指纹图谱的一种定性定量研究新方法_总量统计矩分析法

指纹图谱的一种定性定量研究新方法 :总量统计矩分析法 贺福元 1, 23 , 周宏灏 2 , 邓凯文 3 , 刘文龙 1 , 刘平安 1 (1. 湖南中医药大学 药学院 , 湖南 长沙 410208; 2. 中南大学 临床药理研究所 , 湖南 长沙 410078; 3. 湖南中医药大学 第一附属医院 , 湖南 长沙 410007) 摘要 : 本文运用了统计矩原理阐明并建立中药复方多成分指纹图谱定性定量分析法 :总量统计矩方法。包括 4 个参数 : ①总零阶矩 AUCT ; ②总响应率 AUCPW T ; ③总量一阶矩 MCRTT ,亦总量中心矩或总量平均保留时间 ,用…λT表示 ; ④总体二阶矩 VCRTT ,亦为平均保留时间方差 ,用 Šσ2T 表示。AUCT 能用于中药复方指纹图谱定量分析 , AUCPW T、MCRTT、VCRTT能用于中药复方指纹图谱定性分析。以此法研究不同产地大黄醇浸膏成分 HPLC指纹图 谱 ,得总量统计矩参数 : AUCT 为 31273 ×108 μV· s; AUCPW T 为 21286 ×106 μV· s·mg- 1 ; MCRTT 为 33150 m in; VCRTT为 48414 m in2 ;浓度 CT为 14312 mg·mL - 1。本法具有加合运算的特征 ,能消除溶剂干扰 ,获得纯品的总量统 计矩参数 ;具偶联性 ,能与多维向量偶联构成多维曲线中心矩及偏差分析。 关键词 : 指纹图谱 ; 中药 ; 统计矩原理 ; 总量统计矩 ; 谱量学 ; 大黄 中图分类号 : R917　　　文献标识码 : A　　　文章编号 : 0513 - 4870 (2008) 02 - 0195 - 07 收稿日期 : 2007208210. 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30472199, 30572378) ; 中国博士后基金资助项目 (20070410997) .3 通讯作者　Tel: 86 - 731 - 5381372, E2mail: pharm sharking@ tom. com A new qualitative and quantitative analytica l method of chromatographic f ingerpr ints: tota l quantum statistica l moment HE Fu2yuan1, 23 , ZHOU Hong2hao2 , DENG Kai2wen3 , L IU W eng2long1 , L IU Ping2an1 (1. D epartm ent of Pharm aceu tics, Hunan U niversity of Traditional Chinese M edicine, Changsha 410208, China; 2. Pharm acogenetic Research Institu te, Central Sou th U niversity, Changsha 410078; 3. The First A ff ilia ted Hospita l, Hunan U niversity of Traditiona l Chinese M edicine, Changsha 410007, China) Abstract: A new qualitative and quantitative analytical method of the chromatographic fingerp rints: the Total Quantum StatisticalMoment ( TQSM ) has been eluciated and established according to statistical moment p rincip le. The study was carried out with model drugs as the alcohol extracted liquid for Radix et Rhizoma Rhei (AELRR ) by HPLC under the chromatographic conditions that the column was C18 , 416 mm ×250 mm, 5μm; the detection of wavelengths was set at 254 nm; a solution of acetonitrile: 1% acetic acid water ( from 0∶100 to 100∶0) was carried with gradient elution as the mobile phase; the ratio of flow was 1 mL·m in - 1 ; the temperature was 40 ℃. The coefficients were dealt with Excel document. It has been established the exp ressions that consists of four main parameters: ① total quantum zero moment as AUCT , area under curve; ② total quantum respondent ratio as AUCPWT , area under curve per weight; ③ total quantum center moment as MCRTT , mean chromatographic retention time of total quantum, exp ressed by …λT ; ④ total quantum variance asVCRTT , variance of mean chromatographic retention time of total quantum, exp ressed by Šσ2T , by which we have obtained. The TQSM’s parameters of the AELRR, such as AUCT as 31273 ×108 μV· s, AUCPWT as 21286 ×106 μV·s·mg- 1 , MCRTT as 33150 m in, VCRTT as 48414 m in2 , and total quantum concentration as 14312 mg·mL - 1. The total quantum statistic moment can be characterized the curve of chromatographic fingerp rints with exp ressive parameters above, ·591·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2008, 43 (2) : 195 - 201 also used to quantitative analyses by AUCT , to qualitative analyses by AUCPWT , MCRTT and VCRTT. Key words: chromatographic fingerp rint; traditional Chinese meclicine; statistic moment p rincip le; total quantum statistical moment; chromatometer; Radix et Rhizoma Rhei 　　指纹图谱是指中药材经适当处理 ,采用一定的 分析手段 ,得到的能够标示该中药材特性的共有峰 的图谱 [ 1, 2 ]。中药指纹图谱的研究得到了很大的发 展 ,目前可采用高效液相色谱法 (HPLC)、薄层扫描 法 ( TLC)、高速逆流色谱法 ( HSCCC)、高效毛细管 电泳 ( HPCE)、气相色谱法 ( GC )、液质联用技术 (HPLC /MS) [ 3 ]、气质联用技术 ( GC /MS) [ 4 ]及红外 光谱法 ( IR) [ 5 ]等建立响应值与保留时间、波长等特 征变量的二、三维指纹图谱 ,探讨主要特征成分在一 定的特征变量作用下的指纹谱特征峰行为。目前对 中药指纹图谱的分析方法建立了向量夹角 [ 6 ]、模式 识别、人工神经网络、聚类 [ 7 ]、指数 F与相对指数 Fr [ 8 ]、可视化技术 [ 9 ]等分析方法 ,其中以向量夹角 法所构成的指纹图谱相似度分析方法较为常用。这 些方法大多将指纹图谱的特征峰响应值分割不连的 数据信息元 ,采用相对应特征峰的多维向量方法进 行计算判断。但由于中药特征峰的信息元易受实验 条件的干扰 ,同一组合成分难以出现完全相同的峰 形和峰数 ,这给峰峰相应特征峰的分析方法带来一 定困难。另外由主观来确定指纹图谱的特征峰 ,有 可能漏掉响应值较小的特征峰 ,或因干扰增加非特 征峰 ,使分析结果不稳定。本文运用统计矩原理 ,将 指纹图谱作为众多高斯曲线叠加而成的概率密度函 数曲线 ,用统计学的方法来分析指纹图谱的内在特 征 ,为指纹图谱的分析提供新的分析方法。 基本原理 众所周知 ,对于二维图谱 ,纵坐标用响应值 R 表示 ,横坐标用描述该指纹图谱的一个特性变量λ 表示 ,如保留时间或波长等 ;对于三维图谱 ,纵坐标 用响应值 R表示 ,两横坐标用描述该指纹图谱的二 个特性变量 λ表示 ,如保留时间和波长等 ,对于 n 个特性变量λi 的 n + 1维指纹图谱 ,可用式 (1)函数 关系表示 [ 10 ] : RT, n = f (λ1λ2 ⋯λn ) (1) 式中 RT, n可以为 X射线、紫外、红外、可见光谱、核磁 共振电磁波吸收值、亦可是电压、电流的响应值、折 光值、荷质比的丰度值等 ;λi 为描述指纹图谱的特 性变量 ,如光波的波长、色谱的保留时间、保留体积、 Rf 值、核磁共振的化学位移等。其中以色谱的光、 电响应值、荷质比响应值与对应保留时间、体积、波 长所构成的指纹图为主 ,更以 HPLC、GC或与 MS联 用所制得的指纹图谱最为常用 ,下面运用统计矩原 理对指纹图谱的特征进行分析。 中药指纹图谱可看成多成分一定特性变量表达 的响应值的函数曲线 , 可根据统计学中多维随机向 量求数学期望及方差的思路 [ 10, 11 ]来找到这群成分 的中心 , 同时还要分析这群成分离中心距离的偏 差 , 即方差。由于指纹图谱以峰 (谷 )的形式体现 , 描述这些谱线特性变量所对应响应值的中心和偏 差 , 亦能正确描述这张指纹图谱 , 自然与之在相对 色谱条件下的成分组的特点就能描述 , 成分的定性 分析就能建立。再根据曲线下的面积可表示一定总 量下的响应总值 , 按谱量学的方法对总成分进行定 量分析。 