表观遗传学课件

nullnull表观遗传学及其几种 常见研究方法病原生物学系 张祖萍2010年12月null纲要表观遗传学概述 表观遗传学主要内容 几种常用表观遗传学研究方法Epigeneticsnull一、表观遗传学概述（一）常见表观遗传学现象同卵双生的双胞胎虽然具有相同的DNA序列，却存在表型和疾病易感性的差异。null一、表观遗传学概述（一）常见表观遗传学现象克隆动物未老先衰多莉：生于1996年7月5日，死于2003年2月14日null一、表观遗传学概述（一）常见表观遗传学现象 组织特异性基因 的表达null一、表观遗传学概述（二）表观遗传学起源null一、表观遗传学概述（三）表观遗传学确切定义表观遗传学：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生的可遗传的改变。null（四）表观遗传学的特点 可遗传的，即这类改变通过有丝分裂或减数分裂，能在细胞或个体世代间遗传； 可逆性的基因表达调节，也有较少的学者描述为基因活性或功能的改变； 没有DNA序列的改变或不能用DNA序列变化来解释。 一、表观遗传学概述null一、表观遗传学概述（五）表观遗传学与经典遗传学表观遗传学是对经典遗传学的补充和完善，丰富了传统的遗传学内容。 null一、表观遗传学概述（五）表观遗传学与经典遗传学基因组含有两类信息 遗传信息：它提供了产生生命所必需的所有蛋白质的全 部核昔酸序列； 表观遗传信息：它提供了何时、何地和如何应用遗传学信 息的指令，以确保基因表达在时间和空间上 的有序性的。 null二、表观遗传学主要内容 DNA甲基化修饰 组蛋白修饰 染色质重塑 非编码RNA的调控null二、表观遗传学主要内容（一）DNA甲基化修饰 DNA甲基化(DNA methylation)是研究得最清楚、也是最重要的表观遗传修饰形式，主要是基因组 DNA上的胞嘧啶在DNA 甲基转移酶（DNMTs）催化下，甲基从S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移至胞嘧啶5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（m5C）。在发生甲基化的胞嘧啶后通常紧跟着一个鸟嘌呤（G）碱基。因此，通常称CpG的甲基化 。null二、表观遗传学主要内容（一）DNA甲基化修饰 在结构基因的5’端调控区域, CpG二连核苷常常以成簇串联形 式排列，这种富含CpG二连核苷的区域称为CpG岛(CpG islands)，其大小为500-1000bp，约56%的编码基因含该结构。 基因调控元件(如启动子)所含CpG岛中的5mC会阻碍转录因子复 合体与DNA的结合。 null二、表观遗传学主要内容（一）DNA甲基化修饰null二、表观遗传学主要内容（一）DNA甲基化修饰DNA全新甲基化DNA主动去甲基化DNA甲基化状态的保持null二、表观遗传学主要内容（一）DNA甲基化修饰肿瘤细胞的甲基化特点 总体甲基化水平低 局部甲基化水平高，即抑癌基因的甲基化水平高null二、表观遗传学主要内容（一）DNA甲基化修饰生物学意义胚胎发育 X染色体失活 寄生DNA序列抑制 基因印记 基因组稳定 null二、表观遗传学主要内容（二）组蛋白修饰 每个核小体由核心组蛋白（H2A,H2B,H3,H4）构成异源八聚体和缠绕在八聚体之外的约200bp的DNA组成。核小体结构示意图null二、表观遗传学主要内容（二）组蛋白修饰 基因正常表达除了需要相应转录因子的诱导和启动子区处于 低甲基化状态外，还需要具备另外一个表观遗传学条件，即 组蛋白修饰处于激活状态。 组蛋白对特定氨基酸的修饰可以间接提供某些蛋白的识别信 息，然后通过蛋白质和染色质的相互作用改变染色质的结 构，从而调控基因的表达。 组蛋白中被修饰氨基酸的种类、位置和修饰类型被称为组蛋 白密码（histone code）。null（二）组蛋白修饰二、表观遗传学主要内容null二、表观遗传学主要内容（二）组蛋白乙酰化修饰（Acetylation) 乙酰化修饰大多发生在H3、H4的 Lys 残基上，在组蛋白乙酰 基转移酶（HAT）的作用下将乙酰基转移到其残基上，消除了 氨基酸上的正电荷，这时DNA分子本身所带的负电荷有利于 DNA构象的展开，核小体的结构变得松弛，使得转录调控的各 种蛋白因子能够与DNA结合，进而发挥转录调控作用。 组蛋白中不同氨基酸残基的乙酰化一般与活化的染色质构型常 染色质(euchromatin)和有表达活性的基因相关联。 组蛋白乙酰化是可逆的过程，可在组蛋白去乙酰化酶（HDAC） 的作用下去乙酰化。null二、表观遗传学主要内容（二）组蛋甲基化修饰（Methylation) 组蛋白甲基化可以与基因抑制有关，也可以与基因的激活相关，这往往取决于被修饰的赖氨酸处于什么位置。 