大黄及大黄素甲醚

目前我国新药的研制，在《新药审批办法》中明确要求要制定临床研究用质量及生产用质量标准 大黄素甲醚 基本信息 英文名 Physcion 别名 1,8-Dihydroxy-3-methoxy-6-methyl-anthraquinone; Emodin-3-methyl ether 产品名称 大黄素甲醚; 1,8-二羟基-3-甲氧基-6-甲基蒽醌 分子结构 分子式 C16H12O5 分子量 284.27 CAS 登录号 521-61-9 EINECS 登录号 208-315-7 大黄素甲醚 来源：掌叶大黄Rheum palmatum L的根茎。 英文名：Physcion 异名：Parietin,Rheochrysidin,朱砂莲乙素，非斯酮 结构式：（见右图） 分子式及相对分子量：C16H12O5，284.26 颜色及状态：为砖红色或橙黄色单斜针状结晶。 　 　 生物活性：     (一)抗菌作用 　　大黄素甲醚对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、链球菌和痢疾杆菌等26种细菌均有抑制作用；在沙门氏菌TA1535试验有突变作用。 　　(二)抗癌作用 　　大黄素甲醚对人体宫颈癌Hela细胞长生抑制作用较强，IC50=0.1kg/ml。 体内分布和药代动力学：     按18.5μg/ml剂量给雄性大鼠灌胃大黄素甲醚，6小时出现血药峰值，Cmax=40.7μg/ml,主要分布在肝、肾和脑组织，其次为肺和心脏。在脂肪和肌肉中没有检出大黄素甲醚。此后，肝脏中的药物浓度缓慢下降；相比之下，肺和心脏中的药物浓度下降较快。给药后72小时内，从粪便中排泄的大黄素甲醚是给予剂量的14.13%，主要为游离型大黄素甲醚；从尿液中排泄的大黄素甲醚是给予剂量的0.13%，这些结果说明大黄素甲醚主要经粪便排泄。     试验结果说明大黄素甲醚在大鼠体内过程存在性别差异，但大黄素甲醚在雄性和雌性大鼠体内的代谢产物均为大黄素 大黄素 来源：掌叶大黄Rheum palmatum L的根茎。 英文名：Emodin 异名：Frangula emodin,Rheum emodin,Archin，朱砂莲甲素 结构式：（见右图） 分子式及相对分子量：C15H10O5，270.23 颜色及状态：橙黄色针晶 　 　 生物活性：     (一)抗肿瘤活性     大黄素对小鼠实体肉瘤S-180，小鼠肝癌、乳腺癌、艾氏腹水癌、淋巴肉瘤、黑色素瘤和大鼠瓦克瘤及肺癌A-549均有抑制作用，其抑制率在30%以上。在50mg/kg日-1剂量下对小鼠黑色素瘤生长的抑制率为73%；在75mg/kg日-1剂量下对小鼠乳腺癌的抑制率为45%。大黄素可延长P388白血病小鼠的存活期，延长率在40%以上。其作用之一是抑制癌细胞的DNA、RNA和蛋白质的生物合成，抑制癌细胞的氧化脱氢。     (二)抗微生物生长作用     大黄素对金黄色葡萄球菌209P、链球菌、白喉杆菌、枯草杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、流感杆菌、肺炎球菌、卡他球菌等均有抑制作用；对临床常见厌氧性细菌有较强的抑制作用；其MIC略高于甲硝唑，在8μg/ml浓度能使76%~91%的厌氧菌生长受抑。大黄素抗菌作用机制与抑制线粒体呼吸链电子传递、抑制呼吸与氨基酸、糖和蛋白质代谢中间产物的氧化和脱氢等有关。抑制核酸和蛋白质合成的最终结果，使细菌生长受抑。     (三)免疫抑制作用     按70mg/kg剂量给大鼠腹腔注射大黄素，能够抑制大鼠抗体产生、抑制碳粒廓清能力、减轻免疫器官的重、降低白细胞数、降低腹腔巨噬细胞的吞噬功能。体外在10mg/ml浓度对[3H]-TdR和[3H]-Urd参入淋巴细胞有明显的抑制作用。     (四)解痉、止咳作用     大黄素对乙酰胆碱所致离体大鼠肠管的痉挛有很强的抑制作用，约为罂栗碱的4倍。大黄素还有明显的止咳作用。     (五)对心血管系统的作用     大黄素在小剂量对离体蟾蜍心脏有兴奋作用，而大剂量则有抑制作用。大黄素还有降压作用。     (六)利尿作用     大黄素可使尿中钠和钾含量增加，促进输尿管蠕动，增加尿量。     (七)对组胺的作用     按10μg/kg剂量给实验性肠梗阻大鼠灌胃大黄素，可使大鼠肠粘膜组胺含量恢复至正常水平，但对血中组胺含量无影响。     (八)对LTB4的合成作用     大黄素是5-脂氧酶的抑制剂，可抑制人型多核白细胞LTB4和全血中LTB4的合成，对PGE2的合成无抑制作用。     (九)泻下作用     大黄素可抑制钠和钾离子从肠腔转运至细胞，使水分滞留在肠腔内，刺激大肠，促进其蠕动，从而起到泻下作用，但作用较弱。 体内分布和药代动力学：     按50mh/kg剂量给大鼠灌胃14C—大黄素，24小时内尿液中的排泄量是给予剂量的18%，72小时内是给予剂量的22%。尿液中排泄的大黄酸大部分在24小时内排泄。给药后72小时内，尿液中代谢物很少，主要以游离形式存在，大黄素和大黄酸的总和约为给予剂量的16%，大黄素的葡萄糖醛酯或硫酸酯的含量仅为3%左右，尚有3%为其他放射性残留物。给药后24小时和120小时内，粪便中大黄素主要为游离态，分别为给予剂量的48%和68%。给药后6小时左右，胆汁中排泄的大黄素浓度达最高，在15小时内的排泄量为给予剂量的49%，以葡萄糖醛酸酯或硫酸酯形式存在的大黄素占70%，给药后3~5天内，大部分器官的放射活性明显降低，但直到第5天，肾脏中仍保持很高的放射活性。给药后72~120小时，肠系膜和脂肪组织的放射活性大大增加。     按91mg/kg剂量给小鼠灌胃大黄素后0~48小时内，经尿和粪便排泄的总蒽醌衍生物是给予剂量的53%。其中，在0~24小时内，尿和粪便中的排泄量总和为2%。给药后4小时，胆汁中总蒽醌衍生物达到峰值，然后逐渐下降。胆汁是大黄素排泄的主要途径之一 芦荟大黄素 来源：掌叶大黄Rheum palmatum L的根茎。 英文名：Aloe—emodin 异名：Rhabarberone,芦荟泻素 结构式：（见右图） 分子式及相对分子量：C15H10O5，270.23 颜色及状态：为橙色针状结晶。 　 生物活性：     (一)抗肿瘤活性 　　芦荟大黄素对P388白血病细胞有抑制作用，延长生存期。其作用机制之一是抑制癌细胞的DNA、RNA和蛋白质的生物合成。 　　(二)抗菌活性 　　在1.5~25mg/ml浓度，芦荟大黄素对葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、枯草杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌等均有抑制作用。其作用机制之一是抑制线粒体呼吸链电子传递。芦荟大黄素对金黄色葡萄球菌的核酸和蛋白质合成有较强的抑制作用。芦荟大黄素对临床常见厌氧性细菌有较强的抑制作用，其MIC略高于甲硝唑。在8μg/ml浓度能使76%~91% 的厌氧菌受抑。 　　(三)免疫抑制作用 　　芦荟大黄素能抑制生物体抗体产生，抑制碳粒廓清能力，减轻免疫器官的重量，降低白细胞数，降低腹腔巨噬细胞功能。体外在100μg/ml浓度对[3H]—TDR和[3H]Urd参入淋巴细胞有明显的抑制作用。 　　(四)泻下作用 　　芦荟大黄素有较强的泻下活性，肠内菌代谢芦荟大黄素    大黄酸    大黄酸蒽酮，后者有较强的泻下作用。 体内分布和药代动力学：     按4.5mg/kg剂量给雄性和雌性大鼠灌胃14C—芦荟大黄素，给予剂量的20%~30%分泌到尿液中，其余残留在粪便中。血浆中总放射量的10%是原形药物。给药后1.5~3小时血药浓度最高，此时雄性大鼠相当于芦荟大黄素248μg/ml，雌性大鼠相当芦荟大黄441μg/ml，比卵巢高3倍，比睾丸高10倍。肝脏、肾脏和肠道中芦荟大黄素比血浆中的高。芦荟大黄素在血液中的半衰期为50小时。     