论青霉素类抗生素的发酵生产工艺

论青霉素类抗生素的发酵生产工艺 论青霉素类抗生素的发酵生产工艺 摘要：青霉素作为当下最普遍、效果较好的抗生素类药物，广泛被大家所接受。我们就抗生素的整体概述，青霉素的生产工艺及其发酵过程中可能出现的问的解决方法还有宏观的经济考虑向大家进行介绍。让大家能更多一层地了解青霉素——这个为大家广泛所知而又知之胜少的抗生素。 关键词：抗生素，青霉素，发酵工艺。 一、 抗生素的概述 抗生素是某些细菌、放线菌、真菌等微生物的次级代谢产物，或用化学方法合成的相同化合物或结构类似物，在低浓度下对各种病原性微生物或肿瘤细胞有强力杀灭作用或有其他药理作用的药物。名称演变：抗生素—抗菌素—抗生素。 作用 它的作用大致有五点：抗细菌感染、治疗肿瘤、 抗病原虫、 免疫抑制剂、刺激植物生长。 来源 生物合成（发酵）、化学合成（全合成和半合成）降低毒性、减少耐药性、改善生物利用度、扩大抗菌谱、提高治疗效果。 分类 以其化学结构分类： 1青霉素类2.头孢菌素类3.磷霉素类4.万古霉素类5.利福霉素类6.多粘菌素类7.氨基糖甙类8.四环素类9.大环內酯类10.氯胺苯醇类11.林可霉素类 根据抗生素化学结构及作用机理可分为以下几类：1）β-内酰胺类：青霉素类和头孢菌素类的分子结构中含有β-内酰胺环。近年来又有较大发展，如硫酶素类、单内酰环类，β-内酰酶抑制剂、甲氧青霉素类等。 2.）氨基糖甙类：包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素、阿斯霉素等。 3）四环素类：包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等。 4）氯霉素类：包括氯霉素、甲砜霉素等。 5）大环内脂类：临床常用的有红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素等。 6）作用于G+细菌的其它抗生素：如林可霉素、氯林可霉素、万古霉素、杆菌肽等。 7）作用于G-菌的其它抗生素：如多粘菌素、磷霉素、卷霉素、环丝氨酸、利福平等。 8）抗真菌抗生素：如灰黄霉素。 9）抗肿瘤抗生素：如丝裂霉素、放线菌素D、博莱霉素、阿霉素等。 10）具有免疫抑制作用的抗生素：如环孢霉素。 三.青霉素类 青霉素类是一类重要的β-内酰胺抗生素。它们可由发酵液提取或半合成制造而得。 （1）青霉素（青霉素G）　由发酵液提取。应用其不同的盐，如钠盐、钾盐、普鲁卡因青霉素、苄星青霉素等。 （2）青霉素V　由发酵液提取。 （3）抗葡萄球菌青霉素　曾名耐酶青霉素或新青霉素，由半合成制取。具有耐抗金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶的能力。常用的有苯唑西林、氯唑西林。尚有双氯西林、氟氯西林等，萘夫西林和甲氧西林（meticillin），即新青霉素Ⅰ号，国内已停产不用。 （4）氨苄西林类　由半合成制取。具有抑制某些革兰阴性杆菌的作用，但对假单胞属无效，并可为金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶所分解。常用的有氨苄西林及其酯匹氨西林、阿莫西林等。 （5）抗假单胞菌青霉素　由半合成制取。具有氨苄西林的性质，并有抗假单胞属等细菌的作用，如羧苄西林及其酯羧茚苄西林、哌拉西林、替卡西林、呋苄西林、磺苄西林和较新的苯咪唑青霉素、甲苯咪唑青霉素以及阿帕西林（apalcillin）等。 （6）美西林（氮 脒青霉素）及其酯匹美西林。（7）甲氧西林类　如坦莫西林（羧噻吩甲氧青霉素）。 四.头孢类抗生素的分类 1.笫一代头孢菌素 第一代头孢菌素是60年代初开始上市的。从抗菌性能来说，对第一代头孢菌素敏感的菌主要有β－溶血性链球菌和其他链球菌，包括肺炎链球菌（但肠球菌耐药），葡萄球菌（包括产酶菌株）、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、沙门菌、志贺菌等。不同品种的头孢菌素可以有各自的抗菌特点，如头孢噻吩对革兰阳性菌的抗菌作用较优，而头孢唑林则对某些革兰阴性菌有一定作用。但是，第一代头孢菌素对革兰阴性菌的β-内酰胺酶的抵抗力较弱，因此，革兰阴性菌对本代抗生素较易耐药。