微生物学实验操作大全

微生物学实验指导书 《微生物学》 实验指导书 目 录 实验一 培养基的配制 实验二 消毒与灭菌 实验三 显微镜油浸系物镜的使用 实验四 细菌形态的观察 实验五 细菌的革兰氏染色 实验六 放线菌的形态观察 实验七 酵母菌的形态观察 实验八 霉菌的形态观察 实验九 细菌数量的测定(设计性实验) 实验十 微生物的接种方法 实验一 培养基的配制 一、实验目的和 目的：学习和掌握配置培养基的一般方法和步骤 内容：1、牛肉膏蛋白胨的配制 2、高氏1号培养基的配制 3、马丁氏培养基的配制 二、实验材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/l NaOH、1mol/l HCl、KNO3、NaCl 、K2HPO4*3H2O、MgSO4*7H2O、 FeSO4*7H2O。 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布 三、操作步骤 （一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15~20g，水1000ml，pH7.4~7.6 1、称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯，牛肉膏极易吸潮，故称量时要迅速。 2、加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失水分。 3、调pH 检测培养基的pH，若偏酸，可滴加1mol/l NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/l HCl进行调节。PH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不可调过头，以免调回影响培养基内各离子的浓度 4、过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，这步可以省略。 5、分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。 6、加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞，棉塞制作方法如图1—1。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。 7、包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。 8、灭菌 将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。 9、摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜面，使斜面的长度不超过试管总长的1/2。 10、无菌检查 将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24~48h，无菌生长即可使用。或储存于冰箱或清洁的橱内，备用。 （二）高氏一号培养基的配制 高氏一号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下： 可溶性淀粉20g，KNO3 1g、NaCl 0.5g 、K2HPO4*3H2O 0.5g、MgSO4*7H2O0.5g、 FeSO4*7H2O 0.01g，琼脂15~20g,水1000ml，pH7.4~7.6。 1、称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加入至少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4*7H2O可先配制成高浓度的储备液再加入，方法是先在100ml中加入1g的FeSO4*7H2O，配成浓度为0.01g/ml的储备液，再在1000ml培养基中加入以上储备液1ml即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 2、pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基的配制 （三）马丁氏培养基的配制 马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下： K2HPO41g、MgSO4*7H2O0.5g，蛋白胨5g，琼脂15~20g，水1000ml，自然pH。 