16SrRNA在细菌分类鉴定研究中的应用

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 动物医学进展 ,2006 ,27 (11) :15218 Progress in Veterinary Medicine 16 S rRNA 在细菌分类鉴定研究中的应用 3 刘文强1 ,贾玉萍2 ,赵宏坤3 (1.聊城大学农学院 ,山东聊城 252059 ;2. 山东大学生命科学学院 ,山东济南 252100 ; 3. 山东农业大学动物科技学院 ,山东泰安 271018) 中图分类号 :S852. 61 文献标识码 :A 文章编号 :100725038 (2006) 1120015204 摘　要 :细菌的 16 S 核糖体 RNA ( ribosome RNA , rRNA) 以其在进化上的特征性序列 , 现已被广泛用于细菌分类和鉴定的分子指 标。其具体操作是 , 以聚合酶链式反应 ( PCR)分离细菌样本中的 16 S rRNA 的基因 片段 ,通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得 其序列信息 ,再与 16 S rRNA 数据库中的序 列数据进行比较 ,确定其在进化中的位置 ,从 而鉴定样本中可能存在的微生物种类。文章 综述了 16 S rRNA 作为微生物系统分子分类 鉴定的理论基础和方法 ,以及在细菌分类鉴 定中的应用。 关键词 :16 S rRNA ;细菌 ;鉴定 ;分类 传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和 生理生化性状 ,采取的主要方法是对细菌进行纯培 养 ,然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特 性等方面加以鉴定。大量菌种的分类鉴定是一项繁 琐、费时的工作 ,因此迫切需要建立一种简单、方便、 易于操作的分类鉴定方法 ,使人们在一定程度上更 加科学、精确、快速地找到微生物的分类地位 ,为微 生物资源的开发利用奠定基础。20 世纪 60 年代开 始 ,分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细 菌分类学进入了分子生物学时代 ,许多新技术和方 法在细菌分类学中得到广泛应用。Cai H Y 等[ 1 ] 认 为 ,rRNA 基因序列己成为一个分子指标 ,可以广泛 地用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究。 目前 ,大量已知微生物的 DNA 都被测定并输入国 际基因数据库 ,成为对微生物鉴定分类非常有用的 参照系统 ,从而可以通过对未知微生物 DNA 序列 的测定和比较分析 ,达到对其进行快速、有效的鉴定 分类的目的。随着微生物核糖体数据库的日益完 善 ,该技术已应用于海洋、湖泊和土壤、大气微生物 菌群和病原微生物等环境微生物多样性的分析[ 2 ] 。 1 　16 S rRNA 作为细菌分子鉴定的依据 细菌核糖体的 RNA 含有 3 种类型 ,即 23 S rRNA 、16 S rRNA 和 5 S rRNA ,它们含有的核苷酸 分别约为2 900 个 ,1 540 个和 120 个。20 世纪 60 年代末 ,Woese 开始采用寡核苷酸编目法对生物进 行分类 ,他通过比较各类生物细胞的 rRNA 特征序 列 ,认为 16 S rRNA 及其类似的 rRNA 基因序列作 为生物系统发育指标最为合适。其主要依据为 ,它 们为细胞所共有 ,其功能同源且最为古老 ,既含有保 守序列又含可变序列 ,分子大小适合操作 ,它的序列 变化与进化距离相适应。5 S rRNA 虽易分析 ,但由 于核苷酸少 ,没有足够的遗传信息用于分类研究。 而 23 S rRNA 含有的核苷酸数几乎是 16 S rRNA 的 2 倍 ,分析较困难。与此相比 , 16 S rRNA 的相 对分子质量适中 ,作为研究对象较理想。 