转基因植物及其产品检测　DNA提取和纯化

NY NY 中华人民共和国农业行业 NY/T674—2003 转基因植物及其产品检测 DNA提取和纯化 Detection of Genetically Modified Plant Organisms and Derived Products – DNA Extraction and Purification 报批稿 2003-04-01发布 2003-05-15实施 中华人民共和国农业部 发布 前 言 本标准由中华人民共和国农业部科技教育司提出。 本标准起草单位：中国农业科学院生物技术所、中国农业科学院植物保护研究所、上海市农业科学院、农业部科技发展中心、中国农业大学。 本标准主要起草人：贾士荣、金芜军、张大兵、彭于发、黄昆仑、李宁、汪其怀、罗云波。 本标准为首次发布。 转基因植物及其产品检测 DNA提取和纯化 1 范围 本标准了转基因植物及其产品中DNA提取和纯化的方法和技术要求。 本标准适用于转基因植物及其产品中DNA的提取和纯化。 2 性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。 NY/T672 转基因植物及其产品检测 通用要求 NY/T673 转基因植物及其产品检测 抽样 3 原理 通过物理和化学方法使DNA从样品的不同组分中分离出来。利用不同的纯化方法，弃除样品中的蛋白质、脂肪、多糖及其它次生代谢物，及DNA提取过程中加入的氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇和乙酸钠等，获得纯化的DNA。 4 试剂与溶液 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂；配制好的溶液经高温灭菌后使用。 4.1 溴代十六烷基三甲胺（Cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB）。 4.2 三羟甲基氨基甲烷（Tris (hydroxymethyl) aminomethane, Tris）。 4.3 二水乙二胺四乙酸二钠（Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate, EDTA-Na·2H2O）。 4.4 -巯基乙醇（-Mercaptoethanol）。 4.5 氯仿（Chloroform）。 4.6 异戊醇(Isoamyl alcohol)。 4.7 异丙醇(Isopropyl alcohol)。 4.8 氯仿+异戊醇=24＋1(v+v)。 4.9 76%乙醇溶液：取760 mL无水乙醇，加水定容至1 L。 4.10 70%乙醇溶液：取700 mL无水乙醇，加水定容至1 L。 4.11 CTAB提取缓冲液I：配制每升CTAB提取缓冲液I，应在800 mL去离子水中加入46.75 g 氯化钠，摇动容器使溶质完全溶解，然后加入50 mL 1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) (在800 mL去离子水中溶解121.1 g三羟甲基氨基甲烷（Tris），，冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0（约需42 mL浓盐酸），加水定容至1 L，分装后高压灭菌)，20 mL 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) (在800 mL水中加入186.1 g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠（NaOH）调节溶液的pH值至8.0（约需20 g NaOH颗粒）然后定容至1 L，分装后高压灭菌)，用水定容至1 L，分装后高压灭菌。 4.12 CTAB提取缓冲液II：配制每升CTAB提取缓冲液II，应在800 mL去离子水中加入46.75 g 氯化钠，20 g溴代十六烷基三甲胺(CTAB)，摇动容器使溶质完全溶解，然后加入1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 50 mL，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 20 mL，用水定容至1 L，分装后高压灭菌。 4.13 乙酸钠溶液：配制每升乙酸钠溶液，应在800 mL水中溶解408.1 g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至 5.2，加水定容至1 L，分装后高压灭菌。 