1、称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取各成分，并将其溶解在少于所需量的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000ml培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3ml，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 2、pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基的配制 3、链霉素的加入 链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降低至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液（配好的链霉素溶液保存于零下20℃），在100ml培养基中加1%链霉素0.3ml，使每毫升培养基中含链霉素30ug。 四、注意事项 称药品用的牛角匙不能混用；称完药品应及时盖紧瓶盖。调pH时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。 五、演示 1、培养基的分装方法 2、试管斜面的搁置方法 六、实验 本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。 七、问题与思考 1、配制培养基有哪几个步骤？在操作过程中应注意些什么问题？为什么？ 2、培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌？若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培养基如何进行无菌检查？ 3、试设计实验对饮料进行无菌检查 实验二 消毒与灭菌 一、实验目的和内容 目的：了解消毒和灭菌的原理,并掌握各种灭菌方法的操作步骤。 内容：1、高压蒸汽灭菌法 2、干热灭菌法 3、过滤除菌法 二、实验材料和用具 待灭菌的培养基和链霉素溶液 手提式(或立式)高压蒸汽灭菌锅、电热烘箱、过滤除菌器、培养皿、试管。 三、操作步骤 （一）高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌。 1、加水 将高压蒸汽灭菌锅内桶取出,外桶内加水与三角架平。 2、装料 装待灭菌物品,瓶塞不要紧靠桶壁,防冷凝水湿棉塞。 3、加盖 将排气软管插入内桶排气槽内,对齐螺口,同时拧紧。并打开排气阀。 4、排气 排出的气流很强时,表明锅内空气已排尽(约5分钟) 。(开关.压力控制旋钮) 5、升压 锅内空气排尽时, 关闭排气阀,开始升压。 6、保压 压力表达所需压力时,控制热源,开始计时并维持压力,本实验用 121 ℃ (98kPa. 1.05kg/cm2), 20min灭菌。 7、降压 达所需(20min)时间,关闭热源,自然降压到 0 , 打开排气阀,放净余气,开盖取物放净余水。 8、无菌检查 将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24~48h，无菌生长即可使用。 （二）干热灭菌法 干热灭菌法适用于玻璃器皿,如试管、培养皿、三角瓶等物品的灭菌。 1、装入待灭菌物品 预先用纸或金属盒筒装好待灭菌物品,放入电热烘箱内。 2、升温 关门通电,旋动恒温调节器至所需温度(本实验所需温度 160-170℃),烘箱红灯亮示加热,绿灯亮示停止加温。 3、恒温 维持 2 h。 4、降温 断电自然降温。 5、取出灭菌物品 温降至 70℃ 以下时开门取物。 （三）过滤除菌法 过滤除菌法适用于易受热分解的材料,如抗生素、血清、维生素等的除菌。 如滤膜过滤器、蔡氏滤器、玻璃滤器过滤等。 四、注意事项 1、高压蒸汽灭菌要按程序操作,不能离开,压力降至 0 时开盖。 2、干热灭菌物品不能太挤,物品不要与壁板接触,以免烤焦。 3、过滤除菌的各连接处要结合紧密,以防污染。 五、实验报告 1、记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件(温、压等)。 2、试述高压蒸汽灭菌的操作过程及注意事项。 实验三 显微镜油浸系物镜的使用 一、实验目的和实验内容 目的：复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法 内容：1、学习油浸系物镜的使用方法 2、用油镜观察细菌三型和放线菌染色装片 二、实验材料和用具 细菌三型、放线菌的染色装片，香柏油、二甲苯，显微镜、擦镜纸。 三、操作步骤 （一）观察前的准备 1、将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距离实验台边沿约4厘米。坐正，练习用左眼观察。 2、调节光源：将低倍镜转到工作位置，将光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约一微米左右。转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察未染色装片时，光线不宜太强。 （二）低倍镜观察染色装片 首先上升镜筒，将细菌三型染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距离装片0.5厘米处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升（或使镜台下降）至发现物象时，改用细调节器调节到物象清楚为止。