乳牙急性根尖周脓肿细菌的DGGE分析

基金项目 :国家自然科学基金资助 ( 30572037) , 北京市自然科 学基金资助 (7062028) 作者单位 : 100050北京 首都医科大学附属北京口腔医院研究所 (杨秋波 ) ,首都医科大学口腔医学院 2002级 7年制学生 (樊鲁娜 ) , 首都医科大学附属北京口腔医院儿科 (时清 ) 通讯作者 : 时清 , E2mail: dentshi @ yahoo1com1cn, 电话 : 0102 67099200 乳牙急性根尖周脓肿细菌的 DGGE分析 杨秋波 　樊鲁娜 　时清 　　【摘要 】　目的 　用 PCR2DGGE分析乳牙急性根尖周脓肿细菌 ,以期进一步阐明乳牙急性根尖周脓肿细 菌病因学特点。方法 　采取乳牙急性根尖周脓肿脓液 ,提取细菌总 DNA,采用通用引物对细菌 16S rRNA 基因的 V22V3区进行扩增 , PCR产物进行变性梯度凝胶电泳 ,切取电泳的条带进行 DNA回收 , PCR再次扩增后进行克隆 测序 ,鉴定细菌 ,分析细菌组成。结果 　乳牙急性根尖周脓肿优势菌的检出从高到低依次是普雷沃菌 9019% ,梭 杆菌 8118% ,消化链球菌 6316% ,卟啉单胞菌 4515% ,链球菌 4515% ,真杆菌 4515% ,乳酸杆菌 2713% ,弯曲菌 2713% ,密螺旋体 2713% ,布雷德菌 2713%。结论 　乳牙急性根尖周脓肿细菌存在个体差异 ,某些特定细菌以较 高频率存在。细菌 16S rRNA基因 PCR2DGGE,切胶 ,克隆测序方法除检测出培养法检出的细菌外 ,还检出难培养 的和未预料到的细菌。 【关键词 】　乳牙根尖脓肿 ; 　细菌 ; 　变性梯度凝胶电泳 【中图号 】　R78812　【文献标识码 】　A　【文章编号 】　10062673X (2009) 0420223203 PCR2D GGE, clon ing and sequence ana lysis of bacter ia a ssoc ia ted w ith acute per iap ica l abscesses in ch ildren 　 YANG Q iu2bo, Fan Lu2na, SH I Q ing1B eijing Institu te forD en ta l Research, Capita lM edical U niversity School of S tom atology, B eijing 100050, China 【Abstract】　O bjective 　 To exam ine the p redom inant bacteria associated with acute periap ical abscesses of deciduous teeth1M ethods　 Pus was collected from 11 children diagnosed as acute abscesses of endodontic origin, and DNA was extracted to evaluate the p redom inant bacteria by using 16S rRNA PCR2DGGE, cloning and sequence analysis1Results　 The most p revalent phylotypes of bacteria found were: P revotella 9019% , Fusobacterium 8118% , Pepto2 streptococcus 6316% , Porphyrom onas 4515% , S treptococcus 4515% , Eubacterium 4515% , L actobacillus 2713% , Cam pylobacter 2713% , Treponem a 2713% , B ulleid ia 2713%. Conclusion　The finding of the p resent study indicates that PCR2DGGE, cloning and sequencing methods could p rovide additional knowledge regarding the m icrobiota of acute periradicular abscesses by detecting bacteria that are difficult to grow or unexpected1 【Key words】　Periap ical abscesses; 　Bacteria; 　DGGE 　　乳牙急性根尖周脓肿感染主要来源于炎症或坏 死的牙髓 ,常引起乳牙疼痛和粘膜肿胀 ,严重时伴有 全身症状 ,治疗不及时 ,引起口腔颌面部感染 ,甚至 危及生命。