常用色谱指纹图谱为 HPLC形式 ,以保留时间 λ与光吸收响应值 R j的指纹图谱 ,根据色谱理论可 知 :色谱指纹图谱的每一峰 j的响应值 R j 曲线为高 斯曲线 [ 4 ] ,用下式表示 : R j = cT kr, jκc, j 2πσj e - (λ-λj) 2 2σ2j (0 <λ < t) 式中 cT 为成分的总含量 , kr, j其响应系数 ,κc, j为 构成比。故一张完整的色谱指纹图谱就可以看成为 由 m 个特征峰响应值曲线的迭加而成 ,故有式 (2)。 RT = ∑ m j = 1 R j = ∑ m j = 1 cT kr, jκc, j 2πσj e - (λ-λj) 2 2σ2j (0 <λ < t) (2) 按一维随机向量统计矩原理 ,求得 : 1. 总量零阶矩 AUCT ( area under curve of total quantum) : 为一定总量下曲线的总响应面积 , 用式 (3)表示 : AUCT = ∫ λ 0 ∑ m j = 1 cT kr, jκc, j 2πσj e - (λ-λj) 2 2σ2j dλ (0 <λ < t) (3) 当色谱条件固定时 ,则λj 固定 ,按高斯曲线可 知 :只要λ≥λj ±2158σj ,则曲线 RT 下的λj 对应成 分 j的 99%的响应值面积已被指纹图谱所包括 ,亦 当λ = 0 (指纹图谱的起点 ) ,用理论塔板数 N = λj σj 2 ≥21582 = 61654的色谱柱就能使指纹图谱的 ·691· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2008, 43 (2) : 195 - 201 第一峰λ1 ≥2158 m in响应值 99%得到计录 ,而最后 一峰的出峰时间为 λm = t - 2158σm , i = 1亦可以满足 同样要求。 t为指纹图谱的总时间。这样该色谱指 纹图谱总曲线 RT 下的面积包括了各色谱峰 99%以 上的面积 ,这样指纹图谱曲线从 0到 t的积分可以 看成从 - ∞到 + ∞积分 , (3)可变为式 (4) ,亦为各 峰响应面积 A j之总和。 AUCT = CT ∑ m j = 1 kr, jκc, j = ∑ m j = 1 A j (0 <λ < t) (4) 2. 总响应率 AUCPW T ( area under curve of total quantum per weight) :为 AUCT 与进样总 W T 量之比 , 能反映整个复方成分对特性变量的响应程度 ,用式 (5)表示 ,式中 fT 为一次进样量与样品溶液浓度之 间的换算因子。 AUCPW T = CT ∑ m j = 1 Kr, j·Kc, j CT fT = fT ∑ m j = 1 Kr, j·Kc, j (0 <λ < t) (5) 3. 总 量 一 阶 矩 MCRTT ( mean chromatographic retention time of total quantum ) :为总量色谱保留时 间平均值 ,亦为总量中心矩或数学期望 ,用 …λT 表示 , 可按式 (6)计算。…λT = ∑mj = 1 ∫λ0λR j dλ ∑ m j = 1 ∫ λ 0 R j dλ = ∑ m j = 1 A jλj ∑ m j = 1 A j (0 <λ < t) (6) 4. 总量二阶矩 VCRTT ( variance of chromatographic retention time of total quantum ) :亦为色谱平均保留 时间方差 ,用 Šσ2T 表示 ,用式 (7)表示 :Šσ2T = ∑mj = 1 ∫λ0 (λ - …λT ) 2 R j dλ ∑ m j = 1 ∫ λ 0 R j dλ = ∑ m j = 1 A j (σ2j +λ2j ) ∑ m j = 1 A j - …λ2T (0 <λ < t) (7) 由式 (5)、(7)、(8)可知 :当处方用量确定、药材 的产地确定、色谱的条件固定时 ,各成分对应峰的响 应系数 kr, j、保留时间λj、方差σj2 及构成比一定 ,总 响应率 AUCPW T 为一定值 ,用不同 CT 对 A i 进行多 元线性回归可求得相应总响应值 AUCT 的总浓度 , 这一原理可用来对药物组进行定量分析 (谱量学 )。 而总量中心矩 …λT 为定值 ,等于各单个成分中心矩或 保留时间λj 与响应值的算术平均值 ,总方差 Šσ2T 亦 为定值 ,等于各单个成分方差σj2 与保留时间λj 平 方和与响应值的算术平均值 ,再与 …λT 平方之差。 AUCPW T、…λT 和 Šσ2T 三参数与描述指纹图谱的特性 变量及成分构成比有关 ,而与样品的浓度大小无关 , 能用于指纹图谱的定性分析 ,总量统计矩的 4个参 数能对一张指纹图谱进行全面的定性定量分析。 5. 两两总量统计矩的加合计算式 :这一性质可用来 消除溶剂对中药复方成方指纹图谱的干扰 ,最终可 得在一定色谱条件下的纯中药复方成分指纹图谱总 量统计矩参数 ,这一性质还可用于多成分的加样回 收率实验研究。已知包括溶剂的指纹图谱 (为 m 峰 数 )总量统计矩参数的 …λT、Šσ2T 及纯溶剂 (为 s峰数 ) 的总量统计矩参数 …λTs、Šσ2Ts ,可由式 (8)求得扣除溶 剂后纯成分 (为 p峰数 )中药复方指纹图谱的总量 参数 …λT, p ,式 (9)求得 Šσ2T, p。…λTp = …λT ∑mj = 1 A j - …λTs ∑sj = 1 A j ∑ m p = s+1 Ap (8)Šσ2Tp = ∑mj = 1 A j (Šσ2T + …λ2T ) - ∑sj = 1 A j (Šσ2Ts + …λ2Ts ) ∑ m p = s +1 Ap (9) 式 (8)、(9)也可用于中药复方配伍后总成分的 性质及构成比变化的研究。