第一代头孢菌素对吲哚阳性变形杆菌、枸橼酸杆菌、产气杆菌、假单胞菌、沙雷杆菌、拟杆菌、粪链球菌（头孢硫脒除外）等微生物无效。 本代抗生素中常用品种有头孢唑林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢克罗等。其中除头孢唑林只能供注射外，其他的均可用于口服，也称口服头孢。头孢噻吩、头孢噻啶、头孢来星、头孢乙腈、头孢匹林等均已少用或不用。 2.笫二代头孢菌素 第二代头孢菌素对革兰阳性菌的抗菌效能与第一代相近或较低，而对革兰阴性菌的作用较为优异，现在： （l）抗酶性能强 一些革兰阴性菌（如大肠杆菌、奇异变形杆菌等）易对第一代头孢菌素耐药。第二代头孢菌素对这些耐药菌株常可有效。 （2）抗菌谱广 第二代头孢菌素的抗菌谱较第一代有所扩大，对奈瑟菌、部分吲哚阳性变形杆菌、部分枸橼酸杆菌、部分肠秆菌属均有抗菌作用。 第二代头孢菌素对假单胞属（铜绿假单胞菌）、不动杆菌、沙雷杆菌、粪链球菌等无效。 临床应用的第二代头孢菌素主要品种有头孢孟多、头孢西汀（美福仙），头孢呋新（西力欣），头孢克罗等。 3.笫三代头孢菌素 第三代头孢菌素对革兰阳性菌的抗菌效能普遍低于第一代（个别品种相近），对革兰阴性菌的作用较第二代头孢菌素更为优越。 （1）抗菌谱扩大 第三代头孢菌素的抗菌谱比第二代又有所扩大，对铜绿假单胞菌、沙雷杆菌、不动杆菌、消化球菌、以及部分脆弱拟杆菌有效（不同品种药物的抗菌效能不尽相同）。对于粪链球菌、难辨梭状芽胞杆菌等无效。 （2）耐酶性能强 对第一代或第二代头孢菌素耐药的一些革兰阴性菌株，第三代头孢菌素常可有效。 常用有：头孢哌酮（先锋必素）、头孢三嗪（罗塞秦、菌必治）、头孢噻肟钠、头孢他啶、头孢唑肟等。 4.笫四代头孢菌素 第三代头孢菌素对革兰阳性菌的作用弱，不能用于控制金黄色葡萄球菌感染。近年来发现一些新品种如头孢匹罗（Cefpirome）等，不仅具有第三代头孢菌素的抗菌性能，还对葡萄球菌有抗菌作用，称为第四代头孢菌素。 关于第一至第四代的划分不仅适用于头孢菌素，其他的一些β-内酰胺抗生素也可按此分代。常用有拉他头孢、头孢匹罗、氨曲南等。 作用机制 抑制细菌细胞壁的合成（β-内酰胺类、磷霉素、万古霉素。）； 抑制细菌蛋白质合成（四环素、大环内酯类、氨基糖苷类、氯霉素类。）； 抑制细菌DNA合成（利福平。）； 抑制细菌RNA合成（放线菌素。）； 损伤细菌细胞膜（两性霉素B、粘菌素、氨基糖苷类。）。 二、青霉素抗生素产生的背景 青霉素又被称为盘尼西林，它是人类发明的第一种抗生素，也是全球销量最大的抗生素。青霉素是一种高效、低毒、临床应用广泛的重要抗生素。它的研制成功大大增强了人类抵抗细菌性感染的能力，带动了抗生素家族的诞生。 1953年，我国第一批青霉素的诞生揭开了我国生产抗生素的历史;到2001年，我国青霉素的产量已经占据了全球的60%的市场份额，目前我国是全球最大的青霉素生产国家。 青霉素的发现 1928年，英国细菌学家Fleming发现污染在培养葡萄球菌的双蝶上的一株霉菌能杀死周围的葡萄球菌。他将此霉菌分离纯化后得到的菌株鉴定为青霉，并将这菌产生的抗生物质命名为青霉素。 1940年，英国Florey和Chain进一步研究此菌，并从培养液中制出了干燥的青霉素制品。经实验和临床试验证明，它毒性很小，并对一些革兰氏阳性菌所引起的许多疾病有卓越疗效。 来源 霉菌属的青霉菌发酵液中提取，天然青霉素有5种G、V、N、K、X、其中PG的活性最高、产量最高 。 三、青霉素的理化性质及应用 酸性 一般的羧酸 Pka 4-6 PG Pka 2.7 临床用其钠盐、钾盐或普鲁卡因盐，增强水溶性。 粉针剂，有效期2年 临床用粉针剂，现用现配。 不稳定性 β –内酰胺环是青霉素中最不稳定的部分，原因是 1、四元环和五元环稠合，环的张力大 2、两个环不在同一平面，青霉素结构中β-内酰胺环中羰基和氮原子的孤对电子不能共轭， 易受到亲核性或亲电性试剂的进攻，使β-内酰胺环破裂。 β-内酰胺环对水、光、热、酸、碱、酶、醇、胺不稳定，β-环开裂、活性降低或消失。 对碱或酶(β-内酰胺酶)不稳定，水解； 对稀酸不稳定，发生重排； 对强酸不稳定，发生重排； 应用 溶血性链球菌感染。 