在相当长的进化过程中 , rRNA 分子的功能几 乎保持恒定 ,而且其分子排列顺序有些部位变化非 常缓慢 ,以致保留了祖先的一些序列。即 rRNA 结 构既具有保守性 ,又具有高变性。保守性能够反映 生物物种的亲缘关系 ,为系统发育重建提供线索 ;高 变性则能揭示出生物物种的特征核酸序列 ,是属种 鉴定的分子基础。而且 rRNA 在细胞中含量大 ,一 个典型的细菌中含有 10 000 个～20 000 个核糖体 , 易于提取 ,可以获得足够的使用量 ,供比较研究之 用。根据核糖体 16 S rRNA 结构变化规律 ,在所测 定的区域中包括了 V1、V2、V3 和 V4 共 4 个高变 区 ,尤其是 V2 这一高变区 ,由于其进化速度相对较 快 ,其中所包含的信息 ,足够用于物种属及属以上分 类单位的比较分析。因此 ,Johes S W 和 Neller H F 等报道测定 16 S rDNA 基因的部分序列即可达到3 收稿日期 :2006208210 基金项目 :聊城大学博士科研启动基金项目 (31805) 作者简介 :刘文强 (1977 - ) ,男 ,山东临清人 ,讲师 ,博士 ,主要从事动物传染病学研究。 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 对分离物进行分子鉴定的目的[325 ] 。 2 　16 S rRNA 序列分析鉴定细菌的基本原 理和方法 通过比较各类生物 16 S rRNA 的基因序列 ,从 序列差异计算它们之间的进化距离 ,可以绘出生物 进化树。因此 ,16 S rRNA 序列分析技术的基本原 理就是从微生物样本中 16 S rRNA 的基因片段 ,通 过克隆、测序或酶切、探针杂交获得 16 S rRNA 序 列信息 ,再与 16 S rRNA 数据库中的序列数据或其 他数据进行比较 ,确定其在进化树中位置 ,从而鉴定 样本中可能存在的微生物种类。 2. 1 　基因组 DNA 的获得 首先从微生物样品中直接提取总 DNA ,对易于 培养的微生物可通过培养富集后再进行提取。另一 种选择是提取微生物细胞中的核糖体 RNA。一个 典型的细菌含有 10 000 个～20 000 个核糖体 ,而基 因组 DNA 中 rrn 操纵子 (即 rDNA 序列) 的拷贝数 相对较少 (原核生物一般为 1 个～10 个左右) ,因 此 ,rRNA 在细胞中的含量很高 ,易于获得较多的模 板 ,但是 RNA 易于降解 , RNA 的提取技术相对于 DNA 的提取较为复杂 ,一般研究多采用提取细胞总 DNA ,但也可根据情况选择提取 rRNA。由于 rRNA 在死亡的细胞中很快降解 ,提取 rRNA 通过 反转录钓取 16 S rDNA 序列的方法能够区分被检 测的细胞是否为活体细胞。 2. 2 　16 S rRNA 基因片段的获得 过去常常将提取的总 DNA 经酶切后克隆到λ 噬菌体中建立 DNA 库 ,进一步通过 16 S rRNA 通 用探针进行杂交 ,筛选含有 16 S rDNA 序列的克隆 (鸟枪法) 。由于 PCR 技术的产生和发展 ,现在一般 采用 16 S rRNA 引物 PCR 扩增总 DNA 中的 rRNA 序列 ,或通过反转录 PCR 获得互补 C rDNA 序列后 再进行分析。采用 PCR 技术的优点在于不仅一次 性从混合 DNA 或 RNA 样品中扩增出 16 S rRNA 序列 ,而且方便了后面的克隆和测序。但也同样会 出现 PCR 所固有的缺点 ,尤其是采用 16 S rRNA 保 守序列的通用引物对多种微生物混合样品进行扩 增 ,可能出现嵌合产物 (Chimeric p roduct) 和扩增偏 嗜性现象 ,影响结果的分析。 2. 3 　通过 16 S rRNA 基因片段分析对微生 物进行分类鉴定 16 S rRNA 基因片段的分析方法主要包括以下 3 种 : ①将 PCR 产物克隆到质粒载体上进行测序 , 与 16 S rRNA 数据库中的序列进行比较 ,确定其在 进化树中的位置 ,从而鉴定样本中可能存在的微生 物种类 ,该方法获得的信息最全面 ,但在样品成分复 杂的情况下需要大量的测序工作。