特别是产生新成分的研 究 ,如总复方的数学期望和方差与单味药材成分的 数学期望和方差加合性差异较大 ,预示在配伍提取 时有新成分产生的可能性。还可用来研究整方的溶 解规律性 ,如以反相高效液相制得指纹图谱 , …λTp越 小 ,成分的亲水性越强。Šσ2Tp越小 ,成分的极性越集 中 ,同系物的可能性越大 ,如进一步结合 Flory2 Huggins的溶液理论 [ 12 ]、H ildebrand的溶解度参数 理论 [ 13 ]还可创建总纯成分的 HPLC溶度参数研究 方法。 材料与方法 仪器与试药 　W aters公司的高效液相色谱仪 , B reeze工作站 ,W aters 2487 Dual Absorbance Detector; 大黄均为药用大黄 R. heum off icina le Baill. 的干燥根 及根茎 , 购于甘肃 (甘肃产 )、江苏 (青海产 )、上海 (甘肃产 )、北京 (甘肃产 )、广州 (湖北产 )、云南 (四川产 )、四川 (四川产 )、湖南 (湖北产 )和江西 (青海产 )。芦荟大黄素 (批号为 1107952200110)、 大黄酸 (批号为 1107572200110)、大黄素甲醚 (批号 ·791·贺福元等 :指纹图谱的一种定性定量研究新方法 :总量统计矩分析法 为 1107582200110)等对照品购自中国药品生物制 品检定所。 供试品的制备 　①对照品液 :分别精密称取大 黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素对照品 10123、10111 和 10134 mg, 用甲醇溶解定容至 5010 mL。制成含 大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素分别为 01212、 01205和 01217 mg·mL - 1的对照品溶液 ; 另取三者 等量混合制成混合对照品液 ; ②样品 : 称取各地大 黄 50 g, 用 5倍量的 95%乙醇回流提取 2次 , 每次 1 h, 抽滤 , 滤液回收溶剂至浸膏后再甲醇溶解 , 0145μm微孔滤膜过滤 , 定容至 50 mL, 得含浸膏 140 mg·mL - 1样品液 , 其中上海 220061015样品的 浸膏浓度为 167156 mg·mL - 1的样品液 ,再稀释得 161756 mg·mL - 1的样品液。 色谱条件　C18柱 (250 mm ×416 mm ID, 5μm) , 流动相 : 乙腈 2水 (含 1%乙酸 )梯度洗脱 : 0 (5∶95) →10 m in (10 ∶90) →15 m in (25 ∶75) →30 m in ( 30 ∶ 70) →50 m in (40 ∶60) →70 m in (60 ∶40) →80 m in (70 ∶30) →90 m in ( 95 ∶5) ; UV 检测 : 254 nm。温 度 : 40 ℃。 结果与讨论 1　大黄指纹图谱的积分条件 精密吸取甲醇液 10μL,进样测得指纹图谱 S1 , 见图 1。分别以峰宽、响应率、最小峰面积和最小峰 高为 0101 s、0μV·s- 1、0μV·s、0μV的仪器最 低值积分得空白甲醇全峰数 236个 ,各参数用 Excel 软件进行计算 ,先由理论塔板数 n与保留时间 (λj ) 的关系λ2i / n计算出各峰的方差 ,空格峰的 n以临近 的较小保留时间峰计。再依式 ( 5)、( 6)、( 7)、( 8 ) 计算其他各总量统计矩参数 : AUCT 为 11406 ×107 μV·s, ∑λj ·A j (保留时间与峰面积乘积和 )为 71428 ×108μV·s·m in, ∑σ2j ·A j (峰方差与峰面 积乘积和 )为 21856 ×105 μv· s·m in2 , ∑λ2j ·A j (保留时间平方与峰面积乘积和 )为 51084 ×1010 μV·s·m in2 , …λT 为 52184 m in, Šσ2T 为 3 617 m in2 , 平均峰宽 ( 4Šσi )为 42115 s,平均响应率为 15013 μV s- 1 , 平均峰面积为 51956 ×104 μV s, 平均峰高 为 3 167μV。 在进行梯度洗脱时 ,因洗脱剂的比例改变及甲醇 的杂质产生稳定的空白对照峰 ,再按峰底宽、响应率、 最小峰面积和最小峰高分别为 0101 s、0μV· s- 1、 1 ×105μV·s和 0μV积分 , 得面积为 1 ×105 μV·s 的峰 22个 , 其总量统计矩参数 : AUCT为 11041 ×107 μV·s, ∑λj·A j为 61236 ×108μV·s·m in, ∑σ2j · A j为 11911 ×105μV·s·m in2 , ∑λ2j ·A j 为 41477 × 1010μV· s·m in2 , …λT 为 59187 m in, Šσ2T 为 4 299 m in2 , 平均峰宽 ( 4Šσi )为 33187 s, 平均响应率为 1 451μV·s- 1 , 平均峰面积为 41734 ×105 μV·s, 平均峰高为 21457 ×104μV。将空白 22个峰当作色 谱峰处理 , 依式 (8)、(9) , 总峰数总量统计矩参数 减去扣除 22个色谱峰的总量统计矩参数 ,得甲醇空 白溶剂的总量统计矩参数 : AUCT 为 31642 ×106 μV·s, ∑λj·A j为 11192 ×108μV·s·m in, ∑σ2j · A j为 91450 ×104μV·s·m in2 , ∑λ2j ·A j为 61074 × 109μV · s·m in2 , …λT 为 32173 m in, Šσ2T 为 59616 m in2。