连续给健康志愿者试服用临床剂量的芦荟大黄素，第一次给药后90小时采血、制备血清，没有检出芦荟大黄素，但可检出大黄酸，3~5小时和10~11小时出现最高峰值，相当于总游离大黄酸150~160μg/ml。出现双峰的原因，可能是药物中的一部分大黄酸被直接吸收，另一部分大黄酸来源于芦荟大黄素。芦荟大黄素被肠内细菌转化为大黄酸。 大黄酸 来源：掌叶大黄Rheum palmatum L的根茎。 英文名：Rhein 结构式：（见右图） 分子式及相对分子量：C15H8O6，284.21 颜色及状态：为咖啡色针晶，升华后为黄色针晶。 　 　 生物活性：     (一)抗肿瘤活性 　　大黄酸对小鼠黑色素瘤、艾氏腹水癌、肝癌、乳腺癌、P388白血病细胞都有一定的抑制作用。腹腔注射大黄酸50μg/kg、21天，对小鼠黑色素瘤抑制率为76%。对艾氏腹水癌呼听课抑制作用的IC50值为40μg/kg。大黄酸对体肝癌和小鼠腹水肝癌抑制作用的机制之一是影响其线立体和微丝结构。 　　(二)抗菌活性 　　在1.5~25mg/ml深度，大黄酸对葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、枯草杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌等均有抑制作用。其作用之一是抑制线粒体呼吸链电子传递。大黄酸对金黄色葡萄球菌的核酸和蛋白质合成有较强的抑制作用，对无细胞系统DNA的生物合成也有抑制作用。 　　(三)免疫抑制作用 　　大黄酸能抑制生物体抗体产生，抑制碳粒廓清能力，减轻免疫器官的重量，降低白细胞数。 　　(四)利尿作用 　　大黄酸能使尿中钠、钾离子浓度升高，促进输尿管蠕动，增加尿量。 　　(五)泻下作用 　　大黄酸本身无泻下作用，其肠内菌转化产物大黄酸蒽酮有泻下活性，能够降低结肠对钠和氯离子的吸收，增加钾离子分泌。前列腺素在大黄酸蒽酮泻下活性上起到了重要作用。 　　(六)抗炎作用 　　大黄酸的1,8—二乙酰化物已用于治疗骨关节炎。在肠内，1,8—二乙酰大黄酸(1，8—Diacelyrhein)的乙酰基可完全被水解掉，有效物质形式应为大黄酸。 体内代谢： 　　给大鼠灌胃1，8—二乙酰基大黄酸，在动物和人肠内菌作用下转化为大黄酸。不被吸收的大黄酸继续转化为大黄酸蒽酮，被吸收的大黄酸在体内代谢为其葡萄糖醛酸酯和硫酸酯经胆汁排泄进入肠肝循环。在肠内脱葡萄醛酸基和硫酸基后又被重新吸收或转化为大黄酸蒽酮。静脉注射，即能以葡萄糖醛酸酯和硫酸酯形式随尿液排出，也能以葡萄糖醛酸酯和硫酸酯形式进入肠肝循环。进入肠肝循环有利于大黄酸在体内滞留更长的时间作用于靶组织或靶器官。　　 体内分布和药代动力学：     分别给大鼠盲肠内注入14C—大黄酸，5天后所有器官和组织除肾脏无放射活性，在尿和粪便中可检出代谢产物，粪便中尚包括非蒽醌类代谢产物。大黄酸按25mg/kg剂量、大黄酸蒽醌按20mg/kg剂量给大鼠一次性盲肠内给药，5天后尿液中的放射活性分别是37%和2.8%。粪便中放射活性分别是53%和95%，肾脏中的放射活性至少是24小时排泄量的61%。     给雄性大鼠灌胃或静脉注身14C—大黄酸，血药达48小时。静脉给药的器官分布达2天，而灌胃给药的器官分布达7天。器官中分布远低于血浆，睾丸和脑最低。器官中分布量最高的是肾脏。大黄酸与人和大鼠的血浆蛋白结合率都非常高。在红细胞吸收或吸附的大黄酸非常低。大黄酸和其代谢产物经肾脏和肝脏排泄，胆汁排泄的大黄酸代谢产物较易经肠肝循环再吸收。胆汁中的代谢产物主要是大黄酸的葡萄糖醛酸脂和硫酸酯，这些代谢产物也在尿液中检测到。大黄酸的口服吸收率为50~60%，结肠给药的吸收率为50%。     也有报道认为人或动物口服大黄酸易于吸收，在体内以肝、肾、胆囊分布最多。给家兔静脉注射大黄酸后5分钟，血液中的大黄酸即达峰值，然后迅速下降，1小时以后血中浓度即已接近痕量。     此外，给予家兔纯品大黄酸和药材粗提物（含大黄酸），大黄酸有明显不同的药代动力学行为。纯品大黄酸属一室模型，分布容积大，清除率高，血药浓度达峰值时间短。