HPLC测定丹皮中丹皮酚在大鼠体内血药浓度及药动学研究

HPLC测定丹皮酚在大鼠体内血浆浓度及药动力学研究 HPLC测定丹皮中丹皮酚在大鼠体内血药浓度及药动学研究 陈晓兰1，2，陆洋1，杜守颖1，姚宗玲1，王珊1，李鹏跃 1 （1、北京中医药大学中药学院 北京 100102 2、贵阳中医学院 贵州贵阳 550002） [摘要]　目的 建立测定大鼠血浆中丹皮酚浓度的HPLC法，并用于丹皮酚注射给药后在大鼠体内的药动力学研究。 采用水蒸汽蒸馏法提取丹皮中的丹皮酚，大鼠尾静脉注射4mg/kg丹皮酚，于给药后不同时间采集血样，用乙腈处理血浆样品，震荡离心分离上清液用HPLC测定。选用色谱柱DiamonsilTM钻石C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）柱，流动相为甲醇-水=60 : 40，流速为1.0mL /min，检测波长为274 nm，柱温为常温，进样量为20µL。结果 标准曲线线性范围0.204～20.4 µg·mL - 1，r =0.999 9。丹皮酚平均回收率92.27％，最低检测浓度为10ng，最低定量限LOQ为0.204µg·mL – 1，日内、日间RSD<4.9％。丹皮酚血药浓度数据用药动学软件kinetica处理，丹皮酚在大鼠体内的血药浓度一时间过程符合二房室模型，AUC=111.88±14.44µg·mL – 1 ·min- 1，MRT=23.25±5.86min，Cmax=8.99±0.84µg·mL – 1， Kel = 0. 082±0.015min–1， t1/ 2 Kel= 8.73 ±1.54min。结论 该方法简便、快速、重现性好，适用于丹皮酚大鼠血药浓度测定及药代动力学研究。 [关键词] 丹皮酚；HPLC；血浆；药动学参数 丹皮酚为中药牡丹皮(芍药科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.根皮)的主要活性成分，药理活性广泛，具有抗心律失常、抗高血压、抗血栓、免疫调节及抗肿瘤作用 [1 ]。药理学研究证明丹皮酚能显著降低脑缺血再灌注后期脑组织NOS活性，减少脑组织与血浆NO 和ET生成，以此对脑缺血损伤发挥保护作用[2]。近年来对丹皮酚的体内药动学研究报道已不鲜见[3~5]，但对丹皮酚在大鼠体内血药药动学的研究较少，为了进一步研究丹皮酚在大鼠体内血药药动学的情况，本文建立了HPLC法测定大鼠血浆中丹皮酚浓度的方法，采用乙腈沉淀蛋白法，该方法简便、快速、重现性好；并通过对静脉注射给药后丹皮酚在清醒大鼠体内药动学的研究，旨在探索其在动物体内吸收、分布、代谢和排泄的规律。 1​ 材料 1.1 仪器与试剂 岛津LC-10AD液相色谱仪；岛津SPD-1020A检测器；CX-100 型超声波清洗器（北京医疗设备厂）；赛多利斯BS 110S 型电子分析天平（北京赛多利斯公司）； 丹皮酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号110708-200505）；丹皮酚(由本实验室采用水蒸汽蒸馏法提取所得，纯度>98％)；甲醇（promptar公司，色谱纯）；乙腈（promptar公司，色谱纯）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团）；其它试剂均为分析纯。 1.2 动物 清洁级SD大鼠，雄性，体重250±20 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证号： SCXK（京）- 2006-0009) 。 2​ 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱为DiamonsilTM钻石C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）柱；流动相为甲醇-水=60：40，流速为1.0mL /min；检测波长为274nm；柱温为常温；进样量为20 µL。 2. 2丹皮酚对照品溶液的制备 精密称取丹皮酚对照品5.1 mg于10ml量瓶中，用色谱乙腈制成0.51 mg/ml的丹皮酚储备液，置于4 ℃冰箱中保存。 2.3血浆样品的采集 清洁级SD大鼠5只，雄性，体重250±20 g，禁食不禁水12h后，采用静脉注射( iv)途径给予丹皮酚4mg/kg。