指纹图谱技术考察桔梗在天王补心丸中的配伍意义

http://www.cjcmm.com.cn ·156· Vol.34，Issue 2 January，2009 第 34 卷第 2 期 2009 年 1 月 指纹图谱技术考察桔梗在天王补心丸 中的配伍意义 刘 萍 1，邹 鹏 2，李 外 1，孙 艳 1，张 洁 2，余河水 2， 赵 阳 2，马百平 2* （1. 解放军总医院 中药房，北京 100853；2. 军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，北京 100850） [摘要] 目的：建立天王补心丸活性部位的高效液相（HPLC）指纹图谱，从化学成分角度阐述桔梗舟楫作用的物质基础 和科学内涵。：采用 Hanbon Lichrospher C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相甲醇和 0.012 5 mol·L-1乙酸 铵 -醋酸水溶液线性梯度洗脱，流速为 1.0 mL·min-1，检测器为二极管阵列检测器（PDA）与蒸发光散射检测器（ELSD）串联 使用，建立指纹图谱；将全方组与缺桔梗组、桔梗组与单独桔梗组及单独酸枣仁组进行指纹图谱比较；同时比较各组样品提 取的样品量。结果：在提取方法相同且药材量相当的条件下，天王补心丸全方组提取得到的样品量明显高于缺桔梗组；桔梗 +酸枣仁组提取得到的样品量明显高于桔梗组、酸枣仁组单煎得到的样品量之和；得到各组分离度较好的 HPLC-PDA（Max Plot）和 HPLC-ELSD 2 种指纹图谱，且 2 者具有良好的相关性和互补性。结论：桔梗可以增加天王补心丸及主要药味酸枣 仁水煎提取得到的样品量，可以增加其中某些成分的溶出及含量。 [关键词] 天王补心丸；桔梗；舟楫作用；高效液相色谱法；指纹图谱 6中药名方天王补心丸由生地、酸枣仁、桔梗、 当归等药组成，具有滋阴养血、补心安神功能，临 床上用于阴亏血少、虚烦少寐者，具有较好疗效。 传统医学认为天王补心丸中酸枣仁为镇静安神的 主要药味，方中桔梗为舟楫之剂，能载药上行。目 前对桔梗的现代药理研究多集中在抗炎、抑制胃液 分泌及抗溃疡、镇静、镇痛和解热等作用方面[1-2]， 其载药上行功效的物质基础及作用机理方面仅有 一些推论性文章[3-4]，学术界有人[5]推测桔梗能载药 上行是因其主要成分桔梗皂苷具有面活性剂作 用，增加其他药物成分的吸收，但未见实验报道。 作者前期通过提取总皂苷进行了天王补心丸药理 活性追踪，确定了天王补心丸的镇静安神活性部位 [6]。本实验主要是利用高效液相色谱指纹图谱技术， 研究桔梗在天王补心丸中对全方及酸枣仁提取量 及成分组成的影响，从化学成分角度来阐述桔梗舟 [收稿日期] 2008-05-08 [基金项目] 国家自然科学基金项目（30472202） [通信作者] *马百平，研究方向：天然药物化学，Tel：(010)66930265, E-mail：ma_bp@sohu.com [作者简介] 刘萍，研究方向：中药临床药学，Tel：(010)66936427， E-mail：liuping0707@yahoo.com.cn 楫作用的物质基础和科学内涵，阐明桔梗在该方中 与养心安神药物配伍的意义。 1 仪器与药品 2695 HPLC（美国 Waters 公司），996 PDA 二 极管阵列检测器（美国 Water公司），Alltech 2000 蒸 发光散射检测器（美国 Alltech 公司）；Millipore synergy 纯水器；sartorius BP211D 1/10 万天平；真 空冰冻干燥机(ALPHA 1-2 LD)；Anke D-6000B 型 离心机；SP825 大孔吸附树脂（日本三菱公司）。 甲 醇（色谱纯，美国 Fisher），乙醇、乙酸铵、醋酸（北 京化工厂）；水为超纯水。 天王补心丸方中所有饮 片均购自北京同仁堂北城批发部，由解放军总医院 中药房主任药师刘萍鉴定。 2 方法 2.1 色谱条件 Hanbon Lichrospher C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流动相 A-甲醇，B-0.012 5mol·L-1 乙酸 铵醋酸水溶液，梯度洗脱程序： 0~20 min， 20%~30%A；20~40 min，30%40% A；40~60 min， 40%~55% A；60~80 min，55%~60% A；80~85 min， 60%~70% A；85~100 min，70%~80% A；100~105 http://www.cjcmm.com.cn ·157· Vol.34，Issue 2 January，2009 第 34 卷第 2 期 2009 年 1 月 min，80%~95% A；流速 1.0 mL·min-1；柱温 35 ℃； ELSD 温度 110 ℃，气流量 2.4 L·min-1；PDA 色谱 峰光谱采集范围 200～400 nm；进样量 100 μL。 