药材粗提物属二室模型，分布容积、清除率、血药浓度达峰值时间低于纯品大黄酸。 一种高效分离大黄酚和大黄素甲醚的简便方法(1) 作者：王定勇，陈铭祥，冯玉静 【摘要】  目的 研究大黄酚和大黄素甲醚混合物的高效分离方法。方法 采用硅胶柱色谱进行分离，薄层色谱跟踪检测，HPLC检测产品纯度。结果 在以工业级柱层析硅胶（100～200目）为填充剂的色谱柱上，以石油醚乙酸乙酯甲酸(体积比100∶1∶0.5)为洗脱剂，可以将大黄酚和大黄素甲醚完全分离。结论 硅胶柱色谱可以实现大黄酚和大黄素甲醚的高效分离；产品经HPLC检测，纯度达99%以上。 【关键词】  柱色谱法；大黄酚；大黄素甲醚 　　Abstract:Objective To study the efficient and simple method of separation of chrysophanol and physcion.Methods Using silica gel column chromatography for separation,TLC for tracking and detection,HPLC for purity detection of the products.Results Chrysophanol and physcion could be completely separated by industrial silica gel column chromatography ［100～200 mesh, petroleum etherethyl acetateformic acid (100∶1∶0.5) as elute］. Conclusion Chrysophanol and physcion could be effectively separated by silica gel column chromatography.Their purities were ≥99% by HPLC method. 　　Key words:column chromatography；chrysophanol；physcion 　　大黄(Rheum officinale Baill.) 为常用中药,具有泻下、抗菌、抗肿瘤、抗高脂血症、降低血压、健胃、利胆、保肝、强心、消炎、延缓衰老、调节免疫等作用［1］。大黄的主要有效成分是其中的5种游离蒽醌类化合物（见图1），例如，大黄酸具有抗肿瘤、抗炎、抗菌及调节肾功能等作用［2］；大黄素具有抑菌、抗炎、保护肝肾、抑制血小板聚集、改善微循环、抗癌等作用［3］；芦荟大黄素具有清除氧自由基、诱导肿瘤细胞凋亡等作用［4］；大黄素甲醚可通过血脑屏障，具有很强的抗炎作用［5］；大黄酚具有抗衰老作用、止血作用［6］。大黄酸、大黄素和芦荟大黄素可以通过简单的pH 梯度萃取法和重结晶得到单体，而大黄酚和大黄素甲醚在植物体内常共同存在，它们结构相似，酸性与极性相近，分离很困难。大黄酚和大黄素甲醚不仅具有较好的药理活性，而且大黄酚通过氧化反应可以转化为大黄酸，通过卤代和水解反应可以转化为芦荟大黄素；大黄素甲醚通过脱甲基化反应可以转化为大黄素。因此，大黄酚和大黄素甲醚单体的简单获取具有重要意义。我们在大黄的综合深加工研究中，得到了大量大黄酚和大黄素甲醚的混合物，并通过多次实验探索，找出了一种快捷、简单、高效的分离方法，现报道如下。     　　图1  大黄中5种主要游离蒽醌类化合物的结构式（略） 　　Fig.1  The structures of five main active anthraquinones of Rheum officinale 　　1  仪器与试剂 　　1.1  仪器          　　RE52cs旋转蒸发器（巩义市英峪予华仪器厂）；电子恒温水浴锅（深圳市国华仪器厂）；SHBⅢ 循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。 　　