《高级食品化学》实验设计指导

实验一 研究植物活性成分槐米芦丁 一、实验内容简介 ⑴不同提取方法的提取效果比较：索氏抽提法、回流提取法、超声波辅助提取法等； ⑵最佳提取条件优化； ⑶大孔吸附树脂纯化实验； ⑷槐米芦丁的检测方法比较：比色法和高效液相色谱法； ⑸芦丁的水解实验。 二、实验原理 芦丁的分子式为 C27 H30 O16 ·3H2 O，相对分子量为610.51，其性状为淡黄色结晶粉末或无晶形粉末，气味上无臭无味，口感上有苦味，熔点176~178℃，略溶于水（1g/1000mL），能溶于热水及乙醇，遇光易变质，需在阴凉处保存。芦丁为黄酮苷，遇酸水解成槲皮素和芸香糖。芦丁分子中具有较多的酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液中，酸化后又能析出沉淀。另外芦丁3,3,4,5,7-五羟基黄酮-3-O- 芸香糖甙, 它与芸香酶共存于槐米中，芦丁在槐米晾晒、洗涤、粉碎、提取过程中易受芸香酶作用而发生水解，因此，提取前及提取过程中灭酶或降低酶活是十分必要的。了解其分子式和理化性质对于正确选择提取方法，提高芦丁提取的效率和得率至关重要。 三、不同提取方法的研究比较 （一）索氏提取法 1．原理：芦丁微溶于水，易溶于甲醇，在沸甲醇中的溶解度为1g/7mL，槐米在沸甲醇中提取，将芦丁溶出，然后用水萃取即可得到芦丁粗品。 2．试剂仪器：甲醇（分析纯），定性滤纸，索氏抽提器，研钵 3．操作：称取10.0g粉碎的干燥槐米粉末，用滤纸包好，放入索氏抽提器，用甲醇抽提，直到抽提回流液无色，回收溶剂，烘干得到粗提物。 （二）碱提酸沉法 1．原理：芦丁分子中具有较多的酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液中，酸化后又能析出沉淀。 2．试剂仪器：石灰，3%硼砂，盐酸，pH试纸，研钵。 3．操作：称取10.0g粉碎的干燥槐米粉末，加50倍水煮沸，在搅拌下缓缓加入石灰乳调pH至8~9，加入3%的硼砂，在保持pH条件下，微沸数分钟，随时补充失去的水分，然后保持50℃~60℃的提取温度抽滤20min~30min,反复提取3次，得提取液，在适当的温度下用盐酸调pH至4以下，搅匀，静置6~8h，抽滤，水洗至洗液呈中性，60℃干燥，得芦丁粗品。 （三）超声波辅助提取法 1．原理：利用超声波的空化效应、湍流效应、微扰效应、界面效应和聚能效应等物理作用,加速被破碎物细胞壁的破裂,促进细胞内含物的溶出,从而实现天然产物低温、快速提取的目标。 2．试剂仪器：饱和硼砂，亚硫酸氢钠，氢氧化钠，pH试纸，超声波发生器，离心机，研钵。 3．操作：称取10.0g粉碎的干燥槐米粉末按1:15的料液比加入水，同时加入0.35~0.45g饱和硼砂、0.50~0.60g亚硫酸氢钠，用氢氧化钠溶液调pH为8~9，搅拌均匀，放入功率为1000W的超声波发生器（20kHz），室温超声处理10min。离心、过滤得滤液。滤渣中再按1:15的料液比加入水，同时加入0.35~0.45g饱和硼砂、0.50~0.60g亚硫酸氢钠，用氢氧化钠溶液调pH为8~9，搅拌均匀，再次室温下超声波处理10min，离心、过滤。合并2次滤液，以盐酸调pH至2~3。结晶析出时，抽滤，干燥得到芦丁粗品。 四、芦丁曲线的绘制 精密称取芦丁标准品200mg，置100mL容量瓶中，加甲醇70mL，置水浴上微热使溶解，凉至室温时，加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取10mL，置100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀即可（每1mL中含无水芦丁0.2mg。精密称取上述标准溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL。分别置于25mL容量瓶中，各加水至6mL，加5%（w）亚硝酸钠溶液1mL，使混匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL溶液摇匀，放置6min，加4%(ρ)氢氧化钠溶液10mL，再加水至刻度，摇匀，静置15min,然后于500nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标绘制标准曲线。 