2.2 分组与提取分离 实验共分为 5 组样品，每组按药典天王补心丸 处方中各药味比例称取药品：全方组（Ⅰ）：丹参 2.5 g、当归 5.0 g、石菖蒲 2.5 g、党参 2.5 g、白茯 苓 2.5 g、五味子 5.0 g、麦门冬 5.0 g、天门冬 5.0 g、 生地黄 20.0 g、玄参 2.5 g、远志 2.5 g、酸枣仁 5.0 g、 柏子仁 5.0 g、桔梗 2.5 g、甘草 2.5 g；全方缺桔梗 组（Ⅱ）：丹参 2.5 g、当归 5.0 g、石菖蒲 2.5 g、党 参 2.5 g、白茯苓 2.5 g、五味子 5.0 g、麦门冬 5.0 g、 天门冬 5.0 g、生地黄 20.0 g，玄参 2.5 g、远志 2.5 g、 酸枣仁 5.0 g 柏子仁 5.0 g、甘草 2.5 g；桔梗组（Ⅲ） 桔梗 25 g；酸枣仁组（Ⅳ）：酸枣仁 50 g；桔梗 + 酸 枣仁组（Ⅴ）：酸枣仁 50 g、桔梗 25 g。其中Ⅰ组 和Ⅱ组药材量为药典记载量的 1/10，其余 3 组为药 典记载量。各组分别冷水浸泡 2 h，武火烧开，换 文火煎煮，每次 30 min，共提取 3 次（加水量分别 为药材质量的 8，6，6 倍）。提取液过滤，合并滤 液，浓缩后，进行 SP825 大孔吸附树脂柱色谱，分 别用水、20%乙醇、80%乙醇洗脱，收集各洗脱部 位。其中 80％乙醇洗脱部分浓缩，冰冻干燥，备用。 2.3 供试品的制备 分别精密称取 2.2 项下得到的各组样品的 1/20，定容于 5 mL 量瓶中，50％甲醇溶解，稀释 至刻度，备用。其中 5 组样品折算成药材浓度时， Ⅲ组、Ⅳ组及Ⅴ组样品的药材浓度为Ⅰ组或Ⅱ组 的 10 倍。 2.4 指纹图谱的建立 分别精密吸取各组供试品溶液 100 μL 注入液 相色谱仪，按照 2.1 进行测定，记录色谱图。 3 结果 采用不同来源的药材进行配方组合，进行了 4 次提取量的平行实验，各组提取物冻干后得到样品 量见表 1。 表 1 天王补心丸分组有无桔梗对提取物重量的影响(n=4) 提取物质量/mg(提取率/%） 组别 第 1 次 第 2 次 第 3 次 第 4 次 平均值 Ⅰ 390.6（0.558） 347.8（0.497） 369.2（0.527） 654.1（0.934） 440.4（0.629） Ⅱ 310.0（0.459） 199.0（0.295） 254.5（0.377） 526.5（0.780） 322.5（0.478） Ⅲ 301.0（1.204） 342.3（1.369） 458.5（1.834） 345.7（1.383） 361.8（1.447） Ⅳ 126.4（0.253） 208.9（0.418） 106.2（0.212） 158.1（0.316） 149.9（0.300） Ⅴ 455.1（0.607） 1 000.8（1.334） 628.6（0.838） 627.8（0.837） 678.1（0.904） Ⅰ组与Ⅱ组比较，两组药材加入量相差 2.5 g （Ⅱ组少桔梗 2.5g），但Ⅰ组成分煎出量明显高于 Ⅱ组 36.56%；Ⅲ组、Ⅳ组与Ⅴ组比较，Ⅲ组、Ⅳ组 药材加入量之和等于Ⅴ组药材加入量，但Ⅴ组成分 煎出量明显高出Ⅲ组、Ⅳ组药材单煎得到的样品量 之和的 32.52%，甚至最高时达到两味药材单煎得到 的样品量之和的 2 倍。从加入的药材量与得到的样 品量的关系比较可知，桔梗能够使方中诸药尤其是 方中镇静安神主药酸枣仁的煎出量增加，促进方中 诸药活性成分的溶出。 通过指纹图谱可以看出，与Ⅱ组相比，桔梗能 增加天王补心丸全方组中其他药材成分的色谱峰 吸收值，尤其是 Rt 20 min 处的色谱峰吸收值增加更 明显，但没有明显的新的色谱峰出现，说明桔梗没 有促进其他药材中新成分煎出的作用（图 1，2）。 Ⅰ.天王补心丸全方组；Ⅱ.全方缺桔梗组。 图 1 HPLC-ELSD 指纹图谱比较桔梗对天王补心丸 全方成分溶出的影响 3 结论 本实验对天王补心丸全方、全方缺桔梗、桔梗、 酸枣仁、桔梗加酸枣仁共 5 组药材进行传统水煎煮 提取，进行 SP825 大孔树脂柱色谱，通过不同体积 http://www.cjcmm.com.cn ·158· Vol.34，Issue 2 January，2009 第 34 卷第 2 期 2009 年 1 月 Ⅰ.