气虚血瘀证大鼠尿液的核磁共振谱代谢组学

第 52卷 第 15期 2007年 8月 论 文 1758 www.scichina.com 气虚血瘀证大鼠尿液的核磁共振谱代谢组学 李 林① 王建农② 任建勋② 向俊锋① 唐亚林①* 刘建勋② 韩 丁② (① 中国科学院化学研究所分子动态与稳态结构国家重点实验室, 北京 100080; ② 中国中医科学院西苑医院, 北京 100091. * 联系人, E-mail: tangyl@iccas.ac.cn) 摘要 利用基于核磁共振氢谱的组学研究气虚血瘀证大鼠对比于正常大鼠尿液的组成变化, 发现病变大鼠尿液中甲酸(formate)、肌氨酸酐(creatinine)、α-酮戊二酸(2-oxoglutarate/2-OG)、柠檬酸 (citrate)、牛磺酸(taurine)、氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide/TMAO)、琥珀酸(succinate)、马尿酸 (hippurate)等成分的含量发生了变化, 为进一步提示气虚血瘀证的产生机制和病症治疗提供了证据. 关键词 代谢组学 核磁共振 气虚血瘀症 尿液 2007-01-11收稿, 2007-05-08接受 a) 常相光照(LD/6AM~18 PM光照, 18 PM~6 AM黑暗); 反相光照(DL/6AM~18 PM黑暗, 18 PM~6 AM光照); 持续光照(LL/24 h光照); 持 续黑暗(DD/24 h黑暗) 近年来 , 从全局角度分析生物体系在生理、病 理、药理及毒理状态下发生的各种动态变化成为国外 生物医学研究的热点之一, 并形成了以基因组学、蛋 白质组学及代谢组学 [1]为代的现代“组学”分析技 术. 代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰动后 其代谢产物的变化或其随时间的变化来研究生物体 系的代谢途径的一种技术 , 它的出现为生命科学的 发展提供了有力的现代化实验技术手段 . 作为当前 代谢组学研究中的主要技术之一, 与高效液相-质谱 联用技术相比, 核磁共振的缺点是灵敏度较低, 但其 优势也是非常明显的 . 核磁共振能对样品实现非破 坏性、非选择性的分析, 可在接近生理条件下进行实 验, 可设计多种编辑手段, 实验方法灵活多样[2]. 另 外, 核磁共振氢谱对各种含氢化合物均有响应, 能完 成代谢产物中大多数有机化合物的检测 , 满足了代 谢组学中对尽可能多的化合物进行检测的目的[3], 因 此被越来越广泛地用于代谢组学研究. Solanky等人[4] 利用基于核磁共振氢谱的代谢组学方法研究了食用 异黄酮对人体代谢的影响, 王全军等人[5,6]利用大鼠 血浆和尿液的 1H NMR 谱代谢组学研究了 Z24 在大 鼠体内的毒理特性. “气虚”是中医学中的一个基本辨证 . 气虚患者 主要表现为面色苍白而无光泽, 少言懒言, 疲倦乏力, 食欲不振, 不耐劳动, 稍动即头晕、气短、自汗, 平 时易感冒 , 舌质淡或舌边有齿痕 , 苔少 , 脉虚无力 . 临床研究表明, 气虚证与高血压、糖尿病、冠心病、 慢性心衰、中风、急性脑梗塞、乳腺癌等多种疾病的 发生密切相关[7]. 对于气虚证进行代谢组学研究, 将 有利于更好地预防和治疗这些疾病 , 进一步量化气 虚证临床诊断指标. 1 和方法 (ⅰ ) 动物、试剂和仪器 . 健康成年 Sprague Dawley(SD)大鼠, ♂, 体重 200~220 g, SPF级, 由北京 维通利华实验动物中心提供, 室温为 25℃, 动物置于 代谢笼中, 自由摄食饮水. 重水(deuterium oxide/D2O) 为美国 CIL 公司产品; 2,2,3,3-三甲基甲硅烷基丙酸 (3-trimethylsilyl-[2,2,3,3-D4]-propionate/TSP)为美国 Aldrich公司产品. SGD-1型声、光、电刺激仪, 由中 国中医科学院西苑医院研制; AVANCE 600超导傅里 叶变换核磁共振谱仪, 为瑞士布鲁克公司产品. (ⅱ) 造模方法和样品收集. 模型方法主要依据 中医“劳则气耗”的理论, 采用睡眠剥夺的方法. 12只 动物, 随机分为气虚血瘀证候组(模型组, 8只)和空白 组(4 只). 将模型组动物置入 SGD-1 型声、光、电刺 激仪中, 在稳定的人工光照条件下, 按常相光照、反相 光照、持续光照、持续黑暗 a)这 4 个随机安排的过程 进行, 并利用电流刺激的方法对大鼠进行 72 h的睡眠 剥夺, 此为一个阶段, 持续 7 d. 6个阶段后, 完成造模. 