1.2  试剂          　　大黄酚和大黄素甲醚混合物（自制，从大黄中分离得到）；柱层析硅胶（工业级，100～200目，青岛海洋化工厂）；薄层层析硅胶G（化学纯，青岛海洋化工厂）；石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷等均为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）；大黄酚和大黄素甲醚对照品（中国药品生物制品检定所）。     　　2  方法与结果 　　2.1  薄层硅胶板的制备          　　配制质量分数为0.3％的羧甲基纤维素钠(CMCNa)水溶液，与薄层层析硅胶G粉，按3 mL∶1 g的比例配制调浆，以载玻片作为载体铺板，铺好后晾干，于105 ℃下活化1 h，放入干燥器中，备用。 　　2.2  色谱柱的制备          　　取一根内径和长度合适的玻璃层析柱，用洗脱剂湿法装柱，用手轻敲柱子，使硅胶装填结实且顶端平整，有效柱长控制在20 cm左右，硅胶用量为样品量的200倍。 　　2.3  样品的制备          　　大黄酚和大黄素甲醚的混合物用最少量的三氯甲烷溶解，再加入适量硅胶拌样（硅胶∶样品=20∶1，质量比），待氯仿挥发干后均匀铺于柱顶。 2.4  洗脱          　　以石油醚（60～90 ℃）乙酸乙酯甲酸(体积比100∶1∶0.5)为洗脱剂，进行洗脱，洗脱液减压浓缩后可循环利用。 　　2.5  色谱带的定位          　　洗脱一定时间后可以看见两段明显的色谱带，洗脱得快的那一段为大黄酚，较慢的那一段为大黄素甲醚。继续洗脱，分别得到橙红色颗粒状结晶（大黄酚）和橙黄色针状结晶（大黄素甲醚）。 　　2.6  薄层色谱鉴定          　　取制备好的薄层硅胶板，以石油醚乙酸乙酯甲酸（体积比10∶1∶0.5）为展开剂，以对照品作对照，确定橙红色颗粒状结晶为大黄酚，橙黄色针状结晶为大黄素甲醚。 　　2.7  大黄酚和大黄素甲醚纯度的HPLC检测方法(归一化法)         　　色谱柱为Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为30 ℃ ，进样量为10 μL，流动相为甲醇质量分数为0.1％的磷酸溶液(体积比85∶15)，流速为1.0 mL/min，检测波长为254 nm。检测结果明大黄酚纯度为99.01%，大黄素甲醚纯度为99.06%。色谱图见图2、3。     　　图2  大黄酚的HPLC图（略） 　　Fig.2  HPLC of chrysophanol 　　图3  大黄素甲醚的HPLC图（略） 　　Fig.3  HPLC of physcion 　　3  讨论 　　3.1  大黄酚和大黄素甲醚的分离研究，国内已有多篇文献报道：将样品先用经预处理的一定粒度的磷酸氢钙柱层析，然后用苯［7］或石油醚［8］洗脱，但此操作繁琐、费时，且苯的毒性较大；用纤维素柱层析易于分离、洗脱剂较单一(水饱和石油醚)，但纤维素粉制备费时［9］；也有人用薄层硅胶常压湿柱层析，然后用石油醚丙酮或石油醚乙酸乙酯(体积比15∶1) ［10］洗脱，虽然洗脱速度很快，但两者的分离度不是很理想。本文用工业级柱层析硅胶（100～200目）作柱层析进行分离，可在较短时间内获得完全分离，方法有效，简便，且洗脱剂可以循环使用，节省试剂。 　　3.2  装柱技术和加样技术可直接影响分离效果，宜采用较低活性的吸附剂，如硅胶的活性在Ⅱ～Ⅲ级较好，对于高活性的吸附剂预先用10％的展开剂进行饱和，否则在展层过程中，溶剂前沿不易整齐，影响层带分离；加样时，一定要均匀地平铺于柱顶，否则会出现层带交叉现象。 　　3.3  铁离子能与大黄素甲醚生成络合物，于50 ℃热结构易破坏。因此，在用硅胶柱层析法分离大黄素甲醚和大黄酚的过程中，应避免与铁离子的接触，特别需要控制硅胶中的铁含量，含铁量低于0.02％的层析硅胶影响较小。 　　