细菌是急性根尖周脓肿最主要的致病因 素。脓液引流、根管治疗是急性期常见的治疗方法 , 抗生素治疗有助于控制疾病发生发展。抗生素的合 理利用 ,基于对微生物病因学深入的认识。一些学 者运用培养方法 ,鉴定与急性根尖周脓肿有关的菌 种 ,发现急性根尖周脓肿是多细菌的混合感染 ,厌氧 菌占优势 [ 1 ] ,检出率较高的细菌是普氏菌、消化链 球菌和具核梭杆菌 [ 223 ]。近年来基于细菌 16S rRNA 基因的分子生物学技术研究显示 ,口腔中 50%的细菌为未培养出的细菌 [ 4 ]。分子生物学方法能够检测出未培养出的细菌。因此 ,有必要用分子生物学方法研究乳牙急性根尖周脓肿的主要致病菌。这方面的研究报道较少。变性梯度凝胶电泳 ( denaturinggradient gel electrophoresis, DGGE)技术可在聚丙烯酰胺凝胶中显示主要的病原菌条带。通过切取凝胶中的条带作克隆测序 ,可进行细菌的鉴定 ,明确主要致病菌。我们选择乳牙急性根尖周脓肿 11例 ,采取脓液标本 ,提取脓液细菌总 DNA, PCR扩增 , DGGE电泳分离 ,切取 DGGE条带进行 DNA提取 ,进一步 克隆测序 ,分析脓肿中的主要细菌组成。 材料和方法 11材料 DNA Marker DL2000 ( TaKaRa,日本 ) ; W izardÓ Genom ic DNA Purification Kit试剂盒 ( Promega,美 国 ) ; 2 x HotStart PCR MasterM ix和纯化、回收试剂 ·322·北京口腔医学 　2009年第 17卷第 4期 　Beijing Journal of Stomatology　August 2009, Vol1 17, No14 盒 (天根生物技术有限公司 ,北京 ) ;引物合成和基 因测序由北京奥科生物技术有限公司完成 ,其他常 规试剂均为国产分析纯。B io2Rad DcodeTM系统电 泳仪 (伯乐 ,美国 )。 21患者选择及脓液采集 随机选择来我院儿科就诊 ,诊断为急性根尖周 脓肿的患儿 11例 [ 5 ] , 5～8岁 ,男 5例 ,女 6例。患 儿无全身系统疾病 , 3月内未服用抗生素 ,乳牙处于 牙根稳定期 ,脓肿尚未与口腔相通 ,处于粘膜下脓肿 阶段 ,牙周探诊深度小于 4mm。牙体组织龋坏 ,未 探及穿髓孔。第一乳磨牙 5颗 ,第二乳磨牙 6颗。 脓肿表面牙龈 1%碘酒消毒 ,脓肿穿刺 , 40 #无菌纸 捻 1根插入脓腔中吸取脓液 10 s, 3次 ,将纸捻置入 1 m l PBS液中 , 220℃保存。 31脓液样本细菌基因组的提取 用 DNA提取试剂盒提取基因组 DNA, 220°C保 存。 41PCR扩增 以脓液样本细菌基因组 DNA为 ,以 HAD2 12GC: 5′2CgCCCggggCgCgCCCCgggCggggCgggggCA CggggggACTCCTACgggAggCAgCAgT23′, HAD22: 5′2 gTATTACCgCggCTgCTggCAC23′为 引 物 [ 6 ] , 用 HotStart PCR MasterM ix, PCR 扩增细菌 16S r RNA 基因 V22V3可变区片段 ,扩增长度为 240bp左右。 蒸馏水为模板为阴性对照。扩增条件 94°C 5m in; 94°C 40 s, 56°C 40 s, 72°C 1m in, 30 次循环 ; 72°C 10m in。1% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。 OD260PCR产物定量。 51变性梯度凝胶电泳 采用电泳仪 ,每样本上样 15ng,变性剂梯度 30% ～60%。100%变性相当于 7M尿素和 40%去 离子甲酰胺 , 8% (w /v)丙烯酰胺凝胶 ,恒定电压 150V,恒定温度 60℃, 1 ×Tris2acetate2EDTA缓冲液 电泳 4h。用 Gel Red染色 40m in,凝胶成像系统拍 照。 61DGGE凝胶切胶回收 DNA, PCR扩增 切取 DGGE条带 , B iosp in聚丙烯酰胺凝胶 DNA 回收试剂盒回收 DNA , HAD212GC, HAD22去掉 GC 夹为引物 , PCR扩增 ,用 HotStar PCR MasterM ix, PCR 扩增 ,扩增条件 94°C 5m in; 94°C 40 s, 50°C 40 s, 72°C 1m in, 30次循环 ; 72°C 10m in。PCR产物 1%琼脂糖 凝胶电泳。胶回收试剂盒回收 PCR 产物 DNA, OD260PCR产物定量。 71基因克隆 胶各条带回收的 DNA分别与 pGEM 2T克隆质 粒用 T4连接酶连接 ,转化大肠杆菌 E1coli DH5α, 挑取菌落 PCR扩增鉴定 ,每条带样本选择 8个克 隆 ,提质粒送北京奥科生物技术有限公司测序。 