用代谢笼收集尿液, 放于接尿管中在−20℃下保存. (ⅲ) 尿液的处理. 尿液样品于 4℃, 7000 r/min 离心 10 min以去除固体杂质. 从每份尿液中取 400 µL 上层清液加入 200 µL 磷酸盐 /D2O 缓冲溶液 (0.2 论 文 第 52卷 第 15期 2007年 8月 www.scichina.com 1759 mol/L, pH 7.4), 并加 TSP 为内标 (MTSP=1× 10−3 mol/L). 样品静置 10 min后再于 4℃, 7000 r/min离心 10 min, 取上层清液 550 µL置于 5 mm核磁管中, 准 备进行 NMR测试. (ⅳ) NMR 数据采集和处理. 在 AVANCE 600 NMR仪上调用 noesypr1d脉冲序列, 采用预饱和方式 抑制水峰, 预饱和时间为 2 s, 谱宽 9615 Hz, 采样点数 64 k, 采样时间 3.41 s, 累加次数 128次, 并控制温度 在 298.2 K. FID 信号经过 32 k 傅里叶变换转为 1H NMR谱图. 选取氢谱质量较高的样品进行 13C和 2D NMR (总 相关谱(TOCSY), 异核单量子相干谱(HSQC), 异核多 键相关谱(HMBC))测试, 用于对代谢物中的各种成分 进行指认. 2D NMR实验参数设置情况见表 1. 表 1 2D NMR实验参数 2D实验 TOCSY HSQC HMBC 脉冲程序 mlevphpr hsqcetgp hmbcgplpndqf 采样点数 2048×256 2048×256 2048×256 累加次数 48 48 48 变换点数 1024×1024 1024×1024 1024×1024 尿液样品 1H NMR 谱以 TSP 为化学位移参考峰 的位置 , 设为 δ 0 . 相位和基线调整后将氢谱的 δ 0.2~9.8 区域进行分段积分, 每段为 0.04. 为了避开 溶剂峰压制对谱图造成的影响 , 水峰附近的区域 (δ 4.2~5.2)被去除. 将积分数据归一化之后, 以文本 文件或 Excel 文件贮存 , 用于随后的主成分分析 (principal components analysis, PCA). (ⅴ) 主成分分析. 将氢谱数据矩阵用 MATLAB 软件进行主成分分析, 求出主成分(principal compo- nents, PC), 利用 PC 对各组大鼠尿液的代谢组进行 分析. 2 结果 2.1 大鼠尿液的氢谱 空白组和模型组大鼠尿液的典型氢谱如图 1所示. 2.2 主成分分析结果 对 12 只大鼠尿液氢谱积分值的 PCA 结果见图 2. 由图 2 可见, 主成分积分值集中分布于椭圆形散 点图(95%置信区间内)的两个区域, 模型组与空白组 之间无交叉和重叠 , 空白组分布在左方而模型组分 布在右方 . 对氢谱变化影响最大的两个主成分的贡 献率分别为 47.2%(PC1)和 13.6%(PC2). 2.3 代谢物成分指认 根据 1H, 13C NMR 谱和其他 2D NMR 实验 (TOCSY, HSQC, HMBC)并参考文献[8~11], 我们可 以对大鼠尿液中的化合物进行指认 . 大鼠尿液的 HSQC谱如图 3所示. 表 2和图 4给出了部分代谢物 的 NMR谱峰归属情况. 图 1 空白组(a)和模型组(b)大鼠尿液的 1H NMR谱 第 52卷 第 15期 2007年 8月 论 文 1760 www.scichina.com 图 2 空白组和模型组尿液样品之散点分布图(t1/t2) ■, 空白组; □, 模型组 图 3 空白组大鼠尿液局部放大的 HSQC谱 3 讨论 大鼠尿液 1H NMR谱 PCA表明模型组与空白组 在积分值散点图中呈聚类型分布, 两组未见重叠. 对 PC1和 PC2进一步分析表明, 与空白组相比, 模型组 大鼠尿液中甲酸(formate, δ 8.47)、肌氨酸酐(creatinine, δ 4.05, 3.04)等的共振峰相对积分面积明显增高, 而 α-酮戊二酸(2-OG, δ 3.02, 2.45)、柠檬酸(citrate, δ 2.69, 2.54)、牛磺酸(taurine, δ 3.44, 3.28)、氧化三甲胺 (TMAO, δ 3.28)、琥珀酸(succinate, δ 2.41)、马尿酸 (hippurate, δ 7.84, 7.64, 7.56, 3.97)等的相对积分面积 则明显下降. 