Triton+X100与牛血清白蛋白的相互作用

!"#$%& ’()**与牛血清白蛋白的相互作用 魏晓芳 刘会洲! （中国科学院化工冶金研究所分离科学与工程青年实验室，北京 !"""#"） 摘 要 应用荧光光谱法研究了溶液体系中 $%&’() *+!""（$*）与牛血清白蛋白（,-.）之间的相互作 用。实验表明 $*对 ,-.的荧光有较强的猝灭作用，二者形成不发荧光的复合物所产生的静态猝 灭是引起 ,-.荧光猝灭的主要原因。从荧光猝灭结果求得二者的结合常数，发现在不同 $*浓度 下，结合常数 !及络合个数 " 均不同；低于 $*的 /0/，! 1 22" 0(3 4 5，" 1 "67!，高于 /0/，! 1 !" 0(3 4 5，" 1 "628。疏水作用是 $*与 ,-.相互结合的主要驱动力。 关键词 牛血清白蛋白，荧光光谱 ) 引 言 血清白蛋白在哺乳动物体内起着重要的贮存和输运作用，它能与多种内源和外源性物质结 合〔!〕。在实际应用中非离子表面活性剂与该种蛋白共存的机会甚多，因而了解非离子表面活性剂 与蛋白质之间的相互作用在理论及应用技术上有着重要的意义。不带电荷的非离子表面活性剂与 蛋白质的相互作用通常是很弱的，有的甚至没有作用，它们一般不改变蛋白质的二级结构〔8〕。在以 往的报道中，人们用于研究非离子表面活性剂与蛋白质作用的手段有表面张力法〔9〕、平衡渗析法和 量热法〔2〕等技术。运用灵敏、快速、简便的内源荧光法研究非离子表面活性剂与蛋白质的相互作用 尚未见报道。本文借助荧光技术研究了 $%&’() *+!""与牛血清白蛋白之间的结合反应，初步探讨了 $%&’() *+!""对牛血清白蛋白荧光的猝灭机理和两者之间的相互作用。 + 实验部分 +,) 试剂和仪器 牛血清白蛋白（,-.）为 ,:公司产品。$%&’() *+!""（文中简写为 $*）为 ;3?为 @6"的磷酸缓冲溶液。样品测定均在日立 公司 ?&’A/B& ;-+2C""型荧光光谱仪上进行。 +,+ 实验方法 在 C 05的容量瓶中，依次加入一定量的牛血清白蛋白（,-.）、$*溶液，用 >? @D"的缓冲溶液稀 释至刻度。混匀后测定相应的荧光谱。荧光激发波长分别选择为 8EC )0和 87C )0，发射波长分别 为 8#" F 2C" )0及 9"C F 2C" )0，狭缝宽度均选 86C )0，测定温度为 8"G。 - 结果与讨论 -,) !’对牛血清白蛋白的荧光猝灭效应 随体系中 $*浓度增加，,-.的荧光被猝灭，在 9"9 )0出现 $*的荧光发射峰，且随 $*的含量 增加而增强。同时在 999 )0存在一个等发射点（图 !）。引起 ,-.荧光猝灭的原因可能有 9个方面： 动态猝灭、静态猝灭和能量转移。按照 -’H%0+I(30H%方程 #" $ # 1 !J !K!"［L］（式中 #"和 # 分别为 加入猝灭物质前后的荧光强度值，!K为表观猝灭常数，［L］为猝灭物质的浓度，!"为 ,-.分子的荧 第 8#卷 8"""年 E月 化学（;MN*O ?P.*PM） 研究简报 QB&)HRH S(<%)A3 (T .)A3U’&/A3 QBH0&R’%U 第 E期 E77F @"! ! !777+"7+"!收稿；!777+!8+"8接受。 本文系国家自然科学基金重点项目资助课题。万方数据 光寿命，约 ! "#〔$〕）根据图 %数据，由猝灭曲线起始部分求得 &’(的表观猝灭常数 !) 为 $*+ , -.-- （/01 2 3）4-·#4-，此值大于水溶液中猝灭剂对生物分子的最大扩散猝灭常数 -5. , -.-.〔!〕一个数量级 以上，表明动态碰撞不是引起 &’(荧光猝灭的主要原因。 图 - &’(与 67在水溶液中的荧光光谱 89:5 - 81;0<#=>"=> #?>=@<>"@ =0"=>"@0;# #01;@90" （-）.5.；（%）!%；（E）-F!；（G）E-.；（$）GE%；（!）!%.；（+）HE.； （F）-%G.。"&’( I -5G+ , -.4$ /01 2 3，!>J I %!$ "/。 图 % 67的浓度对 &’(相对荧光强度的影响 89:5% K>1A@90"#L9? M>@N>>" @L> =0"=>"@1A@9O> 9"@>"#9@P 0B &’( B1;0<>#=>"=> !>J I %!$ "/，!>/ I EG% "/。 在相同条件下，测得纯 67溶液在 E.E "/处的荧光强度大于加入到含 &’(溶液中此峰处的荧 光强度，表明 67与 &’(结合后形成不发荧光的复合物。