移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。 （三）高倍镜观察 眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相撞。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物象清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。 （四）油镜观察 1、提起镜筒约2厘米，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位（镜头的正下方）滴一滴香柏油。 2、从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩散为止，镜头几乎与玻片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。 3、将光圈调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升（切忌反放向旋转），当视野中出现物象时，改用细调节器调节到物象清楚为止。如因镜头下降未到位或镜头上升太快未找到物象，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物象看清为止。仔细观察并绘图。 4、再次观察 提起镜筒，换上放线菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。 （五）镜检完毕后的工作 1、​ 提起镜筒，或降下载物台 2、​ 移开物镜镜头 3、​ 取出装片 4、​ 清洁油镜 油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。 5、​ 擦净显微镜，将各部分还原。将物镜呈“八”字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。 四、注意事项 1、使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察的程序操作。 2、下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。 3、使用二甲苯擦镜头时，注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。 4、注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。 五、演示 如何使用油镜观察染色装片的要点，如滴油、下降镜头、调焦、擦拭镜头等 六、实验报告 分别绘出在高倍镜和油镜下观察到的枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌的形态，注明物镜放大倍数和总放大率 七、问题和思考 1、用油镜便于观察细菌的依据是什么？ 2、使用油镜应特别注意哪些问题？ 3、当物镜从低倍镜转换到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求？应如何调节？ 实验四 细菌形态的观察 一、实验目的和实验内容 目的：巩固油镜的使用；掌握细菌形态观察的基本方法，了解细菌的基本形态 内容：1、观察细菌的基本形态染色装片 2、观察枯草芽孢杆菌活菌 3、观察细菌细胞结构的染色装片 二、实验材料和用具 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌；变形菌装片 三、操作步骤 （一）、观察细菌的基本形态 用低倍镜、高倍镜和油镜观察大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、变形菌的染色装片，并分别在油镜下绘图 （二）、观察枯草杆菌活菌(常用压滴法)： 1、​ 将洁净无油腻的载片放于自己正前方，在中央放一滴无菌水 2、​ 将酒精灯放于自己正前方，点燃 3、​ 用无菌操作方法从枯草芽孢杆菌斜面中沾取少量菌体，与载片上的随地充分混匀，把接种环上残留的菌体杀灭后，放回试管架 4、​ 用镊子夹一洁净的盖玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻片慢慢放下，注意不要产生气泡。如菌液过多，可用吸水纸吸去一部分。 5、​ 先用低倍镜然后转用高倍镜观察，观察时光线要适当调暗一些。 四、注意事项 1、​ 注意擦镜头时，只能用擦镜纸 2、​ 观察完毕，必须将镜筒上升，才能取下装片，放入另一装片后，要按使用油镜要求，重新操作，不能在油镜下直接取下和替换装片 3、​ 无菌操作过程中，接种环美军后不能触及其他物品，挑菌不能过多 五、演示 1、​ 细菌细胞结构装片示范镜 2、​ 无菌操作过程 3．怎样盖盖玻片才不产生气泡。 六、实验报告 (1)​ 绘图 1．