4.14 RNase A：将10 mg胰RNA酶溶解于987μL水中，然后加入1 mol/L Tris-HCl (pH 7.5) 10 μL (在800 mL去离子水中溶解121.1 g三羟甲基氨基甲烷（Tris），加入60 mL浓盐酸，冷却至室温后调节pH值至7.5，加水定容至1 L，分装后高压灭菌),5 mol/L 氯化钠3μL（在800 mL水中溶解292.2 g氯化钠，加水定容至1 L，分装后高压灭菌），于100℃水浴中保温15 min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。 4.15 TE缓冲液：配制每升TE缓冲液，应在800 mL水中依次加入1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 10 mL，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 2 mL，加水定容至1 L，分装后高压灭菌。 5 仪器和设备 5.1 通常实验室仪器设备。 5.2 高速冷冻离心机（12000 r/min）。 5.3 高速台式离心机（12000 r/min）。 5.3 紫外分光光度计。 5.6 磁力搅拌器。 5.8 高压灭菌锅。 6 试验方法 6.1 试样的预处理 6.1.1 固态试样：待检测的固体试样研磨成颗粒状，颗粒的大小在2 mm以下。 6.1.2 非油脂类液态试样，如面酱等粘稠状食品可直接用于DNA的提取。酱油、豆奶、番茄酱等液态加工品可取50 mL以上试样（根据不同试样和不同检测要求，可以适当增加试样量），经10 000 r/min 离心10 min，弃去上清液，保留沉淀用于DNA的抽提；或者80℃加热蒸发水分后，取干物质用于DNA提取；或者在冷冻干燥后，取干物质用于DNA提取。 6.2 DNA的提取与纯化 6.2.1 CTAB法提取DNA 将100 mg经预处理的试样，在液氮中充分研磨成粉末后加入400 μL冰上预冷的CTAB提取缓冲液I中（不需研磨的试样直接加入）。加入500 μL 65℃预热的 CTAB提取缓冲液II，1μL 2-巯基乙醇，混匀，65℃保温30 min～90 min，其间不时轻缓颠倒混匀。待冷却至室温后加入5 μL RNase A贮液，室温下放置30 min。加入450 μL氯仿+异戊醇，轻缓颠倒混匀溶液。12000 r/min离心 2 min至分相。将上清液转移至干净的离心管中，依次加入600 μL异丙醇及60 μL乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀。12000 r/min离心10 min。弃上清液，加入800 μL 76%乙醇，12000 r/min离心5 min，弃上清液后，再加入100 μL 70%乙醇洗涤沉淀。12000 r/min离心5 min，弃上清液。除去残留的乙醇，待沉淀干燥后，DNA沉淀溶解于100μL TE缓冲液中，-20℃保存备用。 6.2.2 油脂类加工品DNA提取 取油脂食品适量（液态油取30 mL、磷脂类和固态油脂取5 g）放入250 mL三角瓶中，加入25 mL正己烷，磁力搅拌器上不断振荡混合2 h后，加入25 mL CTAB提取缓冲液II，继续于磁力搅拌器上振荡混合2小时。将溶液转入100 mL离心管中，于8000 r/min离心10 min，使有机相和水相分离，取水相，加入与水相溶液等体积的异丙醇及水相溶液1/10体积的乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀，室温放置10 min后，12000 r/min离心10 min，弃上清液，待沉淀干燥后用200 μL TE缓冲液溶解沉淀，加入200μL氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀， 12000 r/min离心2 min至分相。将上清液转移至干净的离心管中，加入与溶液等体积的异丙醇及溶液1/10体积的乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀。室温放置10 min后，12000 r/min离心10 min。弃上清液后，依次加入800 μL 76%乙醇和100 μL 70%乙醇洗涤沉淀。12000 r/min离心5 min，弃除去乙醇溶液。待沉淀干燥后，DNA沉淀溶解于100 μL TE缓冲液中，-20℃保存备用。 6.3 DNA溶液纯度的测定和保存 将DNA适当稀释，测定并其在260 nm和280nm的紫外光吸收率，以一个OD260值相当于50 μg/mL DNA浓度来计算纯化的DNA浓度。要求DNA溶液 OD260/OD280的比值在1.7~2.0之间。 依据测得的浓度将DNA溶液稀释到25 ng/μL -50 ng/μL，-20℃保存。 注：由于基因组DNA不宜反复冻融，因此建议对于需要经常使用的DNA需要分装，多管存放，需要使用时取出，融化后应该立即使用，使用结束后，剩余的DNA应在4℃冰箱短期保存，存放时间不宜超过14天。