根据总量统计矩与正态峰参数的关系计算出 各噪音峰的平均峰宽、平均响应率、平均最小峰面积 和平均最小峰高分别为 44164 s、43133μV·s- 1、 11702 ×105 μV·s和 96711μV。以信噪比 3倍确 定积分阈值 :峰宽、响应率、面积总量和峰高为 135 s、 130 V·s- 1、51 000μV·s和 3 000μV。 2　仪器的精密度及混合对照品液的测定 大黄素甲醚对照品液的精密度 :分别吸取同一 样品液 (01211 mg·mL - 1 ) 20μL,进样 5次 ,按阈值 积分得大黄素甲醚和甲醇溶剂指纹图谱的总量统计 矩参数 ,按加合性相减得纯大黄素甲醚的总量统计 矩参数 MCRTT [ (69126 ±11519) m in ] ,与原色谱峰 保留时间 tR [ (71107 ±11620 5) m in ]比较 ,两者没 有差异 ( P > 0105) ,说明仪器的精密度和总量统计 矩的加合性可信。 吸取芦荟大黄素、大黄酸和大黄素甲醚对照品 混合液 10μL进样测定得 S2 (图 1)。 大黄乙醇提取样品液的精密度 :大黄乙醇提取 物用甲醇进行溶解 ,分别吸取同一样品液 ( 161756 mg·mL - 1 ) 10μL,进样 5次 ,按阈值对样品液指纹 图谱积分得图 1中 S3。其峰数目 (N )、最大峰面积 (MaA)、最小峰面积 (M iA )、AUCT、∑λj·A j、∑σ2j · A j、∑λ2j ·A j、…λT 和 Šσ2T 的 RSD分别为 7%、16%、 29%、16%、17%、28%、19%、114%和 4% ,可见 , 总量一阶矩 …λT 和二阶矩 Šσ2T 稳定 , 反映了本法的抗 仪器噪音干扰能力强。 3　大黄乙醇提取液指纹图谱不同积分条件参数的 测定 取同一批 ( 161756 mg·mL - 1 )大黄提取液 20 μL进样测定 , 分别按峰宽 ( s) ∶响应率 (V·s- 1 ) ∶ ·891· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2008, 43 (2) : 195 - 201 F igure 1　Chromatographic fingerp rint of the Radix Rhozom extract. S1 : Methanol; S2 : M ixture standard; S3 : Radix Rhozom extract. 12: A loe2emodin; 13: Reheim; 15: Phyacion 面积总量 (μV·s) : 峰高 (μV ) 为 270 ∶260 ∶ 102 000∶6 000、135 ∶130 ∶51 000∶3 000、80 ∶200 ∶ 40 000∶2 400、40 ∶100 ∶20 000 ∶1 600和 20 ∶50 ∶ 10 000∶800五种不同积分条件积分对同一指纹图 谱积分得不同总量统计矩参数 ,其 N、MaA、M iA、 AUCT、∑λj·A j、∑σ2j ·A j、∑λ2j ·A j、…λT 和 Šσ2T 的 RSD分别为 45%、62%、157%、10%、7%、83%、 6%、4%和 5% ,说明不同积分条件对 N、MaA 和 M iA影响很大 ,而对 …λT 和 Šσ2T 影响不大 ,反映了本法 的抗积分条件干扰能力强。 4　大黄乙醇提取样品液的指纹图谱线性关系测定 取同一批 (167156 mg·mL - 1 )大黄醇提取液 5、 10、15、20和 25μL进样测定 , 同法处理可得各指 纹图谱总量统计矩参数 , 其 N、MaA、M iA、AUCT、 ∑λj·A j、∑σ2j ·A j、∑λ2j ·A j、…λT 和 Šσ2T 的 RSD分 别为 11%、48%、19%、51%、49%、56%、49%、 4%和 5% ,说明总量统计矩法抗进样量干扰能力 强。而 N、MaA、M iA、AUCT、∑λj·A j、∑σ2j ·A j、 ∑λ2j ·A j、…λT 和 Šσ2T 与进样量的相关系数 r分别为 01883 4、01999 1、01509 2、01998 8、01999 0、 01920 1、01996 6、 - 01324 7和 01155 8,除 …λT 和Šσ2T 外 ,其他参数的相关性较好 ,特别是 MaA、AUCT、 ∑λj·A j、∑λ2j ·A j相关性更好 ,这说明 AUCT 可用 于定量分析。 5　大黄乙醇提取液指纹图谱加样回收率 吸取大黄乙醇提取液样品 (161756 mg·mL - 1 ) 6份 , 按样品 ∶混合对照品 ( 01211 mg·mL - 1 )分别 为 1∶015、1∶1和 1∶2比例各 2份 ,按样品供试液同 法操作制得加样混合物甲醇供试液 ,吸取加样混合 对照品、样品、加样供试液 20μL进样分别测定总量 统计矩参数 ,再按式 (8)、(9)计算加样前样品、混合 对照品的总量统计矩参数 ,按下两式计算对照品药 材处方偏倚度 D = (样品所算 …λT - 对照品 …λT ) /对 照品 …λT 和回收率 P =样品所算 CT /对照品所测 CT 进行计算。可得平均偏倚度 D 为 41177% ,平均回 收率为 99% , RSD为 6% ,说明所加多成分在指纹图 中位置的准确性和精密性是可靠的。利用总量统计 矩的加合性 ,可进行多成分的加样回收实验。 