​ 绘出你所观察到的几种细菌的个体形态视野图 2．​ 绘出你所观察到的细菌细胞结构视野图，并注明各部分 (2)​ 试指出在制备活菌装片时，应注意什么问题? 七、​ 问题与思考 1．用明视野显微镜观察细菌的形态时，你认为用染色装片好，还是用非染色的活体装片好，为什么?观察活体装片与染色装片，光线调节各有什么不同? 2．无菌操作过程中，可否将棉塞放在桌面上?为什么? 实验五 细菌的革兰氏染色 1、​ 实验目的和内容 目的：初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤 内容：1．制作细菌染色装片。 2．进行革兰氏染色法操作 2、​ 实验材料和用具 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(E．coli)菌液，待测菌菌液1～2种。革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、试管、小滴管 三、 操作步骤 （一）制片 1．涂菌 用无菌操作方法从试管中沽取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌 2．干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。 3．固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 (二)染色 1．初染 于制片上滴加结晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。 2．媒染 滴加卢戈氏碘液，1min后水洗。 3．脱色 滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚度需时30s至lmin)，水洗。 4．复染 滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。 5．用滤纸吸干，油镜镜检。 (三)结果 革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。 (四)检测未知菌 用以上方法对未知菌进行革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。 四、注意事项 1．涂片务求均匀，切忌过厚。 2．在染色过程中，不可使染液干涸。 3．脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌。 4．老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。 五、演示 制片方法及染色过程。 六、实验报告 (一)绘图 1．大肠杆菌革兰氏染色视野图。 2．金黄色葡萄球菌革兰氏染色视野图。 (二)记录革兰氏染色法法步骤，并进行结果分析。 （三）未知菌的检测结果。 七、问题和思考 1．涂片后为什么要进行固定?固定时应注意什么? 2．什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么? 3．试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。 实验六 放线菌的形态观察实验 一、实验目的和内容 目的：辨认放线菌的营养菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子的形态；学习放线菌的观察方法 内容：用水封片法、玻璃纸法、印片法观察放线菌的形态特征， 二、实验材料和用具 细黄链霉菌(Streptornyces micuoflavus)又称5406的培养平皿，棘孢小单孢菌(Micromonospra echinospora)的玻璃纸培养子皿。0．1％美蓝染色液、石炭酸复红染色液、盖玻片、载玻片、镊子、接种环、显微镜、涂布器、玻璃纸、打孔器 三、操作步骤 (1)​ 观察自然生长状态的放线菌 用镊子小心取出用插片法培养的5406菌培养皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦净。然后将长有菌的一面向上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。找出3类菌丝及其分生孢子，并绘图。注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。 （二）水封片观察 取一滴美蓝染色液置于载玻片中央，将用搭片法培养棘孢小单孢菌培养皿中的盖玻片取出，并将有菌面朝下，放在载玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍镜观察其单个分生孢子及其基内菌丝，并绘图 （三）玻璃纸法的镜检观察 1、直接玻璃纸观察 分别用5406和棘转孢小单孢菌的玻璃纸制片观察。制片时，于载玻片上放一小滴蒸馏水，将含菌玻璃纸片小心剪下一小块，移至载玻片上，并使有菌面向上。