81细菌鉴定 测序结果与美国国立卫生研究院 GenBank收 录的基因序列比对 ,鉴定细菌。鉴定为相似性 达到 99%以上。 结 果 11乳牙急性根尖周脓肿细菌 16S rRNA 基因 V22V3区的 PCR扩增 以 11个乳牙急性根尖周脓肿脓液 DNA 为模 板 ,细菌 16S rRNA基因恒定区基因序列为通用引 物 ,扩增细菌 16S rRNA基因 V22V3可变区 , PCR产 物琼脂糖凝胶电泳 ,阴性对照未见扩增条带。每份 脓液样本均扩增出单一的约 240bp 的条带 ,与目的 片段大小一致 (图 1)。 M:Marker, K:阴性对照 , 1211:临床样本 图 1　乳牙急性根尖脓肿细菌 16S rDNA PCR扩增产物 21乳牙急性根尖周脓肿优势菌 11例乳牙急性根尖脓肿脓液细菌检出情况 ,普 雷沃菌 10例 (9019% ) ,梭杆菌 9例 (8118% ) ,消化 链球菌 7例 ( 6316% ) ,卟啉单胞菌 5例 ( 4515% ) , 链球菌 5例 ( 4515% ) ,真杆菌 5例 ( 4515% ) ,乳杆 菌 3例 (2713% ) ,弯曲菌 3例 (2713% ) ,密螺旋体 3 例 (2713% ) ,布雷德菌 3例 ( 2713% ) ,卡氏菌 2例 (1812% ) ,放线杆菌 2例 (1812% ) ,消化球菌 1例 (911% ) , 韦 荣 菌 1 例 ( 911% ) , 奈 瑟 菌 1 例 (911% ) , B acteroida les genom osp P4 oral clone MB2 _ G17例 1 (911% ) ,嗜热芽孢杆菌 1 (911)。 讨 论 过去 ,根尖脓肿的细菌学研究主要采用培养方 法。由于 50%的口腔微生物是不可培养出的 ,传统 培养方法的应用受到未能培养出的细菌限制。另 ·422· 北京口腔医学 　2009年第 17卷第 4期 　Beijing Journal of Stomatology　August 2009, Vol1 17, No14 外 ,死亡或难培养的细菌导致培养法检出率低。一 些学者采用不需要细菌培养的棋盘氏 DNA2DNA杂 交技术研究口腔感染的病原菌 ,其只能检测有目的 的微生物。PCR2DGGE方法能够检测未预料到的或 难培养的细菌。本研究采用 PCR2DGGE,切胶 ,克隆 测序方法乳牙根尖周脓肿的细菌组成 ,以期进 一步理解急性根尖周脓肿的病原菌。有学者采用切 胶条带回收 DNA直接测序 ,由于杂峰的存在 ,序列 比对结果相似度低。本研究采用切胶后再次 PCR, 克隆测序方法 ,测序结果相似度较高 ,达 99%以上。 本研究中 ,检出频率较高的细菌依次是普雷沃 菌、梭杆菌、消化链球菌、卟啉单胞菌、链球菌、真杆 菌、乳酸杆菌、弯曲菌、螺旋体、布雷德菌。结果与以 前的培养法和非培养法研究结果相似。培养法显示 乳牙急性根尖周炎的根管优势菌为产黑色素普雷沃 菌、微小消化链球菌。分子生物学法全面研究乳牙 急性根尖周脓肿脓液细菌的报道少见。B rook等 [ 7 ] 培养鉴定包括 6个儿童的 39例急性根尖周脓肿的 细菌。检出频率较高的细菌依次是普雷沃菌、卟啉 单胞菌、消化链球菌和梭杆菌。 Siqueira等 [ 8 ]采用 棋盘式 DNA2DNA杂交技术 ,用 49个目的菌种的探 针研究急性根尖周脓肿的细菌组成 ,检出率较高的 细菌依次是福赛斯坦纳菌 2916%、牙龈卟啉单胞菌 2916%、星座链球菌 2519%、中间普雷沃菌 2212%、 变黑普雷沃菌 2212%、牙周梭杆菌 1815%、具核梭 杆菌 1815%及侵蚀艾肯菌 1815%。急性颌面部牙 源性感染主要由革兰氏阳性厌氧球菌和革兰氏阴性 厌氧杆菌组成。检出率较高的革兰氏阳性厌氧球菌 有消化链球菌和咽颊链球菌。检出率较高的革兰氏 阴性厌氧杆菌有普雷沃菌、卟啉单胞菌、福赛斯坦纳 菌和具核梭杆菌。最近的研究采用 PCR,克隆测序 技术鉴定播散性口源性感染的病原菌 ,结果显示 1 /2 的细菌为普雷沃菌。本研究结果与其它同类研究类 似 ,检出率最高的细菌是普雷沃菌。普雷沃菌的致 病机制尚不清楚。 尽管本研究采用 PCR2DGGE方法检测的细菌 结果与培养方法的相似 ,仍有差别存在。11个样本 中 3个样本检出牙密螺旋体。由于牙密螺旋体的培 养对厌氧的要求极其严格 ,培养方法常出现假阴性。 与培养方法比较 ,基于细菌 16S rRNA的分子生物 学方法不需要在取样时保持厌氧 ,不需要特殊的传 送培养基及分离菌株的培养。分子生物学方法的这 些优点使此种技术能够检测出不可培养出的和难以 培养的细菌。最近的研究采用棋盘氏 DNA2DNA杂 交技术显示 27个急性根尖周脓肿中有 1例牙密螺 旋体阳性。