6　不同产地大黄醇提取液指纹图谱参数的测定 不同产地大黄用乙醇提取甲醇溶解制得供试品 液 ,吸取供试品液 20μL进样测定 (图 2)。按前述 积分条件积分 ,同法处理可得各指纹图谱总量统计 矩参数、RSD列于表 1。以甘肃产的大黄总量统计 矩参数为 1,其他产地大黄的总量统计矩相对参数 列于表 2。 由表 1可知 ,不同产地的大黄指纹图谱的总量 统计矩参数不同。由表 2可知各地含量由湖南的 01533 9到四川的 11082,差值为 2倍 ;而 AUCT 由湖 南的 01415 6到云南的 11185,差值也为 2倍 ,但两 者相关性为 01811 8,说明药材质量好坏与 AUCT 相 关 ,可用其进行定量分析 ; …λT 由云南的 01899 9到江 西的 11122, RSD为 71167% ,与不同产地的相关性 为 - 01444 6, Šσ2T 由北京的 01754 8到江西的 11181, RSD为 16106% ,与不同产地的相关性为 - 01533 5, 说明 …λT、Šσ2T 与产地变化不大 , 可以用来定性分析 大黄。平均 AUCPWT 既可用来定性 , 也可用来定量 分析。在此色谱条件下纯大黄成分的平均总量统计 矩参数为 : AUCT 为 31273 ×108μV·s; AUCPWT 为 ·991·贺福元等 :指纹图谱的一种定性定量研究新方法 :总量统计矩分析法 F igure 2　Chromatograph fingerp rints of the Radix Rhozome at the main p laction of p roduce over country. S1: Gansu; S2: J iangsu; S3: Shanghai; S4: Beijing; S5: Guangzhou; S6: Yunnan; S7: Sichuan; S8: Hunan; S9: J iangxi Table 1　Parameters of chromatographic fingerp rints of the Radix Rhozome samp le from various p lace of p roduction (1 g·mL - 1 , injection 10μL) Place of p roduce C /mg·mL - 1 Parameters N MaA a /μV·s M iAb /μV·s AUCT /μV·s ∑λj·A j /μV·s·m in ∑σ2j ·A j /μV·s·m in2 ∑λ2j ·A j /μV·s·m in2 …λT /m in Šσ2T /m in2 Gansu 16614 45 61058 ×107 81694 ×104 41796 ×108 11641 ×1010 11224 ×107 81126 ×1011 34122 52313 J iangsu 13313 50 21124 ×106 81077 ×104 21286 ×108 71686 ×109 21418 ×107 31696 ×1011 33163 48614 Shanghai 16715 52 31751 ×107 91887 ×104 31237 ×108 11122 ×1010 91325 ×106 51440 ×1011 34165 48010 Beijing 16211 50 21461 ×107 11348 ×105 31415 ×108 11042 ×1010 11565 ×107 41525 ×1011 30150 39510 Guangzhou 91175 44 21445 ×107 11646 ×105 21037 ×108 61757 ×109 81811 ×106 31326 ×1011 33117 53213 Yunnan 17715 58 11054 ×108 71607 ×104 51683 ×108 11750 ×1010 11663 ×107 71367 ×1011 30179 34813 Sichuan 18011 48 71391 ×107 11306 ×105 31723 ×108 11183 ×1010 11167 ×107 51541 ×1011 31177 47910 Hunan 88184 47 21330 ×108 11064 ×105 11993 ×108 61842 ×109 71637 ×106 31340 ×1011 34133 49714 J iangxi 12115 40 31083 ×107 11375 ×105 21285 ×108 81777 ×109 91199 ×106 41783 ×1011 38141 61811 RSD /% 24193 1017 10612 26188 39165 36130 41106 33125 71167 16106 r 01557 - 012756 - 014224 018118 018010 013310 017587 - 014446 - 015335 Average 14312 48122 61582 ×107 11130 ×105 31273 ×108 11083 ×1010 11282 ×107 51127 ×1011 33150 48414 aMaximum peak area; bM inimum peak area Table 2　Parameters of chromatographic fingerp rints of the various p lace of p roduction