在玻璃纸与载玻片间不能有气泡，以免影响观察。将制片于显微镜下观察，先用低倍镜观察菌的立体生长状况，再用高倍镜仔细观察。注意区分5406菌的基内菌丝、气生菌丝和弯曲状或螺旋状的孢子丝观察棘孢小单孢菌时注意把视野调暗，其基内菌丝纤细发亮，其单个分生孢子发暗，直接生长在基内菌丝长出的小梗上。绘图 2、印片染色法观察 用镊子取洁净载玻片并微微加热，然后用这微热载玻片盖在长有5406或棘孢小单孢菌的平皿上，轻轻压一下，注意将载玻片垂直放下和取出，以防载玻片水平移动而破坏放线菌的自然形态。反转有印痕的载玻片微微加热固定，用石炭酸复红染色lmin，水洗，晾干用油镜观察。绘图。注意比较两种菌的形态特征有何不同。 四、注意事项 1、培养放线菌中要注意，放线菌的生长速度较慢，培养期较长，在操作中应特别注意无菌操作，严防杂菌污染 2．玻璃纸法培养接种时注意玻璃纸与平板琼脂培养基间不宜有气泡，以免影响其表面放线菌的生长 3．不同观察方法中严格按要求进行，注意菌体的上下位置 五、演示 1.​ 几种不同的培养方法。 2.​ 几种观察方法的要点和注意事项 3.​ 5406菌及棘孢小单孢菌形态的示范镜。 六、实验报告 1、绘图 玻璃纸法、水封片法、印片法及自然生长状态下观察的放线菌形态 2、试比较5406菌与棘孢小单孢菌特征的异同 七、问题和思考 1、在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝? 2、用插片法和搭片法如何制备放线菌标本，其主要优点是什么?可否用此法观察其他微生物？为什么？ 注： (一)插片法和搭片法培养放线菌 1．插片法 (1)制平板、接种：用冷却至约50℃的高氏1号琼脂培养基倒平板(每皿约20mL)，可用两种方法 A先接种后插片：冷凝后用接种环挑取少量斜面上的5406菌孢子，用平板培养基的一半面积作来回划线接种（接种量可适当加大）。 B先插片后接种：用平板培养基的另一半面积进行。 (2)插片及培养：用无菌镊子取无菌盖玻片，在已接种平板上以45‘角斜插入培养基内，插入深度约占盖玻片1／2长度。同时，在另一半未经接种的部位以同样方式插入数块盖玻片，然后接种少量5460菌孢子至盖玻片一侧的基部，且仅接种于其中央位置约占盖玻片长度的一半左右，以免菌丝蔓延至盖玻片的另一侧。将插片平板倒置于28℃，培养3～7d 2．搭片法 (1)开槽及接种：用无菌打孔器在凝固后的平板培养基上打洞数个，并将棘孢小单孢菌孢子划线接种到洞内边缘。 (2)搭片及培养：在接种后的洞面上放一无菌盖玻片。平板倒置于28℃，培养3～7d。 (二)玻璃纸法固体培养5406菌和棘孢小单孢菌 1．玻璃纸灭菌 将玻璃纸剪成比培养皿直径略小的片状，将滤纸剪成培养皿大小的圆形纸片并稍润湿，然后把湿滤纸和玻璃纸交互重叠地放在培养皿中，借滤纸将玻璃纸隔开。然后进行湿热灭菌，备用。 2．制平板及铺玻璃纸 取冷凝后的高氏1号琼脂培养基，用无菌镊子将预先灭菌的块状玻璃纸平铺至平板培养基表面，铺玻璃纸时可用无菌涂布器将玻璃纸与培养基间的气泡除去。 3．涂布菌液及培养 取0．1mL的孢子悬液涂布在铺有玻璃纸的平板培养基表面。接种平板倒置于28℃，培养5～7d。 实验七 酵母菌的形态观察实验 1、​ 实验目的和内容： 目的：了解自然存在的酵母菌及其形态结构。了解酵母菌产生子囊孢子的条件及其形态 内容：1．观察酵母菌个体形态。 2．观察酵母菌的假菌丝和繁殖过程。 3．观察自然状态的酵母菌。 二、实验材料和用具 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)斜面菌种。 PDA培养基、麦氏(McCLary)培养基(醋酸钠培养基)、0．05％美蓝染色液(以pH 6．0的0．02mol／L磷酸缓冲液配制)、碘液、0．04％的中性红染色液、5％孔雀绿，0．5％沙黄液、95％乙醇。 显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环、V形玻璃棒、放置一个三角形玻璃棒支架的培养皿。 三、操作步骤 (一)酵母菌形态观察 1．酵母菌的活体染色观察及死亡率的测定 (1)以无菌水洗下PDA斜面培养的酿酒酵母菌苔，制成菌悬液。 (2)取0．05％美蓝染色液1滴，置载玻片中央，并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀，染色2～3min，加盖玻片，在高倍镜下观察酵母菌个体形态，区分其母细胞与芽体，区分死细胞(蓝色)与活细胞(不着色)。 (3)在一个视野里计数死细胞和活细胞，共计数5—6个视野。 酵母菌死亡率一般用百分数来表示，以下式来计算： 死亡率=死细胞总数/死活细胞总数（%） 2．酵母菌液泡系的活体观察 于洁净载玻片中央加一滴中性红染色液，取少许上述酵母菌悬液与之混合，染色5min，加盖玻片在显微镜下观察。细胞无色，液泡呈红色。 3．酵母菌细胞中肝糖粒的观察 将1滴碘液置于载玻片中央，接入上述酵母菌悬液，混匀，盖上盖玻片，显微镜观察，细胞内的贮藏物质肝糖颗粒呈深红色。 4．酵母菌子囊孢子的观察 (1)活化酿酒酵母：将酿酒酵母接种至新鲜的PDA培养基上，置28‘C培养2～3d，然后再移植2～3次。 (2)移接产孢培养基：将活化的酿洒酵母移接至醋酸钠培养基上，置30C恒温培养14d。 (3)观察：挑取少许产孢菌苔于载玻片的水滴上，经涂片、热固定后，加数滴孔雀绿，lmin后水洗，加95％乙醇30s，水洗，最后用o．5％沙黄液复染30s，水洗去染色液，最后用吸水纸吸干。制片干燥后，镜检，子囊孢子呈绿色，子囊为粉红色。注意观察子囊孢子的数目、形状和子囊的形成率。 (4)计算子囊形成的百分率：计数时随机取3个视野，分别计数产子囊孢子的子囊数和不产孢子的细胞，然后按下列公式计算： 子囊形成率(％)＝ 三个视野中形成子囊的总数/三个视野中（形成子囊的总数加不产豹子细胞总数） XlOO％ 5．酵母菌假菌丝的观察 取一无菌载玻片浸于溶化的PDA培养基中，取出放在湿室培养的支架上，待培养基凝固后，进行酵母菌划线接种，然后将无菌盖玻片盖在接菌线上，28℃培养2～3d后，取出载玻片，擦去载玻片下面的培养基，在显微镜下直接观察。可见到芽殖酵母形成的藕节状假菌丝，裂殖酵母则形成竹节状假菌丝。 6．自然状态下的酵母菌观察 取一滴美蓝染色液于载玻片中央，春夏秋季取酱油或淹菜上的白膜，冬季取腌酸菜汤上的白膜，将其置于载玻片染色液中，盖上盖玻片，显微镜下仔细观察酵母菌形态，出芽生殖，假菌丝等。 四、注意事项 1、用于活化酵母菌的麦芽汁培养基要新鲜、表面湿润。 2、在产孢培养基上加大移种量，可提高子囊形成率。 3、通过微加热增加酵母的死亡率，易于观察死亡细胞。 五、演示 1．酵母菌子囊及子囊孢子，酵母菌假菌丝的示范镜。 2．假菌丝培养的操作过程。 六、实验报告 (一)绘图 1．数个酵母菌细胞，示观察到的结构。 2．数个子囊及子囊孢子形态图。 (二)记录并计数酵母菌的死亡率及子囊形成率(原始记录及计算结果)。 七、问题和思考 ’ 1．酵母菌的假菌丝是怎样形成的?与霉菌的真菌丝有何区别? 2．如何区别营养细胞和释放出的子囊孢子? 3．试设计一个从子囊中分离子囊孢子的试验方案。 注： 酵母菌的简易培养 配2％葡萄糖水(或白糖水)，煮沸，装入三角瓶中(液面高度2~3cm)，加HCl调至pH3—4，放人几块葡萄皮(或其他糖分较高的果皮)，置25—28℃温箱中培养2-3d，闻到酒香味后，即可取培养液镜检。 实验八 霉菌的形态观察 一、实验目的和内容 目的：了解霉菌形态，掌握微生物载玻片湿室培养方法。 内容：1．霉菌载玻片湿室培养。 2．曲霉、青霉、根霉、毛霉形态观察。 3．根霉假根的观察。 二、实验材料和用具 产黄青霉、黑曲霉、黑根霉、总状毛霉等斜面菌种。 半固体PDA培养基、乳酸苯酚固定液、棉蓝染色液、20％甘油。 透明胶带、剪刀、培养皿、门形玻棒搁架、盖玻片、圆形滤纸片、细口滴管、镊子、显微镜、接种环、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环、吸水纸等 三、操作步骤 (一)霉菌的载玻片湿室培养 可4人合作，每人制作一霉菌的载玻片。 1．准备湿室 在培养皿底铺一张圆形滤纸片，其上放一“门”形载玻片搁架，在搁架上放一块载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，外用纸包扎，经121℃湿热灭菌30min后，置60℃烘箱中烘干，备用。 2．取菌接种 用接种环挑取少量待观察的霉菌孢子至湿室内的载玻片上，每张载玻片可接同一菌种的孢子两处。接种时只要将带菌的接种环在载玻片上轻轻碰几下即可(务必记住接种的位置)。 3．加培养基 用无菌细口滴管吸取少量融化约60℃的培养基，滴加到载玻片的接种处，培养基应滴得圆而薄，其直径约为0．5cm(滴加量一般以1／Q小滴为宜)。 4。加盖玻片 在培养基未彻底凝固前，用无菌镊子将皿内盖玻片盖在琼脂块薄层上、用镊子轻压，使盖玻片和载玻片间的距离相当接近，但不能压扁，否则不透气。 5．倒保湿剂 每皿倒人约3mL20％的无菌甘油，使皿内的滤纸完全润湿，以保持皿内湿度。 皿盖上注明菌名、组别和接种日期。此为制成的载玻片湿室，置28C恒温培养3～5de (二)黑根霉假根的培养 将融化的PDA培养基，冷却至50C倒入无菌平皿，其量约为平皿高度的1超。冷凝后，用接种环沾取根霉孢子，在乎板表面划线接种。然后将平皿倒置，在皿盖内放一无菌载玻片，于28℃培养2—3d后，可见根霉的气生菌丝倒挂成胡须状，有许多菌丝与载玻片接触，并在载玻片上分化出假根和匍匐菌丝等结构。 (三)镜检观察 1．湿室培养霉菌镜检载玻片 从培养16—20h开始，通过连续观察，可了解孢子的萌发、菌丝体的生长分化和子实体的形成过程。将湿室内的载玻片取出，直接置于低倍镜和高倍镜下观察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形态，重点观察菌丝是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特点，曲霉的足细胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。绘图。 2．