基因重组

前言 山西医科大学 教 案 单位 ： 基础医学院 教研室 ： 生物化学 任课教师姓名 ： 常冰梅 课程名称 ： 生物化学 授课时间 ： 2004-2005学年第一学期 授课章节 第十四 章基因工程 授课对象 医学本科 授课时数 3学时 授课时间 第二学年上学期 授课地点 多媒体教室 教学 目的 与要 求 掌握 基因重组和重组DNA技术相关概念，重组DNA技术重要的工具酶， 目的基因的获取；熟悉重组体的筛选，克隆基因的达； 了解 用于基因工程的载体及基因工程与医学的关系。 教学 重点 与难 点 基因工程的概念、基本步骤 教学 方法 讲授法、讨论法 教具 多媒体 授课 提纲 第一节、重组DNA技术相关概念 1、​ DNA克隆、基因工程 2、​ 工具酶 3、​ 载体 4、​ 目的基因 第二节、重组DNA技术基本原理 1、​ 目的基因的获取 2、​ 基因载体的选择与构建 3、​ 目的基因与载体的拼接 4、​ 重组DNA分子导人受体细胞 5、​ 重组体的筛选 6、​ 克隆基因的表达 讲授内容 注解 引入新课5` 第一节、重组DNA技术相关概念 一DNA克隆(DNA cloning) 5` 应用酶学的方法，在体外把目的基因与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。由于早期研究是从较大的染色体分离、扩增特异性基因，因此DNA克隆又称基因克隆(gene cloning )。 二．工具酶20` 在重组DNA技术即基因工程技术中需应用某些基本酶类进行基因操作，称为工具酶。常用的工具酶包括如DNA聚合酶Ⅰ、DNA连接酶、末端转移酶、反转录酶、多聚核苷酸激酶，而限制性核酸内切酶特别重要，应用最广。 限制性内切核酸酶分为三类。重组DNA技术中常用的限制性内切核酸酶为Ⅱ类酶。限制性内切核酸酶的特点： 1.​ 识别DNA的特异序列，往往包含4个到6个核苷酸的回文序列； 2.​ 不同的酶切割DNA频率不同； 3.​ 可产生粘性或钝性未端；带有相同类型的粘性末端或钝性末端的DNA都能再相互连接。 三、目的基因10` 应用重组DNA技术有时是为分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，或是为获得感兴趣基因的表达产物——蛋白质。这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因，又称目的DNA。目的DNA有两种类型：cDNA和基因组DNA。 四、基因载体10` 基因载体也称克隆载体，是指用以携带外源目的基因，实现外源DNA克隆及表达为有意义蛋白质而利用的DNA分子。能使插入的外源DNA序列可被转录并翻译成多肽链而专门设计的基因载体又称表达载体。理想载体有独立复制能力，能够利用宿主转录和翻译，有多种限制性内切酶单一切口及一定筛选标记，如质粒的抗药性基因。常用载体有： 1.​ 质粒 存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。能在宿主细胞独立自主地进行复制，会赋予宿主细胞一些遗传性状。质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，是筛选转化子细菌的根据。 2.​ 噬菌体DNA 常用作基因载体的噬菌体DNA有λ噬菌体、M13噬菌体，经M13噬菌体改造的载体含不同位置的克隆位点，可接受不同限制性内切酶切片段。 另外还有可插入大片段外源基因的柯斯质粒载体、酵母人工染色体载体，用于真核基因表达的腺病毒载体和逆转录病毒载体等。 第二节、重组DNA技术基本原理 1、​ 目的基因的获取20` 可根据不同情况通过化学合成法人工合成，或通过聚合酶链反应（PCR）扩增得到目的基因：也可采用适当方法从基因组DNA文库或cDNA文库种筛选出目的基因。 2、​ 克隆载体的选择和构建10` 根据不同目的和操作基因的性质，选择构建载体。 3、​ 外源基因与载体的连接20` 粘性末端连接包括同一限制酶切割位点连接和不同限制性内切酶位点连接；平端连接；同聚物加尾连接；人工接头连接。 4、​ 重组DNA导入受体菌10` 导入重组DNA分子的方法有转化、转染和感染等。 5、​ 重组体的筛选20` 将众多的转化菌落或转染噬菌斑区分开来，并鉴定哪一菌落或噬菌斑所含重组DNA分子确实带有目的基因，这一过程即为筛选或选择。根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况不同，可采取直接选择法或间接选择法。直接选择法是直接测定基因或基因表型；抗药性标志选择，标志补救，分子杂交法；免疫学方法不是直接鉴定基因，而是利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选，因此属间接选择法。 6、​ 克隆基因的表达15` 表达体系包括原核表达体系和真核表达体系两类。 总结归纳5` 讲授时可先从人类基因组计划及克隆羊多莉开始介绍，学习本章的重要性，从而激发学生的学习兴趣。讲授时以重组DNA技术基本原理为重点，以分、切、接、转、筛、表为主线，使复杂的内容简练化。