在模型组的 1H NMR谱中发现肌氨酸酐 的含量增加最为明显, 这有可能预示着肾小管损伤[12] 和肾毒性[13]的存在, 模型组大鼠尿液的肌氨酸酐含量 增加, 提示气虚证可能与肾功能异常有着密切关系; TMAO, 柠檬酸, α-酮戊二酸, 琥珀酸的含量变化则可 能预示着肾髓质毒性的存在[14,15]. 同时, 柠檬酸、琥珀 论 文 第 52卷 第 15期 2007年 8月 www.scichina.com 1761 表 2 大鼠尿液中部分代谢物的 NMR谱峰归属 名称 序数 δH δC HMBC(1H→13C) 结构式 1 − 133.4 2, 6 7.838 127.2 2, 6→4, 2, 6→7 3, 5 7.555 128.9 3, 5→1 4 7.644 132.3 4→2, 6 7 − 170.6 8 3.970 44.04 8→9, 8→7 马尿酸 (hippurate) 9 − 177.0 NH O OH O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1, 7 − 181.7 2, 6 3.020 36.04 2、6→1, 3, 4, 5, 7 3, 5 2.452 30.83 3, 5→1, 2, 4, 6, 7 α -酮戊二酸 (2-OG) 4 − 205.7 HO OH O O O 1234567 1, 6 − 179.1 2, 5 2.538, 2.688 45.50 2, 5→3, 5→4 3 − 75.53 4 − 181.9 柠檬酸 (citrate) OH OH OH O OH O O 1 2 3 4 5 6 1 3.436 35.64 1→2 牛磺酸 (taurine) 2 3.281 47.76 2→1 S NH2O O O 1 2 - 2, 3 2.413 34.23 2, 3→1, 4 琥珀酸 (succinate) 1, 4 − 181.7 HO OH O O 1234 图 4 空白组大鼠尿液中部分成分归属图 第 52卷 第 15期 2007年 8月 论 文 1762 www.scichina.com 酸和α-酮戊二酸是三羧酸循环能量代谢及糖酵解途径 的媒介物质, 上述内源性代谢物的损耗通常是由于线 粒体功能紊乱造成的[16]. 中医理论认为“劳则气耗”, 疲劳分为 3 类: 形体 疲劳、脏腑疲劳、神志疲劳. 睡眠剥夺导致的中枢疲 劳属于神志疲劳 . 睡眠剥夺与昼夜颠倒作为一种强 烈的应激源, 对机体可产生生理和心理应激反应, 以 致造成多方面负面影响 , 使机体处于一种兴奋状 态 [17]; 但是随着应激时间的延长, 兴奋状态的持续, 神经内分泌系统以及内环境都将发生变化 , 使机体 的生理和病理发生改变, 造成多系统、多器官的功能 障碍. 这与中医论述“劳(中枢性疲劳)则气耗”所致的 气虚血瘀证所表现出的全身机能减退的症状以及循 环系统的改变有一定的吻合之处 . 以上分析说明尿 液代谢组学分析能够较好地反映气虚证的代谢特征, 为进一步提示气虚血瘀证的产生机制和病症治疗提 供了证据. 参 考 文 献 1 Nicholson J K, Lindon J C, Holmes E. “Metabonomics”: Under- standing the metabolic responses of living systems to pathophysi- ological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica, 1999, 29(11): 1181—1189 2 颜贤忠 , 赵剑宇, 彭双清 , 等 . 代谢组学在后基因时代的作用 . 波谱学杂志, 2004, 21(2): 263—271 3 许国旺, 杨军. 代谢组学及其研究进展. 色谱, 2003, 21(4): 316— 320 4 Solanky K S, Bauley N J, Beckwith-Hall B M, et al. Biofluid 1H NMR-based metabonomic techniques in nutrition research—— metabolic effects of dietary isoflavones in humans. J Nutr Biochem, 2005, 16: 236—244 5 王全军, 颜贤忠, 吴纯启, 等. Z24 经口染毒大鼠血浆的代谢组 学研究. 