在乙醚麻醉下，将毛细管插入眼底静脉分别于给药后0.5、1、3、5、 10、 20、30、45、60、90和120min取血0.4ml于肝素浸润过的试管中，采集完毕后，10000 r/min离心10min，取血浆置- 20℃冰箱保存备用。 2. 4 血浆样品的处理 精密量取血浆样品0.1ml，加入乙腈0.3ml，涡旋混匀1min，10000 r/min离心10min，取上清液约0.1ml置于进样瓶中，HPLC自动进样。 2.5 数据分析 采用标准曲线法计算血药浓度，血药浓度数据用药动学软件kinetica处理，计算注射给药后丹皮酚在大鼠体内的药代动力学参数。 2.6分析方法的确证 2.6. 1 分析方法专属性　在上述色谱条件下，丹皮酚的保留时间约为11.5 min，理论塔板数大于8 000。空白血浆的内源性物质对丹皮酚的测定无干扰，见图1。 A.空白血浆；B.丹皮酚对照品；C.给药后血浆样品；1.丹皮酚 图1 丹皮酚的HPLC 图 2. 6. 2 标准曲线　分别于离心管中加入空白血浆0.1ml，以倍比稀释2.2项下的丹皮酚对照品溶液，配成终浓度为0.204， 0.51，1.02， 2.04， 4.08，10.20，20.40µg·mL - 1的含丹皮酚血浆样品，按2.4项下方法处理进样分析。以丹皮酚峰面积Y对丹皮酚质量浓度X (µg·mL - 1 )进行线性回归，回归方程Y = 25309X + 3085.4，r = 0.9999。丹皮酚在0.204～20.40 mg·L - 1线性关系良好。 2.6. 3 精密度与检测限　分别取空白血浆0.1ml，加入丹皮酚对照品溶液，配制成含丹皮酚0.51， 2.04， 10.20µg·mL - 1的血浆样品( n = 5) ，按2.2.2项下方法操作，于日内和5 d内各测定3批样品，计算日内和日间精密度。低、中、高浓度日内精密度RSD分别为1.83% ，3.22%， 0.14%；日间精密度RSD分别为4.94%，2.29% ，0.64%。 最低检测限，当S/N≥3，经测定最低检测限为0.01µg·mL – 1；最低定量限（LOD）为0.204µg·mL - 1。 2.6. 4 绝对回收率　分别取空白血浆及乙腈0.1 mL, 加入丹皮酚对照品溶液，配制成含丹皮酚0.51， 2.04， 10.20 mg·L - 1的血浆样品及乙腈样品，各5份，按2.2.2 项下方法操作，以血浆中丹皮酚测得量与乙腈中丹皮酚测得量之比计算绝对回收率。低、中、高浓度的绝对回收率分别为( 82.37 ±7.39) %， (93.97 ±1.66) % ，(100.46 ±1.63) %。 2. 6.5 方法回收率　分别量取质量浓度为0.51， 2.04， 10.20 mg·L - 1的丹皮酚血浆样品各5份，按2.2.2项下方法操作。以测得量与加入量之比计算方法回收率，低、中、高浓度的方法回收率分别为( 95.98 ±10.75) % ，(99.36 ±1.86) % ，(103.05 ±1.69) %。 2. 6.6 冻存稳定性实验　分别量取质量浓度为0.51， 2.04， 10.20µg·mL - 1的丹皮酚血浆样品各5份，置- 20 ℃冰箱冷冻保存，1、2、4、6 d后按2.2.2 项下方法操作，记录丹皮酚峰面积，计算丹皮酚的浓度。低、中、高浓度RSD分别为2.84%，1.46%，5.14%。结果表明丹皮酚的含药血浆冷冻保存在- 20 ℃冰箱里6d内是稳定的。 2. 7 丹皮酚注射给药后在大鼠体内的药动学 单剂量( 4mg/ kg) iv丹皮酚后大鼠的平均血药浓度-时间曲线见图2，丹皮酚在大鼠体内的血药浓度一时间过程符合二房室模型，药动学参数AUC=111.88±14.44µg·mL – 1 ·min- 1，MRT=23.25±5.86min，Cmax=8.99±0.84µg·mL - 1,Kel = 0. 082±0.015min- 1， t1/ 2 Kel= 8.73 ±1.54min。 图2　单剂量丹皮酚(4mg/kg)静脉注射后大鼠血药浓度- 时间曲线 3讨论 3.1实验前期对丹皮酚的提取工艺进行了优化，确定了丹皮酚水蒸气蒸馏提取工艺，即加12倍量水蒸馏，收集8倍量馏分（即800ml），4℃冰箱冷藏24h，析晶，抽滤，干燥，称重，即得。通过三批药材提取工艺验证及提取物的含量测定，结晶纯度都达到98%以上。实验中所用的丹皮酚均为本实验室采用上述方法提取所得。 3.2丹皮酚血药浓度测定方法较多，有胶束电动毛细管色谱法[7 ]、GC-MS法[8]、HPLC法[9]等。