②通过 16 S rRNA 种属特异性的探针与 PCR 产物杂交以获得 微生物组成信息。此外 ,探针也可以直接与样品进 行原位杂交检测 ,通过原位杂交不仅可以测定微生 物的形态特征和丰度 ,而且能够分析它们的空间分 布。该方法简单快速 ,主要应用于快速检测 ,但可能 出现假阳性或假阴性结果。③对 PCR 产物进行限 制性片段长度多态性 ( rest riction f ragment lengt h polymorp hisms ,RFL P)分析 ,通过观察酶切电泳图 谱、数值分析 ,确定微生物基因的核糖体型 ,再同核 糖体库中的数据进行比较 ,分析样品中微生物组成 或不同微生物的种属关系。 3 　以 16 S rRNA 为基础建立的各种方法及 其应用 细菌培养、免疫学方法等虽广泛应用于对病原 菌的检测 ,但都存在一定的不足 ,如所需时间长、敏 感度低等。随着分子生物学及基因诊断技术的进 步 ,在分子水平检测微生物 ,为感染性疾病诊断提供 了新的检测手段。16 S rRNA 为所有细菌共有 ,是 细菌进化过程中最为保守的基因 ,有些基因序列在 长期进化过程中始终保持稳定 ,另外 ,基于其在细菌 染色体上存在多个拷贝 ,现已作为标记基因广泛应 用于细菌分类学和细菌的分子流行病学研究中。以 16 S rRNA 基因为基础 ,建立的 PCR、套式 PCR、多 重半套式 PCR、R T2PCR 以及寡核苷酸探针已应用 于临床细菌的鉴定 ,序列分析 ,细菌的分子分类 ,确 定系统发育等[627 ] 。 Greisen 等了细菌共同引物对 176 种菌株 进行 16 S rRNA 基因高度保守序列 PCR ,均获阳性 结果。以 16 S rRNA 的基因片段作探针 ,检测其在 不同霍乱弧菌菌株中由于染色体 DNA 序列的变异 而致杂交谱带差异的分子流行病学方法也有很多应 用。以 16 S rRNA 的基因片段作探针对霍乱弧菌 部分菌株 (包括 EVC 流行株和 VCO 139) 进行了 16 S rRNA 基因分型[8 ] 。细菌 16 S rRNA 基因兼有保 守性和变异性 ,闫志勇等[9 ] 建立了多重半套式聚合 酶链扩增 ( multiplexsemi nested PCR) 的方法 ,对脑 脊液标本中细菌的感染进行检测。以 16 S rRNA 作为引物 ,利用 PCR 技术来诊断麻风病 ,在 20 世纪 61 动物医学进展 　2006 年 　第 27 卷 　第 11 期 (总第 158 期) © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 90 年代初期开始出现在国外有关杂志中。熊俊浩 等利用麻风分支杆菌的特异性分子片段 16 S rRNA 作引物 ,采用 PCR 技术 ,对 16 S rRNA 分子片段 PCR 诊断麻风病的特异性方面进行研究。吴雪琼 等发现 16 S rRNA 基因 123 275 位核苷酸附近是原 核生物高度变异的区域 ,通过 PCR2SSCP 方法分析 分支杆菌 16 S rRNA 基因片段 ,根据其电泳图谱与 株的相似性进行菌种的初步鉴定。用 16 S rRNA 并结合限制性内切酶消化 ,获得的限制性片 段长度多态性资料已广泛用于亲缘关系分析。从 20 世纪 70 年代开始 , Woese 和他的同事们用 16 S rRNA 寡核苷酸序列分析技术对 400 多株原核生物 和真核生物进行分析。以细菌特异的引物扩增 16 S rRNA ,构建质粒文库 ,用限制性内切酶消化获得 16 S rRNA 基因型 ,用基因型的种类及频率对细菌进 行鉴定[627 ] 。刘文强等[10 ] 对奶牛链球菌、葡萄球菌 和附红细胞体的 16 S rRNA 进行了 PCR 扩增和序 列分析 ,并应用于相应疾病的诊断。 4 　问和展望 环境中的细菌无处不在 ,所以在试验中如何控 制细菌污染是一个关键问题。通过各个环节的严格 无菌操作 ,选择恰当的扩增循环次数 ,DNA 提取、扩 增和产物分析的隔离措施 ,以及使用一次性吸头等 , 可提高诊断的正确性和可靠性。