卫生毒理学杂志, 2004, 18(2): 74—76 6 王全军, 颜贤忠, 吴纯启, 等. Z24 经口染毒大鼠尿液的核磁共振 谱代谢组学研究. 中国药理学与毒理学杂志, 2004, 18(6): 460— 465 7 于赫, 孙力. 气虚证的生物化学与分子生物学研究进展. 中医药 信息, 2005, 22(5): 48—51 8 Lindon J C, Nicholson J K, Holmes E, et al. Metabonomics: Meta- bolic processes studied by NMR spectroscopy of biofluids. Con- cepts Magn Reson, 2000, 12(5): 289—320 9 Bollard M E, Stanley E G, Lindon J C, et al. NMR-based me- tabonomics approaches for evaluating physiological influences on biofluid composition. NMR Biomed, 2005, 18: 143—162 10 Constantinou M A, Papakonstantinou E, Spraul M, et al. 1H NMR-based metabonomics for the diagnosis of inborn errors of metabolism in urine. Analytica Chimica Acta, 2005, 542(2): 169— 177 11 Fan T W M. Metabolite profiling by one- and two-dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog NMR Spectrosc, 1996, 28: 161—219 12 Holmes E, Nicholson J K, Nicholls A W, et al. The identification of novel biomarkers of renal toxicity using automatic data reduction techniques and PCA of proton NMR spectra of urine. Chemometri Intell Lab Sys, 1998, 44: 245—255 13 Gartland K P, Bonner F W, Timbrell J A, et al. Biochemical char- acterizations of para-aminophenol-induced nephrotoxic lesions in the F344 rat. Arch Toxicol, 1989, 63(2): 97—106 14 Holmes E, Caddick S, Lindon J C, et al. 1H and 2H NMR spectro- scopic studies on the metabolism and biochemical effects of 2-bromoethanamine in the rat. Biochem Pharmacol, 1995, 49(10): 1349—1359 15 Ebbels T M D, Holmes E, Lindon J C, et al. Evaluation of meta- bolic variation in normal rat strains from a statistical analysis of 1H NMR spectra of urine. J Pharm Biomed Anal, 2004, 36: 823—833 16 Antti H, Bollard M E, Ebbels T M D, et al. Batch statistical proc- essing of 1H NMR-derived urinary spectral data. J Chemometrics, 2002, 16: 461—468 17 Allan R. Current perspectives on the function of sleep. Perspect Bio Med, 1998, 41: 359—390