粘片观察 取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，取一段透明胶带，打开霉菌平板培养物，粘取菌体，粘面朝下，放在染液上。镜检。 3．假根观察 将培养根霉假根的平皿打开，取出皿盖内的载玻片标本，在附着菌丝体的一面盖上盖玻片，置显微镜下观察。只要用低倍镜就能观察到假根及从根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构造。 4．制成永久装片 把观察到霉菌形态较清晰，完整的片子，制成标本作较长期保存。制备方法是，轻轻揭去盖玻片，如果载玻片上有琼脂，仔细挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，盖上清洁盖玻片，在盖玻片四周滴加树胶封固。 四、注意事项 载玻片湿室培养时，盖玻片不能紧贴载玻片，要彼此有极小缝隙，一是为了通气；二是使各部分 结构平行排列，易于观察。 五、演示 1．4种霉菌制片的示范。 2．载玻片湿室培养方法。 六、实验报告 (一)绘制镜检形态图 1、​ 毛霉和根霉形态图，示各部 2、​ 青霉和曲霉形态图，示各部 （二）载玻片观察纪录 各菌种的载玻片标本观察结果 菌种 菌丝体 （气生菌丝、营养菌丝的粗细、色泽，菌丝有隔或无隔等） 无性菌丝特征 （孢子梗的分化特征，孢子着生特征等） 其他特征结构 （有无假根、足细胞、匍匐菌丝、囊轴等 七、问题和思考 1、​ 什么叫载玻片湿室培养？它适用于观察什么样的微生物，有何优点？ 2、​ 湿室培养时为何用20%甘油作保湿剂？ 3、​ 本实验中观察假根的设计原理是什么？此设计还适用于培养那些菌？ 实验九 细菌数量的测定(设计性实验) --------计数市售酸奶或口服液或菌肥制品的单位含菌数 一、实验目的和内容 目的：掌握细菌数量的测定方法。 内容：1．计数板直接镜检计数。 2．载玻片直接镜检计数。 3．平板菌落计数。 二、实验方案自行设计 三、实验材料 市场采集 四、用具 显微镜、血细胞计数板、手动计数器、酒精灯、无菌吸管、滤纸条、载玻片、盖玻片、无菌微量移液管、接种环、擦镜纸、无菌试管、涂布器、无菌培养皿等。 五、实验报告 (一)记录实验结果 (二)比较以上3种不同计数方法所得的结果并进行分析。 附:细菌数量的测定(实验参考) 一、实验目的和内容 目的：掌握细菌数量的测定方法。 内容：1．计数板直接镜检计数。 2．载玻片直接镜检计数。 3．平板菌落计数。 二、实验材料和用具 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)斜面培养物(约培养l0h)、培养5～7d的大肠杆菌(E．coli) 菌液。 牛肉膏蛋白胨培养基、美蓝染色液、结晶紫染色液、香柏油、二甲苯、无菌水。 显微镜、血细胞计数板、手动计数器、酒精灯、无菌吸管、滤纸条、载玻片、盖玻片、无菌微量移液管、接种环、擦镜低、无菌试管、涂布器、无菌培养皿。 三、操作步骤 (一)计数板直接镜检计数 1．血细胞计数板的构造 血细胞计数板由四条平行槽构成3个平台，中间的平台较宽，其中间又被一短槽隔成两半，每边平台面各有一个含9个大格的方格网，中间大格为计数室。计数室的长和宽各为lmm，中间平台下陷0．1mm，故盖上盖玻片后计数室的容积为0．1mm3。血细胞计数板的构造见图16。 常见血细胞计数板的计数室有两种规格。一种是16X 25型，称为麦氏血细胞计数板，共有16个中格，每个中格分为25个小格。另一种是25X16型，称为希里格式血细胞计数板，共有25个中格，每个中格又分成16个小格。但是不管哪种规格的血细胞计板其计数室的小格均由400个小方格组成。应用血细胞计数板在显微镜下直接计算微生物细胞的数量，方法是先测定若干个方格中的微生物细胞，再换算成每mL菌液(或每g样品)中微生物细胞数量。 2．细菌数量的测定 (1)稀释加样；取枯草芽孢杆菌斜面少量菌体至100mL无菌水中，稀释混匀后待用(浓度约为104～105／mL)。先将盖玻片放在计数室上，用吸管吸取以上稀释液滴于盖玻片的边缘，让菌液自行渗入，多余菌液用滤纸吸去，稍待片刻，待细菌细胞全部沉降到计数室底部，将计数板放于载物台的中央，按下列步骤寻找计数室并计数。 (2)找计数室：先在低倍镜下寻找计数板大方格网的位置，转换高倍镜后，调节光亮度至菌体和计数室线条清晰为止，再将计数室一角的小格移至视野中。顺着大方格线移动计数板，使计数室位于视野中间。 (3)计数：计数时，如用16X25型计数板则按对角线方位，取左上、右上、左下、右下4个大格(共4个大格，100个小格)内的细胞逐一进行计数；如使用规格为25X16型的计数板，则除取左上、右上、左下、右下4个大格外，还需加中央的一个大格(共5个大格，80个小格)内的细胞。计数时当遇到大格线上的细菌时，一般只计此大格的上方及右方线上的细胞(或只计下方及左方线上的细胞)，将计得的细胞数填入结果表中，对每个样品重复计数3次，取其平均值，按下列公式计算每mL菌液中所含的细菌细胞数。 16X25和25X16型血细胞计数板的计算公式 (二)载玻片直接镜检计数 1．摇动菌液使其混合均匀，用无菌微量移液管取菌液0．