天王补心丸全方组；Ⅱ.全方缺桔梗组。 图 2 HPLC-PDA（Max Plot）指纹图谱比较桔梗 对天王补心丸全方组成分溶出的影响 分数乙醇洗脱富集有效成分。实验结果证明Ⅰ组提 取量明显高于Ⅱ组，Ⅴ组提取量明显高于Ⅲ组和Ⅳ 组单煎提取量之和。借助 HPLC 指纹图谱的比较， 发现Ⅰ组指纹图谱中显示 Rt 20 min 时峰面积显著 增加，证明桔梗在方中确实有促进其它药味的成分 煎出的作用，特别是对酸枣仁中的一些成分含量增 加明显。 通过酸枣仁、桔梗、酸枣仁加桔梗的指纹图谱 比较可知，酸枣仁与桔梗混煎比桔梗单煎、酸枣仁 单煎的峰值大大增加，说明桔梗能明显增加酸枣仁 有效成分的煎出量，但未见明显增加煎出成分的种 类（见图3，图4）。 Ⅲ.桔梗组；Ⅳ.酸枣仁组；Ⅴ.酸枣仁＋桔梗组。 图3 HPLC-ELSD指纹图谱比较桔梗对酸枣仁成分 溶出的影响 通过对Ⅰ组，Ⅲ组和Ⅳ组的指纹图谱比较，可 以准确归属全方中色谱峰与酸枣仁、桔梗等单味药 材中色谱峰的对应关系。在全方样品的指纹图谱中 可以看出，酸枣仁中的主要成分在全方中所占比例 很小，所以，桔梗也能促进方中其他成分的溶出（见 图5，图6）。 Ⅲ.桔梗组；Ⅳ.酸枣仁组；Ⅴ.酸枣仁＋桔梗组。 图4 HPLC-PDA（Max Plot）指纹图谱比较桔梗 对酸枣仁成分溶出的影响 Ⅰ.天王补心丸全方组；Ⅲ.桔梗组；Ⅳ.酸枣仁组。 图5 HPLC-ELSD指纹图谱比较桔梗与酸枣仁 成分的对应关系 Ⅰ.天王补心丸全方组；Ⅲ.桔梗组；Ⅳ.酸枣仁组。 图6 HPLC-PDA（Max Plot）指纹图谱比较桔梗 与酸枣仁成分的对应关系 4 讨论 天王补心丸由生地、酸枣仁、桔梗等 15 味中 药配伍组成（方中朱砂不溶于水，本研究未计入）。 桔梗在方中承担载药上行的角色，为“舟楫之 剂”[7]。清代柯琴在《名医方论》中有天王补心丸“更 假桔梗为舟楫，远志为向导，和诸药入心而安神明” 的论述。而“舟楫之剂”的作用机理与物质基础， 尚属研究空白。 在天王补心方中生地为君药，功效滋阴补肾、 养血凉血，使水盛以制火，血不燥以润津，这是一 个缓慢的过程，在实验中难以找到对应的观察指 http://www.cjcmm.com.cn ·159· Vol.34，Issue 2 January，2009 第 34 卷第 2 期 2009 年 1 月 标，在动物实验中，也未发现生地有直接安神作用。 酸枣仁在方中虽为臣药，但主要功效为敛心安神， 且在方中的配伍用量仅次于生地，是养心安神的要 药，现代研究[8]酸枣仁有效成分酸枣仁皂苷具有明 显的镇静催眠作用，可以作为天王补心方的主要活 性成分。因此，在本实验中选择酸枣仁皂苷作为检 测指标。作者以往的药理研究中（制备方法为药材 提取液经大孔树脂色谱，分别用水、20％乙醇、50 ％乙醇、80 乙醇和 95％乙醇进行洗脱，进行不同 部位活性筛选，不同乙醇洗脱部位可以减少其活性 部位所含成分，为活性追踪实验的基础）已经发现， 天王补心丸方中有无桔梗对小鼠的抗惊厥效果不 同[9]，在此实验基础上我们曾对天王补心丸全方、 全方缺桔梗、桔梗、酸枣仁、桔梗加酸枣仁等 5 组 药材进行 60%乙醇提取，大孔树脂分步洗脱，对其 不同活性部位建立 HPLC 指纹图谱，但结果没有显 示桔梗对方中成分溶出有增加作用。考虑到传统药 物大多以水煎为主，本实验在同样分组条件下采用 了传统水煎煮提取，然后再上柱洗脱的方法。结果 显示，桔梗可以显著增加全方和酸枣仁单药的水煎 成分提取量，经过验证与比较不同来源的药材水煎 成分提取量，虽然各批次药材的提取量不同，但结 果均为Ⅰ组高于Ⅱ组、Ⅴ组高于两味药材单煎提取 量之和，证明桔梗在方中确实起到助溶作用。由于 桔梗水煎煮后溶出成分含有大量桔梗皂苷，作者认 为桔梗的舟楫作用机理之一是桔梗皂苷在方中发 挥表面活性剂样作用，与方中有效成分结合，达到 临界胶束浓度后形成胶束，增加了活性成分的溶 出，同样就增加了药效。 “舟楫”二字在中医学上有 较深的内涵，舟楫作用既然是“船和桨”的作用，就 应有载体功能、导引趋向作用、助动力作用及助富 集作用，也就是说，能帮助其他药味在所属脏腑更 有效地选择性分布。在前期的药理实验中[10]，发现 桔梗能够促进胆汁分泌，而胆酸盐同样起到表面活 性剂的作用，促进体内药物成分入血，这可能是桔 梗的舟楫作用另一机理。作者还发现在天王补心丸 中桔梗的应用与大鼠纹状体的抑制性神经递质的 增高密切相关，这可能也是“舟楫之剂”作用机理的 一部分。 