肺炎链球菌感染。 不产青霉素酶葡萄球菌感染。 炭疽。 破伤风、气性球疽等梭状芽孢杆菌感 钩端螺旋体病。 青霉素与氨基糖苷灯药物联合用于治疗草绿色链球菌心内膜炎。 流行性脑脊髓膜炎。 放线菌病。 淋病。 除脆弱拟杆菌以外的许多厌氧菌感染。 四、生产工艺过程 菌种 →种子制备 → 发酵 → 发酵液预处理 → 提取及精制 → 成品包装 菌种介绍：青霉是产生青霉素的重要菌种。广泛分布于空气、土壤和各种物上，常生长在腐烂的柑桔皮上呈青绿色。目前已发现几百种，其中产黄青霉(Penicillum chrysogenum)、点青霉(Penicillum nototum)等都能大量产生青霉素 种子制备：种子制备是指孢子接入种子罐后，在罐中繁殖成大量菌丝的过程，其目的是使孢子发芽、繁殖和获得足够数量的菌丝，以便接种到发酵罐当中去。种子制备所使用的培养基及其它工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌丝繁殖。 1．发酵准备--菌种选育 人工诱变法：.紫外线、X-线、r-线照射亚硝基胍、亚硝酸、秋水仙素、氮芥等诱变剂处理。基因工程法。 发酵条件下的生长过程 第1期：分生孢子萌发，形成芽管，原生质未分化，具有小泡。 第2期：菌丝繁殖，原生质体具有嗜碱性，类脂肪小颗粒。 第3期：形成脂肪包涵体，机理贮藏物，没有空泡，嗜碱性很强。 第4期：脂肪包涵体形成小滴并减少，中小空泡，原生质体嗜碱性减弱，开始产生抗生素。 第5期：形成大空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶状，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。 第6期：出现个别自溶细胞，细胞内无颗粒，仍然桶状。释放游离氨，pH上升。 第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。 1－4期为菌丝生长期，3期的菌体适宜为种子。 4－5期为生产期，生产能力最强，通过工程，延长此期，获得高产。 在第六期到来之前结束发酵。 2．发酵中灭菌 青霉素属于β-内酰胺类抗生素，其β-内酰胺环极易破坏而失效，所以不可以高压灭菌了，否则将导致完全失效。 一般制备青霉素是采用无菌操作法、冷冻干燥技术（真空条件下使冰直接升华，得以除去水分）制备的。 3．发酵工艺控制 1）.基质浓度 在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱的阻遏或抑制 , 苯乙酸的生长抑制）, 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成 。所以， 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法 ，以维持一定的最适浓度 。 2）.温度 青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别 , 但一般认为应在25 °C 左右。温度过高将明显降低发酵产率 , 同时增加葡萄糖的维持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说 , 最适温度不是一样的, 一般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度 , 以利于青霉素的合成。 3）.培养基成分的控制 A.碳源--发酵中常用乳酸或葡萄糖，也可采用葡萄糖母液、糖蜜等。其中乳糖最为便宜，但因货源较少，很多国家采用葡萄糖代替。但当葡萄糖浓度超过一定限度时，会过分加速菌体的呼吸，以至培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，导致pH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长河产物的合成。 B.氮源 -主要有机氮源为玉米浆、棉籽饼粉、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨等。