组蛋白H3的5个Lys(K4、K9、K27、K36、K79）和H4的一个Lys（K20）可被甲基化： H3-K9、H3-K27、H4-K20甲基 化可以抑制基因表达； H3-K4、H3-K36、H3-K79甲基化具有激活效应。 null二、表观遗传学主要内容（二）组蛋白磷酸化修饰（Phosphorylation)null二、表观遗传学主要内容（二）组蛋白泛素化修饰（Ubiquitin) 泛素化修饰是一个由多种酶 共同参与调控的级联酶促反应过程，ATP依赖导致26S蛋白酶复合体对修饰蛋白的水解 H2A和H2B是泛素化修饰最集中的地方，参与基因调控的：改变染色质高级结构，暴露DNA，起始转录。E1:泛素活化酶；E2：泛素结合酶；E3：泛素连接酶null二、表观遗传学主要内容（三）染色质重塑（chromatin remodeling ） 染色质重塑是指染色质位置和结构的变化(核小体的置换或重新排列),改变了核小体在基因启动序列区域的排列，增加了基因转录装置和启动序列的可接近性。 null二、表观遗传学主要内容（三）染色质重塑（chromatin remodeling ） 染色质重塑方式主要包括两种： 一种是含有组蛋白化学修饰（乙酰化、甲基化及磷酸化等）； 另一种是依赖ATP 水解释放能量解开组蛋白与DNA 的结合，使转录得以进行 null二、表观遗传学主要内容（三）染色质重塑（chromatin remodeling ）ATP依赖的染色质重构机制null二、表观遗传学主要内容（四）非编码RNA的调控无论是DNA修饰还是组蛋白修饰，都是基因活性调节的中间参与者，而真正诱导基因活性改变者是功能性非编码RNA。 非编码RNA在调节基因表达、基因转录、调整染色质结构、表观遗传记忆、RNA选择性剪接以及蛋白质翻译中都发挥重要作用。 不仅如此，RNA在保护机体免受外来核酸的侵扰中也扮演着重要的角色，被认为是最古老的免疫体系。null二、表观遗传学主要内容（四）非编码RNA的调控非编码RNA可依据大小分为: 长链非编码RNA:在基因簇以至整个染色体水平发 挥顺式调节作用,甚至可以介导单条染色体的失活。 短链非编码RNA（small interfering RNA 和 microRNA):主要是在转录后水平对基因的表达进 行调控。null二、表观遗传学主要内容（四）长链非编码RNA的调控X染色体失活就是长链非编码RNA所介导的一个重要表观遗传学现象，可以说是表观遗传学中由RNA引导的DNA甲基化和组蛋白修饰共同参与的一个复杂的过程。 失活的X染色体是由自身的一个失活中心调控的 nullXic长约1Mb，包括4个已知基因：Xist、Xce、Tsix和DXPas34 Xist：X染色体失活特异性转录因子，是X染色体上启动转录最早的基因。 Xce：在基因组中的组成与X-染色体随机失活中的选择有关，当Xce处于纯合状态时，体细胞中的X-失活是完全随机的，而杂合态时，失活不是完全随机的。 Tsix：位于Xist下游的瞬时调控元件， 与CTCF可能协同起着Xist的外源开关功能。 DXPas34：富含CpG，包括一个15Kb的微卫星重复序列，对X-失活有一定调控作用。 二、表观遗传学主要内容（四）长链非编码RNA的调控null二、表观遗传学主要内容（四）长链非编码RNA的调控X染色体失活过程： Xic失活基因编码出对应的RNA，这些RNA包裹在合成它的X染色体上，当达到某一水平后，在DNA甲基化和组蛋白修饰的参与下共同导致并维持X染色体的失活。null二、表观遗传学主要内容（四）短链非编码RNA的调控 主要是在转录后水平对基因的表达进行调控,又称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS ）。 siRNA介导的RNAi； miRNA对靶gene的调控null二、表观遗传学主要内容（四）短链非编码RNA的调控siRNA介导的RNAi特点： 往往是外源性的，如病毒感染和 人工插入dsRNA之后诱导而产生； siRNA是双链RNA，3,端有2个非配 对碱基； 与靶mRNA一般要求完全互补, siRNA可作用于mRNA的任何部位, 降解目标mRNA。 null二、表观遗传学主要内容（四）短链非编码RNA的调控microRNA途径特点： 内源性基因编码，单链小分子RNA，长约18-25nt，是生物体自身的一套正常的调控机制，控制发育进程、细胞分化、凋亡、分裂以及器官的发育； miRNA主要作用于靶标基因3´-UTR区，当miRNA和靶基因mRNA的3’-UTR几乎完全配对时，导致靶基因mRNA 降解；miRNA与靶基因不完全互补，导致靶基因mRNA 翻译抑制。 