for Radix Rhozome samp le compared with The Gansu’s Place of p roduce C i /CG Parameter N i /N G MaA i / MaAG M iA i / M iAG AUCTi / AUCTG (∑λj·A j) i / (∑λj·A j ) G (∑σ2j ·A j ) i / (∑σ2j ·A j ) G (∑λ2j ·A j) i / (∑λ2j ·A j ) G …λTi /…λTG Šσ2Ti /Šσ2TG Gansu 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 J iangsu 01801 1 1111 01035 04 01929 0 01476 6 01468 4 11976 01454 8 01982 8 01929 5 Shanghai 11007 1116 01619 0 11137 01674 9 01683 7 01761 8 01669 5 11013 01917 3 Beijing 01974 2 1111 01406 1 11550 01712 1 01635 0 11279 01556 9 01891 3 01754 8 Guangzhou 01551 4 01978 01403 5 11893 01424 7 01411 8 01719 9 01409 3 01969 3 11017 Yunnan 11067 1129 11740 01875 0 11185 11066 11359 01906 6 01899 8 01665 6 Sichuan 11082 1107 11220 11502 01776 3 01720 9 01953 4 01681 9 01928 4 01915 3 Hunan 01533 9 1104 31845 11224 01415 6 01416 9 01623 9 01411 0 11003 01950 5 J iangxi 01730 2 01889 01508 7 11582 01476 4 01534 9 01751 55 01588 6 11122 11181 ·002· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2008, 43 (2) : 195 - 201 21286 0 ×108μV·s·mg- 1 ; MCRTT 为 33150 m in, VCRTT 为 48414 m in2 ;浓度 CT 为 14312 mg·mL - 1。 结论 由实验可知 ,同一样品在不同进样量、不同积分 门槛值、不同溶剂、重复进样 ,都难得到相同峰数目 和峰峰相应面积相同的指纹图谱 ,如采用以特征峰 为基础分割计算信息元的方法分析指纹图谱不易进 行。若采用总量统计矩法可得到满意的效果 [ 14 ]。 本文对指纹图谱的数学分析方法进行探讨 ,旨在说 明总量统计矩方法的在指纹图谱的数学分析方面有 其明显的优势 : ①抗干扰性 ,可以降低测试方法的 要求 ———各峰的分离状态、形状、重现性、稳定性、共 有与非共有没有严格的要求 ; ②加合性 ,能用来消 除仪器的干扰 ,进行药物配伍机制研究 ; ③偶联 性 ,能与多维向量偶联构成多维曲线中心矩及偏差 分析。如与药物代谢动力学经时变量偶联构成谱动 学 ,与药效学偶联构成谱效学 ,两者均偶联构成谱效 动学。 综上所述 ,用总量统计矩法 3个参数 MCRTT、 VCRTT 和 AUCPWT 进行定性分析 (与对照品比较 ) , 用 AUCT、AUCPWT 进行定量分析 ,亦谱量学分析 : 先按前述方法建立指纹图谱总量统计矩分析方法 , 然后对不同产地中药提取物的指纹图谱的特征峰 (一定时段的峰面积 )与总浓度进行多元线性回归 求得各特征峰面积前面的响应系数 ,利用这一组响 应系数就可以对不同产地的中药进行定量分析。还 可利用总量统计矩的加合性 ,可以求得纯中药多成 分提取物的指纹图谱总量统计矩参数 ,建立复方提 取物对照品指纹图谱总量统计矩参数。 将本法与指纹图谱与中药材的基因多态性关 联 ,最终还可建立纯成分组的 Hardy2W einberg平 衡 [ 15 ]群指纹图谱总量统计矩参数质量控制体 系 [ 16 ]。但与相关系数法、Nei系数、距离系数法 [ 14 ] 等其他相似度计算法的比较需进一步研究。 References [ 1 ] Ren DQ. Seize the current opportunity, meet challenge [ J ]. Chin Tradit PatMed (中成药 ) , 2002, 24: 1 - 2. [ 2 ] Tu PF. Establishment of fingerp rint for the traditional Chinese crude drugs and exemp lary exp lanation on the technical requirement [ J ]. D rug Stand China (中国药品 标准 ) , 2000, 1: 22 - 29. [ 3 ] Dai DS, Cao J, W ang YM. Determ ination and comparison of active fraction A of Guizhi Tang [ J ]. Chin J Exp TraditMed Form (中国实验方剂学杂志 ) , 2001, 7: 1 - 4. [ 4 ] Luo JP, L i