玉米浆为较理想的氮源，含固体量少，有利于通气及氧的传递，因而利用率较高。固体有机氮源原料一般需粉碎至200目以下的细度。有机氮源还可以提供一部分有机磷，供菌体生长。无机氮如硝酸盐、尿素、硫酸铵等可适量使用。 C.无机盐-碳酸钙用来中和发酵过程中产生的杂酸，并控制发酵液的pH值，为菌体提供营养的无机磷源一般采用磷酸二氢钾。另外加入硫代硫酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所需的硫。由于现在还有一些工厂采用铁罐发酵，在发酵过程中铁离子便逐渐进入发酵液。发酵时间愈长，则铁离子愈多。铁离子在50µg/ml以上便会影响青霉素的合成。采用铁络合剂以抑制铁离子的影响，但实际对青霉素产量并无改进。所以青霉素的发酵罐采用不锈钢制造为宜，其他重金属离子如铜、汞、锌等能催化青霉素的分解反应。 D.前体-添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借酰基转移的作用，将苯乙酸转入青霉素分子，提高青霉素G的生产强度，。因此前体的加入成为青霉素发酵的关键问题之一。但苯乙酸对发酵有影响，一般以苯乙酰胺较好。也有人采用苯乙酸月桂醇酯，其优点是在发酵中月桂醇酯水解，苯乙酸结合进青霉素成品。而月桂酸作为细菌营养剂及发酵液消沫剂，且其毒性比苯乙酸小，但价格较贵。前体要在发酵开始20h后加入，并在整个发酵过程中控制在50µg/ml左右。前体用量大于0.1%时，青霉素的生物合成均下降。所以一般发酵液中前体浓度以始终维持在0.1%为宜。 4）. pH 值、溶氧 青霉素在合理的pH和溶氧下，生产和发酵才会达到最高效率！在罐的夹层或蛇管中需通冷却水以维持一定罐温。在整个发酵过程中，需不断通无菌空气和搅拌，以维持一定罐压或溶氧。 5）.菌丝浓度等 在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。而其它的如 ：菌丝形态等亦会有所影响…… 6）.泡沫的控制 在发酵过程中产生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂 “ 泡敌 ” 来消泡, 应当控制其用量并要少量多次加入, 尤其在发酵前期不宜多用, 否则会影响菌体的呼吸代谢 。加消沫剂以控制泡沫，必要时还加入酸、碱以调节发酵液的pH。 7）.发酵时间 必须控制合理，才能有最大利益！ 4染菌处理 染菌是发酵工业长期以来不能彻底解决的问题，因此如何解决染菌问题就成了发酵工业的工作重点之一。要解决染菌问题首要问题就是要能检测出是否染菌。染菌后一般是丝状菌丝对过滤有影响，以及发酵杂菌产物对提取有影响。因此应对污染过的发酵液作加热预处理，加助滤剂等有利于过滤，对发酵产物中的杂质如蛋白质等，可加入絮凝剂等，使蛋白质凝聚. 染菌通常通过三个途径发现：无菌试验，发酵液直接镜检，发酵液的生化分析。其中无菌试验是判断染菌的主要依据。 无菌试验的方法有：双碟培养、斜面培养、肉汤培养、镜检。 1)双碟培养的操作要点是：种子罐在培养过程中每8 小时取样一次，取样时在装有 9 毫升肉汤的试管内加入 2 ～ 5 毫升试样，然后在无菌室内通过无菌操作在事先铺好琼脂培养基的双碟内画线。剩下的肉汤培养物，在 37℃培养 6 小时后复画一次，及另画一双碟作比较，发酵罐在发酵过程中每隔 8 小时取样一次，用空白试管取样5～15 毫升左右，于 37℃培养 6 小时后画碟时，双碟放置 37 ℃ 培养．24 小时内的双碟，每隔2～3 小时在灯光下检查一次，观察有无杂菌生长。 24 ～48 小时的双碟每天检查一次，以防生长缓慢的杂菌漏检。一般杂菌在 37℃， 24 小时以内能长出来．此法的优点是比较准确，但反应较慢（因杂菌在双碟上繁殖成菌落要有一定的时间），并且操作也较麻烦。 2)斜面或肉汤培养法，就是直接用酚红肉汤取样培养，或直接用斜面取样培养，但也有先用空白无菌试管取样，再接种于肉汤或斜面培养基的。也有在中小罐接种前，无菌试验样品先进行镜检。直接取样进行无菌试验的方法比较方便。无菌试验的结果，一般要 8～16 小时才能做出判断。为了加速杂菌的生长，特别是对中小罐无菌情况的及时判断，可以加入对氨基苯甲酸等生长促进剂，以促进杂菌的生长。 