本研究采用HPLC法，以大鼠为实验动物，对丹皮酚注射给药后体内药动学规律进行了研究。由于血浆样品的成分复杂，以往报道的含量测定方法需要萃取纯化、浓缩等处理[10]。文中采用乙腈沉淀蛋白法，因丹皮酚是挥发性物质，萃取液浓缩时，易导致丹皮酚挥发，故采用萃取液直接进样测定，经检测，该方法处理的样品杂质峰少，可实现丹皮酚与其他干扰物质色谱峰的有效分离。结果表明，该方法简单易行，且方法的线性关系、精密度、回收率均符合要求，适用于丹皮酚血药浓度的测定及药动学研究。 3.3 本实验表明，对正常大鼠一次性以4mg/kg iv 丹皮酚后血清C-t 曲线呈二室模型。药动学参数AUC=111.88±14.44µg·mL – 1 ·min- 1，MRT=23.25±5.86min，Cmax=8.99±0.84µg·mL - 1，Kel = 0. 082±0.015min- 1， t1/ 2 Kel= 8.73 ±1.54min，大约45 min后血药浓度降至Tmax的1 /10以下，120 min时血药浓度已接近最低定量限，说明丹皮酚在血中清除较快，这与文献报道的一致。 参考文献 [1] 孙言才，沈玉先，孙国平． 丹皮酚的主要药理活性研究进展[ J ]． 中药材， 2004， 26 (7)：579． [2]韩永涛，张硕，张岫. 丹皮酚减少大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后一氧化氮和内皮素的生成〔J〕. 中国药学杂志，2007，42 (16) :1218-12201 [3] WU Jing , WANGBen-jie , WEI Chun-min．Determination of paeonol in human plasma by HPLC and its pharmacokinetic studies[ J ]．Chin J Clin Pharmacol Ther 2007 Aug ;12 (8)：935：938 [4] 马丽焱，缪剑华，许旭东等.丹皮酚在清醒大鼠体内的药动学和绝对生物利用度[J ] . 时珍国医国药，2009，20 (2) : 413-414 [5] 智红英，孙丽芳，宋吉伦等. 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A single iv dose of 4 mg /kg paeonol injection was given to5 health rat.Paeonol was separated on a DiamonsilTM-C18 column with methanol-water (60:40V : V) as mobile phase. The plasma concentrationsof paeonol were determined and its pharmacokinetic parameters were calculated and evaluated using kinetica4.0.Results : The linear range of the paeonol was 0.204 – 20.4μg/mL and the determination limit was 0.204μg/mL. The main pharmacokinetic parameters , such as AUC,MRT,Cmax ,kel, t1/2kel , after a single dose of paeonol injection were (111.88 ±14.44) mg·L - 1 ·min- 1 , (23. 25 ±5. 86) min , (8.99 ±0. 84) µg·mL-1 , (0.082 ±0.015) min-1 , (8.73 ±1.54) min, respectively. CONCLUSION: The HPLC method for determining paeonol concentration in plasma is simple, rapid, sensitive and suitable for pharmacokinetic studies. KEY WORDS 　paeonol ; HPLC; drug blood concentration ;phamacokinetics