null二、表观遗传学主要内容（四）短链非编码RNA的调控第一个miRNA是Lee等在1993年在秀丽新小杆线虫发现的2010.11: 3172 2009: 2545 2008: 1759 2007: 1073 2006: 704 2005: 418 2004: 221 2003: 110 2002: 37 2001: 5Pubmed 收录关于miRNA论文篇数null二、表观遗传学主要内容（四）短链非编码RNA的调控 miRBase数据库显示，目前人类成熟microRNA约904条， 约50%左右的脊椎动物基因表达受miRNA的调控。 一个miRNA分子能调控多个靶基因，而一个靶基因又同时受到多个miRNA分子的协同调控；它们之间组成了错综复杂的调控网络，实现了对人体生命活动以及疾病发生发展和转归过程的精细调控。。null表观遗传学渗入生命科学的各个领域null三、几种常用表观遗传学研究方法 甲基化特异性PCR（Methylation Specific PCR,MSP） 亚硫酸氢钠依赖的基因测序（Bisulfite Genomic DNA Sequencing) 凝胶迁移实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA) 染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP) null三、几种常用表观遗传学研究方法（一）甲基化特异性PCR（MSP) 该方法是由Herman等于1996年提出的一种甲基化的方 法。 将DNA先用重亚硫酸盐处理，使未甲基化的胞嘧啶转变为 尿嘧啶,而甲基化的不变, 随后进行引物特异性的PCR。 null MSP方法的关键点是引物的设计，一般设计二对引物: 甲基化特异引物(M Primer):是根据待测序列的CpG位点甲基化时，经亚硫酸盐修饰后的核苷酸序列设计的，该引物能扩增引物位点发生甲基化的序列； 非甲基化特异引物(U Primer):是根据待测序列的CpG位点无甲基化时，经亚硫酸盐修饰后的核苷酸序列设计的，该引物能扩增引物位点未发生甲基化的序列。 三、几种常用表观遗传学研究方法（一）甲基化特异性PCR（MSP)null三、几种常用表观遗传学研究方法（一）甲基化特异性PCR（MSP)MSP引物设计常用两种软件： Methyl Primer Express Software （ABI 公司） MethPrimer (在线软件）: www.urogene.org/methprimer/indexl.html 引物通常是带有CpG序列越多，特异性就越好。 null该方法只能作定性研究，不能作定量检测。引物的选择和设计、重亚硫酸盐处理是否完全非常关键，否则容易导致假阳性。 三、几种常用表观遗传学研究方法（一）甲基化特异性PCR（MSP)null三、几种常用表观遗传学研究方法（二）亚硫酸氢钠依赖的基因测序 该方法原理是DNA进行硫化处理后，亚硫酸盐能将DNA中 的C转变为U，而已经甲基化的C则不会发生这种变化， 用针对修饰后的序列设计引物进行扩增。 PCR使用的引物（BSP）必须避开CpG二核昔酸序列，这样 才能保证该序列是否甲基化序列都能得到同等程度的扩 增。引物设计软件同MSP。null 对PCR产物进行克隆测序（至少8-10个）分析，能 明确每个甲基化位点情况。 此方法是一种可靠性及精确度均很高的定量检测 方法，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序,操作过程繁琐且费用昂贵。 三、几种常用表观遗传学研究方法（二）亚硫酸氢钠依赖的基因测序null三、几种常用表观遗传学研究方法 （三）凝胶迁移实验（EMSA） 一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的 技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究 DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。 这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯 酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。当核转 录因子与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在 PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从 而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。 null三、几种常用表观遗传学研究方法 （三）凝胶迁移实验（EMSA）凝胶迁移实验基本原理图 标记了的DNA由于与同一种蛋白结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，放射显影中呈滞后的条带。