另外，从含不同浓度 67的 &’(混合溶液 的荧光发射光谱看到，在 EEE "/处出现一个等发射点，这是 67与 &’(形成包加化合物的有力证 据。从以上结果我们可以排除由无辐射能量转移引起的荧光猝灭，推断出 &’(与 67间形成不发荧 光的复合物而产生的静态猝灭是引起的 &’(荧光猝灭的主要原因。 !"# 用静态猝灭法分析 $%&’() *+,--与 ./0的相互结合反应 在静态猝灭作用中，荧光强度与猝灭剂的关系可由荧光D猝灭分子间的结合常数表达式推导求 出。设生物大分子有 #个相同且独立的结合位置，则有： #Q R !" # S Q#S （-） 式中 S为荧光生物大分子，Q为猝灭剂分子，Q#S为生成物，其生成常数 !为： ! $ ［Q#S］ ［Q］#S 若荧光体总浓度［S.］，且［S.］I［Q#S］R［S］，［S］为游离荧光体浓度，则有： ［Q#S］I［S.］D［S］ 在静态猝灭中，荧光体的荧光强度与其游离浓度呈正比［S］［S］I % %. ，则有： 10: %. & % % $ 10:! ’ #10:［Q］ （%） 由式（%）作图，通过斜率和截距可求出表面活性剂与蛋白质分子的结合常数 !及结合点数 #。 ..+ 分 析 化 学 第 %F卷 万方数据 为了准确得到 !"与 #$%的结合常数，选择 &’( )*为激发波长，以避免酪氨酸残基和 !"发射 图 + ,-.（!/ " ! 0 1）与 ,-.〔2〕的关系图 34.5+ 6,-7 -8 ,-.（!/ " ! 0 1）9:;<=< ,-.〔2〕 !:> ? &’( )*，!:* ? +@& )*。 的影响。实验表明随着 !"浓度的增加，#$%中色氨 酸荧光发射光谱强度降低。将实验数据用式（&）进 行处理，得到图 +，由所得直线算出 !"与 #$%结合 时的结合数点 #；应用平衡法和外推直线的截距，求 出相应的结合常数 $。从图 +可看出 !"浓度增加 表现出两种不同程度的结合反应。当 !"浓度低于 其临界胶束浓度 A*A（+5 ( B 1/0@ *-, C D）时，$ ? @@/ *-, C D，# ? /5’1；浓度高于其 A*A时，结合程度很弱， $ ? 1/ *-, C D，# ? /5@&。对以上结果分析可知，!"与 #$%的结合较弱，形成一个结合点。#$%分子表面存 在着较大的疏水裂隙〔E〕，非离子表面活性剂分子的 疏水部分可能进入该疏水区，与 #$%分子以疏水作 用方式相结合。实际上表面活性剂和蛋白质结合过 程中，不可避免地存在表面活性剂形成胶束的自缔合过程。当 !"浓度升高后，由于自身缔合的疏 水作用大于 !"与 #$%之间的弱疏水作用，竞争结果导致 !"分子之间聚集成胶束，降低了体系中自 由存在的表面活性剂浓度，从而降低了它们与蛋白质的有效结合。 !"#"$"%&"’ 1 FA*:)G*H I J5 %&’()*# +,-(.,(-/，!(#.,*0# 1#2 34/4 5 K>8-;L：M:;.G*-) 6;:<<，()**：1@+ & %)G)7NGOGL*G)GP,G) Q 65 6#,/-1.,*0#4 07 +(-71.,1#, 8*,9 :0&;)/-4 1#2 :-0,/*#4 5 R:S T-;U：VIV 6;:<<，())+：+@E + R4?# 5，(),-，((：+/W(X +/WW @ $=U-S Y Y，$G)LP:;. J Z，D:S4< Z %，ZG7-=.N M [，JG<:) D M5 <*0.9/)*4,-;，(),.，1’：’1&X ’1E ( DGU-S4A\ [ I，Y:P:; ]5 <*0.9/)*4,-;，()*+，1&（&1）：@1E1X @1E’ ^ DGU-S4A\ [ I5 :-*#.*?&/4 07 !&(0-/4./#./ +?/.,-04.0?; 5 R:S T-;U：6,:)=* 6;:<<，(),+：&^ @ E Z874)U F I，_G‘4A:U [，]N4;-) V %5 <*0.9*) 5 <*0?9;4 5 %.,1 5，()**，@’1：@E+X @W1 /0" 1%2"$3&245% 6"27""% /$425% 89(.. 3%: 65;4%" <"$=> ?@A=>4% Y:4 "4G-8G).，D4= J=4\N-=! （@0(#A +.*/#,*4, B1’0-1,0-; 07 +/?1-1,*0# +.*/#./ 1#2 C#A*#//-*#A，6#4,*,(,/ 07 =9/)*.1& D/,1&&(-A;， =9*#/4/ %.12/); 07 +.*/#./4，