01mL于载玻片上，并用无菌接种环均匀地涂布在1cm2的面积上。风干，固定，结晶紫染色1min，冲洗，干燥备用。 2．用物镜测微尺，测量显微镜油镜观察时的视野直径，并以S=лr2公式，计算出视野面积。 3．将涂片置于载物台，滴香柏油，以油镜观察，不断变化视野，共观察10个视野，计数每一视野中细菌个数。以下列公式计算每毫升菌液中的含菌数量。 (三)平板菌落计数 另取灭菌移液管吸取上述枯草芽孢杆菌稀释液lmL，放人已灭菌的培养皿中，再倒人融化而冷却到5012左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基同时制作3个平板，皿中铺成一薄层，并使乎皿作前后和左右滑动，使样品和培养基混匀，待其凝固后倒置，37C培养24h后计算菌落数，并计算其每mL的含菌量。 四、注意事项 直接镜检计数完毕，用蒸馏水冲洗计数板。绝不能用硬物洗刷。洗后待其自行晾干，或用滤纸沾干。最后用擦镜纸擦干净。若计数是病原微生物，则需先浸泡在5％的石炭酸溶液中进行消毒，然后再进行清洗。 五、演示 1．显微镜下显示计数板计数室。 2．平板菌落计数操作过程。 六、实验报告 (一)记录实验结果 1．​ 计数板直接镜检计数结果： 计算次数 各大格中细胞数 大格中细胞总数 稀释倍数 总菌数/个*mL-1或个*g-1 左上 右上 右下 左下 中间 第一次 第二次 第三次 平均值 2．涂片直接镜检计数结果 视野 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均视野 待测样品/ml*g-1 菌数 3．平板菌落计数结果： 总菌数/个·mL-1或·g-1=每皿平均菌落数X稀释倍数 (二)比较以上3种不同计数方法所得的结果并进行分析。 七、问题和思考 1．根据你的体会，血细胞计数板计算的误差主要来自哪些方面?应如何减少误差? 2．比较各种计数法的优点和缺点。 实验十 微生物的接种方法 一、实验原理 微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。由于实验目的、培养基种类及容器等不同，所用接种方法不同，如斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种等，以获得生长良好的纯种微生物。为此，接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作；同时，因接种方法的不同，常采用不同的接种工具，如接种针、接种环、移液管和玻璃刮铲等。 本次实验做斜面接种技术。 二、实验器材 1、菌种 枯草芽孢杆菌，大肠杆菌； 2、培养基 牛肉膏蛋白胨试管斜面培养基； 3、材料 接种环，酒精灯。 三、操作步骤 斜面接种技术具体操作如下： 1、贴标签 接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口径2-3厘米的位置。 2、点燃酒精灯。 3、接种 用接种环将菌种移接到贴好标签的试管斜面上。无菌操作程序(图Ⅴ-5)简述如下： ⑴手持试管 将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中、使中指位于两试管之间部位。斜面向上，并使它们位于水平位置(图Ⅴ-5 a)。 ⑵旋松棉塞 先用右手将棉塞旋松，以便接种时拔出。 ⑶取接种环 右手拿接种环(如握钢笔一样)、在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌。 ⑷拔棉塞 用右手的无名指、小指和手掌边先后拔出菌种管和待接试管的棉塞，然 后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)，如图Ⅴ-5 b、c所示。 ⑸环冷却 将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。 ⑹取菌种 待环冷却后轻轻沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管，如图Ⅴ-5d所示，注意不要使环的部分碰到管壁，取出后不可使环通过火焰。 ⑺接种 在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，勿划破培养基(图Ⅴ-5e)。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条线作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。 ⑻塞棉塞 取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要用试管迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气，如图Ⅴ-5 f、g所示。 ⑼环灭菌 将接种环烧红灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧，如图Ⅴ-5h所示。 图Ⅴ-5 斜面接种时的无菌操作