如果加入该蛋白的抗体后，其移动速度更慢，形成更滞后的条带。null三、几种常用表观遗传学研究方法 （三）凝胶迁移实验（EMSA）EMSA 基本五个反应体系null三、几种常用表观遗传学研究方法 （三）凝胶迁移实验（EMSA）成功EMSA试验: 把握整体,注意细节! EMSA试验关键因素： 1.试验设计： 主要是你用药品刺激细胞时,设计的药品浓度和时间梯度的问。 2.核蛋白样品的制备： 注意使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像；掌握好核 蛋白的浓度和纯度, 否则影响结合反应拿不到结果。 3. 探针的制备: 生物素标记3’端和5’端两端都标记,这样才能更好的提高灵敏度。 null4. 制胶： 必须是非变性PAGE凝胶, 一般用6.5%的非变性胶.制胶 很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的 效果。 5.结合反应条件要合适：离子浓度，PH值等 6.预电泳和电泳： 0.25X TBE在冰上120V 预电泳1小时; 务必换掉预电泳 的缓冲液, 用新的0.25X TBE低温下150V，电泳约60分钟。 电转运: 在0.5X TBE中390mA电转移40分钟, 注意转运膜的选择。 三、几种常用表观遗传学研究方法 （三）凝胶迁移实验（EMSA）null8.紫外交联: 正规的应该是交联仪的使用,但是很多单位没有交联仪,那紫外 就用无菌操作台上的紫外灯下10cm处交联10分钟就可以了 9.化学发光反应: 没有太多的细节,只是注意两点,一是期间结合膜的表面一定不能干燥!!!二是Streptavidin-HRP不能加在膜上,而是加在液体中混匀后在将膜放在液体中孵浴. 10.化学发光图像显示: 两种方法:化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像操作基本和Western 试验操作相当, 只是这个膜是一次性的,不能重复使用。 三、几种常用表观遗传学研究方法 （三）凝胶迁移实验（EMSA）null三、几种常用表观遗传学研究方法 （四）染色质免疫沉淀分析（ChIP） 是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析 法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。 通过该方法可获得蛋白质与DNA在体内相互作用的信 息，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋 白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特 定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。CHIP不仅 可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研 究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。 null三、几种常用表观遗传学研究方法 （四）染色质免疫沉淀分析（ChIP）ChIP基本原理图 是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 null三、几种常用表观遗传学研究方法 （四）染色质免疫沉淀分析（ChIP）ChIP基本步骤null三、几种常用表观遗传学研究方法 （四）染色质免疫沉淀分析（ChIP）CHIP与其他方法的结合 CHIP-on-chip：是CHIP与基因芯片相结合建立的方法，将ChIP 富集得 到的DNA-片段与芯片杂交 ，已广泛用于特定反式因子靶 基因的高通量筛选。 CHIP-sequencing：是CHIP与目前高通量测序技术的结合的方法，将 ChIP异性地富集目的DNA片段进行纯化与文库构建； 然后进行高通量测序。将获得的数百万条序列标签精 确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋 白、转录因子等互作的DNA区段信息。 null RNA-CHIP：用于研究RNA在基因表达调控中的作用，具体 方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意 防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆 转录成为cDNA。 三、几种常用表观遗传学研究方法 （四）染色质免疫沉淀分析（ChIP）CHIP与其他方法的结合