一般 PCR 通常仅 对特定病原体进行检测 ,而在病原体未明时 ,需用多 种不同引物对多种病原微生物分别进行 PCR 扩增 , 往往费时费力 ,而临床上根本不可能用 PCR 逐一探 测每种可能的病原菌来判断感染的病因 ,使得 PCR 技术在临床病原体检测中的应用受到了限制。核糖 体 rRNA 对所有生物的生存都是必不可少的。其中 16 S rRNA 在细菌及其他微生物的进化过程中高度 保守 ,被称为细菌的“分子化石”,同时其保守性又是 相对的 ,在保守区之间存在着 9 个～10 个变异区 (V1～V10) ,不同细菌的科、属、种间都有不同程度 的差异 ,故 16 S rRNA 既可以作为细菌分类的标 志 ,又可作为临床病原菌检测和鉴定的靶分子。以 细菌核糖体 16 S rRNA 基因为靶分子的 PCR ,可早 期判断细菌感染的存在 ,并通过对扩增产物的进一 步分析对病原菌的种属作出鉴定 ,弥补了以上不足 , 是感染性疾病诊断的一个重要突破口 ,并已成为国 内外细菌学家的主要研究方向之一。但是由于 16 S rRNA 基因内所含的多态性位点较少 ,即使与 SSCP 或 RFL P 分析相结合 ,也只能将细菌鉴定至种。一 些可能含有相同或相似序列的菌种或亚种 ,往往需 测序才能鉴定 ,这就限制了其应用于临床快速鉴定 病原菌的广泛性。为解决以上问题 ,国内外利用 16 S rRNA 设计的检测主要是 :将两条引物设计 在保守区成为通用引物 ,而在中间的特异区中选择 序列做探针进行进一步鉴定。由于 16 S rRNA 序 列的保守性和存在的普遍性 ,以及核酸序列本身的 稳定性 ,序列分析的重现性极高 ,基于当今分析技术 的改进 ,应用 16 S rRNA 作为分子指标 ,可以实现 快速、微量、准确简便的对微生物进行分类鉴定。分 子分类正是在从研究的目的过渡到研究的手段。随 着分子分类的理论和方法的日趋成熟 ,其已逐步成 为微生物资源调查和环境生态研究的一种强有力的 工具。16 S rRNA 基因 PCR 扩增与计算机分析相 结合已被证明是鉴定病原菌快速、有效、准确的方 法 ,再加上生物芯片的不断开发 ,相信感染性疾病病 原菌的检测将迈上更高的台阶。 参考文献 : [ 1 ] 　Cai H Y , Archambault M , Gyles C L ,et al . 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All rights reserved. http://www.cnki.net 动物医学进展 ,2006 ,27 (11) :18221 Progress in Veterinary Medicine 猪圆环病毒感染的病理组织学和致病机理研究进展 尹业师 ,黄伟坚 3 ,陈 　琼 ,刘海鹏 ,谢丽华 ,冯建远 (广西大学动物科技学院 ,广西南宁 530005) 中图分类号 :S858. 28 ;S852. 659. 2 文献标识码 :A 文章编号 :100725038 (2006) 1120018204 摘 　要 :近年来 ,尽管国内外学者在猪圆环病 毒的研究方面取得了不小成就 ,但到目前为 止 ,仍还没有找到有效的方法和措施来控制 猪圆环病毒对养猪业的危害。文章对猪圆环 病毒的病理组织学和致病机理进行综述 ,以 便能进一步了解猪圆环病毒感染的正确诊断 技术 ,为有效防控猪圆环病毒感染提供科学 的参考依据。 关键词 :猪圆环病毒 2 型 ;病理组织学 ;致病 机理 　　猪圆环病毒是圆环病毒科圆环病毒属的成员之 一 ,它是一种小而无囊膜 ,呈 20 面体对称 ,共价闭 合 ,环状单股 DNA 病毒 ,病毒粒子直径平均为 17 nm ,是目前兽医学上发现的最小的动物病毒。根据 其致病性的不同 ,分为非致病性圆环病毒 ( PCV21) 和致病性圆环病毒 ( PCV22) 。非致病性圆环病毒 ( PCV21)是德国学者 Tischer 于 1974 年在多株连续 传代的 P K215 细胞中发现并于 1982 年鉴定的一种 新病毒 , 命名为猪圆环病毒。