dna

大肠杆菌目的基因的获得，表达克隆及鉴定 重组DNA，即按人们的需要，将一种生物的或化学合成的基因（即一段DNA分子序列）掺入载体（如细菌质粒）运送到另一种宿主（如大肠杆菌）细胞中，通通过载体的复制，可以得到外源DNA或基因的无性繁殖（克隆）和大量相应的基因产物。目前，重组DNA系统经过30余年的探索与实践，已在机理和操作方面日臻完善。重组DNA的主要步骤有：分离目的基因；选择或构建载体；连接目的基因与载体；重组DNA导入宿主细胞和外源基因的表达。 1.分离目的基因 质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定遗传单位。它具有一定的生物功能，往往带有一些抗性基因，这有助于载体重组后的筛选。 1.1细菌的生长和质粒的扩增 挑取单菌落，接种在20ml含一定量Amp的LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床过夜培养。 1.2菌体的收集，裂解和质粒DNA的分离 分装菌液于1.5ml离心管中，冰浴2min。4℃、12000rpm离心5min，收集菌体，弃上清液。采用碱裂解法获得质粒DNA 1.3质粒DNA的提纯 1.3.1用碱裂解法裂解细胞后加等体积的酚：氯仿（1:1）抽提。振荡混合有机相和水相，冰浴3min。4℃、12000rpm离心10min，吸上层水相于另一离心管中，加等体积氯仿：异戊醇（24:1）同上振荡离心后于另一离心管中，再加二倍体积无水乙醇，-20℃沉淀DNA30min，同上离心，取沉淀。 1.3.2用预冷70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，去上清，室温干燥。加25—5ulTE溶解DNA，37℃放置30min，消化RNA，保存于-20℃。 1.4质粒DNA检测 因三种DNA（超螺旋环状、切口环状和线状）在琼脂糖凝胶中的迁移率不同，所以可用其检测所得质粒DNA的类型。 1.4.1琼脂糖凝胶的制备 精确称取0.2g琼脂糖于盛有20ml1×TAE缓冲液的三角瓶中，在微波炉中加热至完全熔化。冷却至60℃，加入Goldview溶液，摇匀，倒胶。 1.4.2电泳 取10ul质粒DNA及2ul加样缓冲液混匀上样，100v电泳0.5h，紫外观察。 1.5质粒DNA的酶切 在试验中，一般优先考虑能够产生粘性末端的限制性内切酶，因为其连接效率远高于平末端连接。本实验采用双酶切。 1.5.1按如下双酶切体系混合（30ul） 反应物 菌种1 菌种二 质粒 5 5 BamH I 1 1 Sall 1 1 10×buffer T 3 3 用水补足30ul，离心10s，37℃水浴酶切5-6h。 1.5.2 按1.4电泳方法观察酶切结果 1.6目的基因的扩增（P℃R） P℃R是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法，该技术是在DNA、引物和四种脱氧核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。其由变性、退火和延伸三步组成。 1.6.1P℃R反应体系 10×P℃R Buffer(含 Mg2+) 2.5ul dNTP(2.5mM) 1 ul 上游引物(10uM) 1 ul 下游引物(10uM) 1 ul 质粒DNA 1 ul DNA聚合酶 0.3 ul DdH2O 18.2 ul 总体积 25ul 混匀瞬时离心 94℃预变性 4min 94℃变性 30s 55℃退火30s 30个循环 72℃延伸 4s 72℃延伸8min 1.6.21%琼脂糖凝胶电泳及回收 按以上方法电泳后，在紫外灯下切下所需DNA亮带，用试剂盒进行回收。回收后电泳检测回收产物，余下-20℃保存。 2.选择或构建载体 载体是携带外源目的基因片段进入宿主细胞进行扩增表达的工具，其本质仍是DNA。多选用质粒。本实验采用pGM—T载体。 3.连接目的基因与载体（重组DNA） 反应体系如下： 体系成分 体积：ul 10×T4 DNA ligation Buffer 1 T4 DNA ligase 1 pGM—T载体 1 目的基因产物 5 Dd水 2 总体积 10 将反应液混匀，4℃过夜 4.重组DNA导入宿主细胞 大肠杆菌是原核生物中应用最广泛的一种宿主细胞，重组DNA分子导入大肠杆菌细胞，可通过转化、转导和三亲本杂交等途径实现。本实验采用转化的方法来实现。转化过程包括：制备感受态细胞和外源DNA转化感受态细胞。 