleyWG，eta1．Menstrualcycle—de— pendentvariations0fbreastcystfluidproteinsand醍xsteroidre- ceptersinthenormalhumanbreast[J]．Cancer，1983，51(7)： 1297一1302． [2]SpeirsV，AdamsIP，WaltonDS，eta1．Identificationofwild—type andexon5deletionvariantsofestrogenreceptorbetainnormalhu— mar-mammarygland[J]．JClinEndocrinolMetab，2000，85(4)： 160l一1605． 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