根尖周炎的乳牙根管及根尖生物膜中均 检测出螺旋体的存在 ,小鼠皮下接种各种密螺旋体 能够引发脓肿形成 ,密螺旋体的主要毒性因子有胰 凝乳朊酶、脂寡糖、脂蛋白、磷脂酶、醋酸、乳酸、氨及 硫化氢等。基于以上研究 ,牙密螺旋体有可能是急 性根尖周脓肿的病原菌。 培养方法未检测出布雷德菌。 Siqueira等 [ 8 ]采 用棋盘式 DNA2DNA杂交技术 ,研究急性根尖周脓 肿的细菌组成 , 49个目的菌种的探针中不包括布雷 德菌探针。本研究中 , 11个脓肿样本 4个布雷德菌 检出阳性。最近的研究采用 PCR,克隆测序技术鉴 定播散性口源性感染的病原菌 ,结果 4%的克隆为 布雷德菌 [ 9 ]。由此可见 , PCR2DGGE方法能够检测 未预料到的细菌。 本研究应用 PCR2DGGE,切胶 ,克隆测序方法研 究急性根尖周脓肿的细菌组成 ,除检测出培养法检 出的细菌外还检出难培养的和未预料到的非目的细 菌。本文结果只是对少量样本细菌检出率的检测 , 有必要进一步进行大样本定量分析。 参 考 文 献 1 W illiam s BL, McCann GF, Schoenknecht FD1Bacteriology of dental abscesses of endodontic origin1J Clin M icrobiol, 1983, 18 ( 4) : 7702 7741 2 Stefanopoulos PK, Kolokotronis AE1The clinical significance of anaerobic bacteria in acute orofacial odontogenic infections1O ral Surg O ralMed O ral Pathol O ral Radiol Endod, 2004, 98 (4) : 39824081 3 de Sousa EL, Ferraz CC, GomesBP, et al1Bacteriological study of root canals associated with periap ical abscesses1O ral Surg O ral Med O ral Pathol O ral Radiol Endod, 2003, 96 (3) : 33223391 4 Dymock D, W eightman AJ, Scully C, et al1Molecular analysis of m icroflora associated with dentoalveolar abscesses1J Clin M icrobiol, 1996, 34 (3) : 53725421 5 樊明文 ,周学东 1牙体牙髓病学 1北京 :人民卫生出版社 1第 2 版 12004, 15021551 6 Burton JP, Cadieux PA, Reid G1 Imp roved understanding of the bacterial vaginal m icrobiota of women before and after p robiotic instillation1App l Environ M icrobiol, 2003, 69 (1) : 9721011 7 B rook I, Frazier EH, GherME1Aerobic and anaerobic m icrobiology of periap ical abscess1O ralM icrobiol Immunol, 1991, 6 (2) : 12321251 8 Siqueira JF J r, RÉÔas IN, Souto R, et al1M icrobiological evaluation of acute periradicular abscesses by DNA2DNA hybridization1O ral Surg O ralMed O ral Pathol O ral Radiol Endod, 2001, 92 (4) : 45124571 9 R iggio MP, Aga H, Murray CA, et al1 Identification of bacteria associated with sp reading odontogenic infections by 16S rRNA gene sequencing1O ral Surg O ral Med O ral Pathol O ral Radiol Endod, 2007, 103 (5) : 61026171 (2009年 4月 23日收稿 ) ·522·北京口腔医学 　2009年第 17卷第 4期 　Beijing Journal of Stomatology　August 2009, Vol1 17, No14