染菌在发酵过程的每个阶段都可能发生，下面就各个不同的阶段的染菌情况和处理办法一一说明。 1)种子培养期染菌 种子培养主要是生长繁殖菌体。此时菌体浓度低，培养基营养丰富，因此容易染菌。种子培养期染菌，带进发酵罐中的危害极大，应严格控制种子污染。当发现种子受污染后均应灭菌后弃去，并对种子罐、管道进行检查和彻底灭菌。 2)发酵前期染菌 发酵前朗主要是菌体生长繁殖，代谢产物生成很少，染菌后杂菌容易繁殖，与生产菌争夺营养成分和氧分，严重干扰生产菌的生长繁殖和产物的生成，因此要特别注意发酵前期的染菌。当发酵前期染菌时，由于营养成分消耗不多，能耗也不大，从经济性的角度考虑应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种进行发酵。 3）发酵中期染菌 发酵中期染菌将严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。如产酸，产泡沫，使菌体自溶，使发酵液变臭等。发酵中期染菌，由于营养成分大量消耗，一般挽救处理困难，危害性大，发酵中期染菌应做到早发现，早处理，通常做法是“倒罐”，即用一罐没有染菌的发酵液与染菌的发酵液混合，使有害菌浓度下降，生产菌浓度提高进而重新成为优势生长菌群。显然，倒罐必然造成物料消耗和操作费用的增加。 4）发酵后期染菌 发酵后期产物积累较多，效价已经很高，营养物质接近耗尽，此时如染菌量不多，可继续进行发酵，如严重污染也可提前放罐，停止发酵，这在经济上往往是合算的。 五、青霉素提取及精制 化学提取和精制的目的:从发酵液中制取高纯度的、合乎药典的抗生素成品。 由于发酵液山洪青霉素浓度很低，仅0.1%~4.5%左右，而杂质浓度比青霉素的高几十倍甚至几千倍，并且某些杂质的性质与抗生素的非常相近，因此提取精制是一件十分重要的工作。 发酵液中常见的杂质有：菌丝、未用完的培养基、易污染杂菌、产生菌的代谢产物、 预处理需要加入的杂质灯。 提取 青霉素的提取遵循下面四个原则：⒈时间短，⒉温度低，⒊pH适中，⒋勤清洗消毒。 常用的提取方法有：溶媒萃取法、离子交换法、沉淀法。 溶媒萃取法 这是利用抗生素在不同的pH条件下一不同的化学状态（游离态、碱或盐）存在时，在水及水互不相溶的溶媒中溶解度不同的特性，是抗生素从一种液相（如发酵滤液）转移到另一种液相（如有机溶媒）中去，以达到浓缩和提纯的目的。利用此原理就可借助于调节pH的方法使抗生素从一个液相中被提取到另一液相中去。所选用的溶媒与水应是互不相溶或仅很小部分互溶，同时所选溶媒在一定的pH下对于抗生素应有较大的溶解度和选择性，方能用较少量的溶媒使提取完全，并在一定程度上分离掉杂质。 离子交换法 利用离子交换树脂和抗生素之间的化学亲和力，有选择性的将抗生素媳妇上去，然后以较少量的洗脱剂将它洗下来。 沉淀法 是一种分离抗生素简单而经济的方法，浓缩倍数高，因而也是很有效的方法。 精制 抗生素精制常有结晶法来制得高纯度成品。常有的几种结晶方法有： 改变温度结晶 利用抗生素在溶剂中的溶解度随温度变化而显著变化的这一特性来进行结晶。 利用等电点结晶 当将某一抗生素溶液的pH调到等电点时，它在水溶液中溶解度最小，则沉淀析出。 加成盐剂结晶 在抗生素溶液中加成盐剂使抗生素一盐的形式从溶液中能够沉淀结晶。 六、经济性思考 青霉素工业盐国内平均销价在105 元/十亿左右，青霉素钠盐国内平均销价在190～230 元十亿之间，应该说青霉素生产的利润率并不高。在出口方面，我国青霉素的出口，多以工业盐钠盐等初级产品为主，深加工产品基ᴀ不出口。1989 年我国青霉素工业盐出口量仅为15 吨，占总产量的1%，进入 90 年代我国青霉素工业盐出口量迅速扩大，青霉素工业盐多出口印度、日ᴀ台湾等地区和国家。近年来，由于印度扩大了ᴀ国青霉素生产量，青霉素由进口变为出口，影响了我国青霉素向印度等国家的出口，出口量有所下降。 1997 年上半年，青霉素工业盐出口价格在11～12 美元/十亿之间，价位偏低。青霉素工业盐，华药出口100 吨，哈药出口210 吨，鲁抗没有出口，基ᴀ自我消化，华星制药厂出口了 20多吨；张家口制药总厂出口400 吨。青霉素工业盐出口量比上年同期下降41.7%。 参考文献： 1）​ 老师的课件 2）​ Internet上的资料