确定了甲醇-醋酸铵/醋酸作为洗脱系统，同时 发现洗脱液中醋酸铵/醋酸的浓度不同对色谱图的 基线、峰形及分离度有较大的影响，进行浓度摸索 后，发现 0.012 5 mol·L-1醋酸铵/醋酸水溶液较好， 通过尝试多种线性梯度洗脱程序，使指纹图谱中各 色谱峰达到较好的分离。ELSD 与 PDA 作为 HPLC 指纹图谱研究的检测器，各具特色，ELSD 为通用 型检测器，各类物质均可有响应，理论上 ELSD 的 峰的响应值（面积）与各物质的量成正相关，可以 在没有对照品的情况下利用 ELSD 的峰面积进行定 量。PDA 灵敏度高，稳定，重现性好，峰数较多， 可监测更多的成分，提供各峰结构信息，利于色谱 峰的定性。因此本实验选择 ELSD 和 PDA 串联同 时作为 HPLC 指纹图谱的检测器，得到分离度较好 的 HPLC-PDA（Max Plot）和 HPLC-ELSD 2 种指 纹图谱，两者具有良好的相关性和互补性。 从化学成分角度阐述了桔梗在方中舟楫作用 之一种机制，第一次证实天王补心丸中伍用桔梗确 实能增加其他药味活性成分的溶出，舟楫之剂的部 分功能是助溶作用。为进一步开展桔梗引药上行机 理的血清药理学研究，也为下一步液质联用鉴定指 纹图谱中吸收值增高峰的化学成分，进行基础物质 研究提供参考。 [参考文献] [1] 谢 鸣. 中医方剂现代研究[M]. 北京：学苑出版社，1997：853. 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Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China） [Abstract] Objective：To establish the fingerprints of the active fractions from Tian-wang-bu-xin-wan decoction by HPLC， and to explain the role of Radix Platycodi in the decoction prescription. Method：The experimental conditions of the HPLC method were established as follows：Hanbon Lichrospher C18 column (4.6 mm×250 mm，5 μm)，mobile phase were methanol and 0.012 5 mol·L-1 ammonium acetate/acetic acid buffer，eluted with a linear gradient，flow rate was 1.0 mL·min-1，the photodiode array detector (PDA) and evaporative light scattering detector (ELSD) were connected in series. Result：In the same conditions and used same method，the extract amount of whole prescription was higher than that of excepting Radix Platycodi. The method provided two kinds of fingerprints with satisfied separation，which were the HPLC-PDA (Max Plot) fingerprint and the HPLC-ELSD fingerprint. And， they had good correlation and complementaritiy. Conclusion：The Radix Platycodi can enhance the decoction yield of the prescription；and increase the dissolution and the contents of some ingredients in the decoction. [Key words] Tianwang Buxinwan；Radix Platycodi；boat and oar role；high performance liquid chromatography；fingerprints [责任编辑 鲍 雷]