3.4  大黄酚和大黄素甲醚混合物的上样量一般为0.2 g，量再增加就不能使它们完全分离［11］，而本文的上样量达到5 g,且能得到完全分离。 　　3.5  大黄酚和大黄素甲醚属于蒽醌类化合物，酚羟基呈弱酸性，本实验在柱层析洗脱剂和薄层展开剂中加入少量酸，目的是为了防止大黄酚和大黄素甲醚产生拖尾，从而使分离效果更佳。 【参考文献】   　　［1］ 李秀才．大黄的研究进展［J］．中国药学杂志，1998，33(10)：581．(免费论文网 www.mianfeilunwen.com ) 　　［2］ 郭美姿，徐海荣.大黄酸药理作用的研究进展［J］.国外医学中医中药分册，2002，24（3）：139-142. 　　［3］ 侯晓东，施瑞城，叶丽萍.大黄素的研究现状和展望［J］.中国热带医学，2005，5（8）：1738-1740. 　　［4］ 史明，段开文.芦荟大黄素诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展［J］.口腔材料器械杂志，2006，15（4）：217-219. 　　［5］ 韩国柱．中草药药代动力学［M］．北京：中国医药科技出版社， l999：345-346. 　　［6］ 武秀英，武庆泰，刘丽君．大黄的药理研究与临床应用［J］．中医药学报，1995，2(2)：54-56. 　　［7］ 中国科学院上海药物研究所．中草药有效成分提取与分离［M］．2版.上海：科学技术出版杜，1983：331-332． 　　［8］ 北京医学院．中草药成分化学［M］．第2版.北京：人民卫生出版社，1980：224． 　　［9］ 阚毓铭．大黄酚和大黄素甲醚分离方法的研究［J］．南京中医学院学报，1982(2)：37-39． 　　［10］ 孙阳，陈琼华．中药大黄的综合研究XV:薄层硅胶常压柱层析分离大黄酚和大黄素甲醚［J］．药物分析杂志，1985，5(5)：294-295. 　　［11］ 廖华卫，李瑞珍，陈飞苑.大黄中大黄酚的提取、分离和纯化方法研究［J］．中国药房，2006，17（12）：956-958. 方法名称： 黄连上清丸—大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的测定—高效液相色谱法 应用范围： 本方法采用高效液相色谱法测定黄连上清丸中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。 本方法适用于中成药黄连上清丸。 方法原理： 将供试品置索氏提取器内，加氯仿浸泡提取，提取液以氢氧化钠水溶液洗至无色，合并洗涤液作为供试品液。精密吸取对照品溶液和供试品液，分别注入高效液相色谱仪，用紫外吸收检测器，于波长254nm处检测大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的吸收值，以外标法计算含量。 试剂： 1. 乙腈（色谱纯） 2. 0.5%氢氧化钠水溶液 3. 0.1%磷酸水溶液 4.氯仿 仪器设备： 1 仪器 1.1 高效液相色谱仪 1.2 色谱柱 Spherrisorb C18 柱 (300 × 4.6mm，5µm)。 1.3 紫外吸收检测器 1.4 索氏提取器 2 色谱条件 2.1 流动相：乙腈 0.1%磷酸水溶液 = 90 10 2.2 流速：0.6mL/min 2.3 检测波长：254nm 2.4 柱温：45℃ 试样制备： 1. 称取供试品 精密称取本品细粉(过五号筛-80目) 1g。 2. 对照品溶液的制备 精密称取大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品，以氯仿溶液，制成每1mL含大黄素、大黄酚、大黄素甲醚分别为0.2mg、0.18mg、0.12mg的溶液，分别精密吸取1mL，置10 mL量瓶内，加氯仿稀释至刻度，作为对照品溶液。 3. 供试品溶液的制备 将供试品置索氏提取器内，加氯仿浸泡过夜，提取8h，提取液以0.5％氢氧化钠水溶液100 mL分次洗涤，至洗涤液无色，并合并至100 mL量瓶内，定容，作为供试品液。 