4.1感受态细胞的制备 大肠杆菌的感受态可用℃a℃l2处理而诱导产生：将正在生长的大肠杆菌细胞在0℃下加入到℃a℃l2溶液中，便会使细胞膜透性发生改变，此时的细胞即呈现感受态。这一方法可用于批量生产感受态细胞，其转化效率可达5×106--2×107个转化克隆子/ug超螺旋质粒DNA。 4.2外源DNA转化感受态细胞 转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传基因工程等研究领域的基本实验技术呢。 4.2.1转化用固体LB培养基平板的制备 向含有60ug/mlAmp的固体LB培养基平板上加24mg/ml的IPTG4ul和30mg/ml的X-gal 16ul，涂布均匀，37℃避光晾干。 4.2.2转化感受态细胞 取5ul连接产物加到100ul所制备的感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴 20min。取出离心管，42℃水浴热击90s，立刻冰浴冷却3min。向离心管中间入900ul无抗生素的LB液体培养基，混匀后室温200rpm振荡培养1h，复苏菌体。 4.2.3转化涂布 取出离心管，6000rpm离心2min，弃上清800ul，剩余混匀后涂布于上步所制平板中。倒置平板，37℃恒温培养14h到16h，直到长出单菌落。 5.外源基因的表达 5.1重组质粒的鉴定 在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化即使获得转化细胞，也并非都含有目的基因，所以需采用有效方法进行筛选。筛选的方法包括 根据遗传表型筛选、限制性内切酶筛选、核酸探针筛选、P℃R 筛选等。 本实验采用遗传表型筛选中的抗生素平板筛选及α 互补筛选的方法。α 互补适用于含有半乳糖苷酶基因（La℃Z）的载体，其原理是：载体含有 La℃Z 的调控序列和 N 端 146 个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点。当这种载体进入可编码 β-半乳糖苷酶 ℃ 端部分序列的宿主细胞后（质粒和宿主细胞编码的片段各自都没有酶活性），它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫 α 互补。 由α互补而产生的 La℃+ 细菌在呈色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-gal）和诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）存在下形成蓝色菌落。当外源 DNA 插入到质粒的 多克隆位点后，导致产生无 α 互补能力的氨基端片段。因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。通过呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。 5.1.1抗生素平板筛选及α 互补筛选 此过程在4.2.1中已完成，根据ɑ互补现象，用接种环选取白色菌落于含有amp的LB液体培养基的1.5ml离心管中，振荡培养4h，吸1ul菌液作P℃R反应模板。 5.1.2白色菌落P℃R鉴定 5.1.2.1反应体系 10×P℃R Buffer(含 Mg2+) 2ul dNTP(2.5mM) 1 ul 上游引物(10uM) 1 ul 下游引物(10uM) 1 ul 菌落DNA 1 ul DNA聚合酶 0.3 ul DdH2O 13.7 ul 总体积20ul 混匀瞬时离心 5.1.2.2P℃R反应体系 94℃预变性 4min 94℃变性 30s 55℃退火30s 30个循环 72℃延伸 40s 72℃延伸8min 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果 5.2产物的表达 参考文献： [1]何大俊 朱新霞 生物技术试验讲义[M] 2011-3 [2] 赵永芳 黄健 生物化学技术原理及应用[M] 科学出版社 2010-2 [3]黄迎春，孙春昀，冯红，等．利用基因芯片检测转基因作物[J]．遗传，2003，25(3)：307—310． [4]郭燕霞，刘开会，邱宁，等．6种特殊生物检材的DNA提取[J] 刑事技术，2002．5：52—53． [5]温建新，李俊，周顺，等．大肠杆菌质粒DNA提取方法的优选[j]．西南农业学报，2007，20(4)：825—828．