JL, Cheng FL. The analyses of GS2MS of the chem ical components in ephedra decoction [ J ]. Chin J Exp TraditMed Form (中国实验方剂学杂志 ) , 2001, 7: 1 - 3. [ 5 ] Yu J, W u YJ, Cheng YY. A novel fingerp rint method for quality evaluation of Chinese medicinal p lants based on analytical data visualization [ J ]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志 ) , 2002, 37: 713 - 717. [ 6 ] W ang LX, Xiao HB, L iang XM. Vectorial angle method for evaluation the sim ilarity between two chromatographic fingerp rints of Chinese herb [ J ]. Acta Pharm Sin (药学 学报 ) , 2002, 37: 713 - 717. [ 7 ] N ie L, Luo GA, Cao J, et al. Pattern recognition app lied to the fingerp rint of traditional Chinese medicine characterized by two2dimension information data [ J ]. Acta Pharm Sin (药学学报 ) , 2004, 39: 136 - 139. [ 8 ] Sun GX, L iu XL, Deng XY, et al. The index F and relative index F r of chromatographic fingerp rints [ J ]. Acta Pharm Sin (药学学报 ) , 2004, 39: 921 - 924. [ 9 ] W ang H, L i ML, Tan JP. Set up chromatographic fingerp rints of Chinese herb in order to control pharmaceutics qualities [ J ]. J Chengdu Univ TCM (成 都中医药大学学报 ) , 2002, 25: 43 - 46. [ 10 ] L iu JT, Zhang KR, Zheng Y. Probability &Mathematical Statistics (概率论与数理统计 ) [ M ]. Shanghai: Shanghai Science Press, 1991: 168. [ 11 ] Mathematical Handbook Edited Group. Mathematical Handbook (数学 ) [M ]. 8 th ed. Bejing: H igh Education Press, 2000: 320. [ 12 ] Cai ZY, Hou YJ. Determ ination of unknown parametersin flory new polymer solution Theory [ J ]. J Chem Ind Eng (化工学报 ) , 1991, 42: 87 - 95. [ 13 ] Sun ZL, L iu MC, Hu ZD. The study on retention behavior of solutes in RPLC — a discussion about retention mechanism and a simp le calculation method of expanded solubility parameter [ J ]. J Instrum Anal (分 析测试学报 ) , 1988, 7: 15 - 19. [ 14 ] N ie L, Cao J, Luo GA. Comparison of different methods for evaluating the sim ilarity of the fingerp rints of traditional Chinese medicines [ J ]. Chin Tradit Pat Med (中成药 ) , 2005, 27: 249 - 252. [ 15 ] He FY, Luo JY, Deng KW. A study of total amount statistic moment for TCM pharmacokinetics [ J ]. World Sci Technol2Mod Tradit Chin Med MaterMed (世界科学 技术 ———中医药现代化 ) , 2006, 9: 13 - 18. [ 16 ] Zhang HL, Zhang HY. Study on the maximum entropy p rincip le and population genetic equilibrium [ J ]. Hereditas (遗传 ) , 2006, 28: 324 - 328. ·102·贺福元等 :指纹图谱的一种定性定量研究新方法 :总量统计矩分析法