注：“精密称取”系指称取重量应准确至所取重量的千分之一。“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。 操作步骤： 1.标准曲线的绘制 分别精密吸取上述对照品液4、6、8、10、12µL，注入高效液相色谱仪，用紫外吸收检测器，于波长254nm处分别测定大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的吸收值，以对照品溶液进样量对峰面积绘制标准曲线，进行线性回归，得到回归方程。 2. 供试品测定 精密吸取对照品溶液4µL、12µL，供试品液10µL，分别注入液相色谱仪，用紫外吸收检测器，于波长254nm处测定大黄酚的吸收值，以外标法计算出其含量。 参考文献： 姚仲青. HPLC同时测定黄连上清丸中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量.中草药，2001，22(8)：699-700. 该文章转载自医学全在线：http://www.med126.com/pharm/2009/20090109145040_73732.shtml 方法名称： 黄连上清丸—大黄素的测定—高效液相色谱法 应用范围： 本方法采用高效液相色谱法测定黄连上清丸中大黄素的含量。 本方法适用于中成药黄连上清丸。 方法原理： 将供试品置索氏提取器内，加乙醚回流提取，将提取液挥干，加甲醇定容作为供试品液。精密吸取对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，用紫外吸收检测器，于波长254nm处检测大黄素吸收值，以外标法计算含量。 试剂： 1, 甲醇（色谱纯） 2, 磷酸水溶液 2%(mL/mL) 3. 乙醚 仪器设备： 1 仪器 1.1 索式提取器 1.2 高效液相色谱仪 1.3 色谱柱 Kromasil C18 柱 (150 × 4.6mm，5µm)。 1.4 紫外吸收检测器 2 色谱条件 2.1 流动相：甲醇 2%磷酸水溶液 = 5 95 2.2 流速：1.0mL/min 2.3 检测波长：254nm 2.4 柱温：45℃ 试样制备： 1. 称取供试品 精密称取本品粉末试样1g。 2. 对照品溶液的制备 精密称取大黄素对照品10.30mg，加甲醇溶解并稀释至100mL，摇匀，精密吸取上述溶液1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至10mL，摇匀，作为对照品溶液。 3. 供试品溶液的制备 将供试品置索氏提取器内，用乙醚回流提取5小时至提取液无色，挥去乙醚，用甲醇定容于50mL容量瓶中，用0.45µm滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。 注：“精密称取”系指称取重量应准确至所取重量的千分之一。“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。 操作步骤： 1. 标准曲线的绘制 精密吸取上述对照品溶液4、8、12、16、20µL分别注入高效液相色谱仪，用紫外吸收检测器，于波长254nm处测定大黄素的吸收值，以对照品溶液进样量对峰面积绘制标准曲线，进行线性回归，得到回归方程。 2. 供试品的测定 精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10µL，分别注入液相色谱仪，用紫外吸收检测器，于波长254nm处测定大黄素的吸收值，以外标法计算出其含量。 参考文献： 庄惠清，陈敏. 高效液相色谱法测定黄连上清丸中大黄素的含量. 海峡药学，2003，15(2)：33-34 该文章转载自医学全在线：http://www.med126.com/pharm/2009/20090109145046_73741.shtml