致病性圆环病毒 ( PCV22)是 Harding 1996 年首次从断奶后仔猪多系 统衰竭综合征 ( PMWS) 猪中鉴定出来的病毒 ,但目 前回顾性抗体调查证明[1 ] , PCV22 感染猪的历史至 少已经历了 30 多年。近年来的研究表明 ,采用间接 免疫过氧化物酶测定 ( IPMA) 和单克隆抗体竞争性 EL ISA ,从 1969 年以后存档的血清中检测出 PCV22 抗体。而且 PMWS 也并不是第一次发生 , Tischer 等证实 ,在西班牙、英格兰 1986 年就已有 PMWS , 但由于当时没有引起相关人员的注意 ,直到 1997 年 Clark 才首次报道 PMWS 在加拿大的发生 ,并命名 为断奶仔猪多系统衰竭综合征 ( Po st2weaning multi2 systemic wasting syndrome , PMWS) 。PCV22 除与 PMWS 相关外 ,还与临床上很多疾病有关 ,如繁殖 障碍、呼吸道综合症、增生和坏死性肺炎、仔猪先天 性震颤、猪皮炎肾病综合症、增生性肠炎、渗出性表 皮炎、坏死性淋巴结炎等。由于 PCV22 对外界环境 的抵抗力较强 ,在 p H 3 的酸性环境中可存活很长时 间 ,在高温环境 ( 72 ℃) 也能存活一段时间 ,所以 PCV 22在世界各地的感染率都比较高。在亚洲、欧 　　　收稿日期 :2006207211 　　　基金项目 :广西科学研究与技术开发项目 (桂科攻 053700823 和桂科攻 053702201) 　　　作者简介 :尹业师 (1982 - ) ,男 ,湖南邵阳人 ,硕士研究生 ,主要从事动物传染病与分子病毒学研究。3 通讯作者 Progress on Identif ication and Classif ication of Bacteria by Means Based on 16 S r RNA L IU Wen2qiang1 ,J IA Yu2ping2 , ZHAO Hong2kun3 (1 . College of A gricult ural Science of L iaocheng Universit y , L iaochen , S handong ,252059 , China; 2 . Col lege of L i f e Science of S handong Universi t y , J inan , S handong ,252100 , China; 3 . Col lege of A ni mal Science and V eterinary Medicine , S handong A gricult ural Universit y , Taian , S handong ,271018 , China) Abstract :16 S rRNA gene is wildly used to classiy and identify of bacteria because of it s special sequence in evolution. The detailed operation is that : t he 16 S rRNA gene is isolated by means of polymerase chain re2 action followed by sequence determination or digested by enzyme or hybrid. The sequence is compared wit h t he date base to confirm t he position of evolution. And t hen t he bacterial sample is diagnosed. The paper reviewed t he theory base of molecular identification by 16 S rRNA gene and application of bacterial classifi2 cation. Key words :16 S rRNA ;bacteria ;identification ;classification