芦丁提取率的测定 ：取干燥芦丁粗品约1g，精密称定，加甲醇溶解后移入100mL容量瓶，再加甲醇洗涤并入容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，精密称取10mL至100mL容量瓶，加水至刻度，摇匀。精密称取3mL至25mL容量瓶中，按照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6mL”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的浓度，计算即得槐米中芦丁的含量。 （C—0.0024）×25 芦丁含量（%）= ×M2×100 9.1759×M1×M M——槐米干粉，g； M1——称取的干燥芦丁粗品，g； M2——总的干燥芦丁粗品，g； C——从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的浓度，mg/mL。 五、大孔吸附树脂纯化实验 原理：大孔吸附树脂是具有大孔网状结构的高分子吸附剂，其对芦丁的吸附机理是依靠树脂与芦丁之间的范德华力等作用，通过物理吸附进行的。 试剂与仪器：AB-8型大孔吸附树脂，乙醇，玻璃珠，尼龙网袋，具塞锥形瓶，水浴恒温振荡器，抽滤机，紫外可见分光光度计。 操作：大孔吸附树脂的活化和纯化 称取一定量的大孔吸附树脂，置入具塞锥形瓶中，加入4倍体积的无水乙醇，浸泡5h。过滤，弃去滤液，用无水乙醇洗至洗涤液中加3倍体积的水无白色浑浊现象出现，再用水洗至无醇味，抽滤至干，即得活化和纯化好的大孔吸附树脂，贮存备用。 准确称取经预处理的AB-8型大孔吸附树脂，装入装有玻璃珠子的尼龙网袋中，放入锥形瓶中，将槐米芦丁粗提品溶解，取适量粗品溶液置于锥形瓶中，将锥形瓶在多功能水浴恒温振荡器中震 荡吸附10h，静置20min，利用紫外可见分光光度计测定吸附残液的吸光度。根据下式测定其吸附量： Q=（Co- Ce）V/m 式中 Q----平衡吸附量，mg/g； Co---吸附前溶液中芦丁的浓度，mg/g； Ce---吸附平衡后溶液中芦丁的浓度，mg/g； V ---吸附液的体积，L； m---树脂质量，g。 将大孔吸附树脂装柱，用70%乙醇洗脱样液，分段收集洗脱液，待洗脱液基本无色，停止收集，测吸光度。 六、槐米芦丁的检测方法比较 （一）比色法： 1．实验原理：槐米中的有效成分芦丁在500nm处有最大吸收波长，可用紫外分光光度 计对其含量进行测定，操作简便，稳定，线性关系好。 2．​ 材料、试剂与仪器 槐米，甲醇，芦丁标准品；紫外可见分光光度计，索氏提取器。 3．​ 操作 （1）芦丁标准曲线的绘制：精密称取芦丁标准品200mg，置100mL容量瓶中，加甲醇70mL，置水浴上微热使溶解，凉至室温时，加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取10mL，置100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀即可（每1mL中含无水芦丁0.2mg）。精密称取上述标准溶液0，1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mL分别置于25mL容量瓶中，各加水至6mL，加5%（w）亚硝酸钠溶液1mL，使混匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL或1%(ρ)AlCl3 溶液摇匀，放置6min，加4%(ρ)氢氧化钠溶液10mL，再加水至刻度，摇匀，静置15min,然后于500nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标绘制标准曲线。 (2)样品测定：称取2.0g粉碎的干燥槐米粉末，用滤纸包好，放入索氏抽提器，用甲醇抽提，直到抽提回流液无色，移置100mL容量瓶中,用甲醇少量洗涤容器,洗液并入同一容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。精密量取10 mL,置100 mL 量瓶中,加水至刻度,摇匀。精密量取3 mL,置25 mL量瓶中,照标准曲线制备项下的方法,自“加水至6 mL”起依法测定吸光度。 （二）高效液相色谱法 1.实验原理：溶解在甲醇中的黄酮类化合物可直接注入到高效液相色谱仪中进行分离。在固定相为CLC-ODS，流动相为甲醇-水的反相色谱系统中洗脱，芦丁能得到很好的分离，而且可以定量。 2．材料、试剂与仪器 （1）材料：槐米（同仁堂药店购买）。 （2）试剂：甲醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）、重蒸水、芦丁标准品。 （3）仪器：高效液相色谱仪、二极管阵列检测器（DAD）、0.45μm微孔滤膜等。 3.操作步骤 (1)标准曲线的制作：精密称取芦丁标准品10mg于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成400μg/mL作为储备液。取适量储备液配成0、50、100、150、200μg/mL芦丁溶液，按以下色谱条件取1OμL进样。以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，制作标准曲线。 (2)色谱条件 色谱柱：Shim-pack CLC-ODS柱（5μm,150mm×6.0mm） 流动相：A、甲醇 B、水（含4%乙酸） 梯度洗脱：0-10min，50% A；10-15min，50% A→100% A；15-25min，100% A；25-30min，100% A→50% A 流速：1mL/min 检测器：二极管阵列检测器（DAD） 检测波长:254nm 柱温:室温 进样量：10μL (3)样品处理：槐米经干燥粉碎后，准确称取一定量（0.2g左右）样品置于索氏提取器中，用甲醇提取至无色。提取液转移至500mL的容量瓶中，用甲醇定容，备用。 (4)样品测定：样液用0.45μm微孔滤膜过滤，然后进样10μL，根据出峰的保留时间和峰面积来定性及定量。 七．芦丁的水解实验 1．实验原理： 芦丁是槲皮素的糖苷，与其他缩醛一样，氧苷键在碱性条件下稳定，在酸作用下很易水解，生成异槲皮苷和鼠李糖或槲皮素和芦丁糖，异槲皮苷和芦丁糖进一步水解得到槲皮素、葡萄糖和鼠李糖。 2．材料、试剂与仪器 （1）材料：芦丁（从槐米中提取得到） （2）试剂与仪器： H2SO4，圆底烧瓶，冷凝管，烘箱，烧杯，布氏漏斗，pH试纸等。 3．操作 精密称取5g干燥芦丁，置500mL容量瓶中，按料液比10:1加入2.5%H2SO4，回流30min，过滤，用蒸馏水洗至pH5~6，80°C烘干即得分解物槲皮素。 4．​ 计算 槲皮素得率=100*水解后的质量（g）/ 芦丁的质量(g) 实验二、研究天然食用色素β-胡萝卜素 一、实验内容介绍 ⑴β-胡萝卜素的提取条件研究； ⑶高效液相色谱法检测； ⑷β-胡萝卜素的稳定性研究； 二、β-胡萝卜素的提取方法研究 1、​ 有机溶剂萃取法 目前，从天然植物中提取β-胡萝卜素的技术主要有有机溶剂提取技术。常用有机溶剂为甲醇、无水乙醇、无水乙醚、石油醚、丙酮及石油醚-丙酮。但大量的有机溶剂的使用会带来不同程度的污染，且不易回收。 2、​ 超临界流体CO2萃取 近年来，大量资料明超临界流体CO2萃取β-胡萝卜素可以大大提高其产率。具有萃取效率高，速度快，无污染，简单，萃取物色味纯正等优点。据报道，在萃取过程中，压力越高收率越高，压力较小时，提高压力对提高收率影响很大，压力较大时，提高压力收率增加有限；温度越高收率越高，因此采用超临界二氧化碳萃取β-胡萝卜素时，适宜的操作条件为：压力30～35MPa,温度20～40℃，CO2的流量为20～25kg/g。但利用该设备生产胡萝卜素，成本高，对于大规模工业化生产不太适宜。 3、​ 微生物发酵法 利用微生物发酵法来提取β-胡萝卜素。将发酵液过滤得到的湿菌丝体进行细胞破壁，固液分离后用脱水剂脱水，然后用溶剂提取β-胡萝卜素，提取液经结晶、真空干燥后得到β-胡萝卜素晶体。本发明大大简化了工艺流程，设备简单，操作易于控制，生产成本低，β-胡萝卜素产品纯度高，回收率高，可达90%以上。 4、​ 超声波提取法 5、​ 酶法提取 β-胡萝卜素目前的研究主要是提高果汁饮料中β-胡萝卜素的含量。研究表明果胶酶和纤维素酶处理胡萝卜泥可以提高出汁率，胡萝卜素提出率可增加2倍多，混浊度增加，稳定性提高。 6、​ 无机盐沉淀剂法 三、天然β-胡萝卜素的提取 1、材料及仪器 （1）材料：新鲜胡萝卜 （2）试剂：β-胡萝卜素标准品，CaCl2·2H2O，石油醚(30℃～60℃)，三氯甲烷均为分析纯。 （3）仪器：搅拌机，电子天平，旋转蒸发仪，紫外可见分光光度计,冷冻干燥机，低速离心机。 2、天然β-胡萝卜素提取测定 取100g洗净的胡萝卜，经切块，打碎，减压抽滤，得橙红色胡萝卜汁液。取定量胡萝卜汁液，加入一定量浓度的氯化钙溶液，离心(4500r/min)得橙红色沉淀，低温冷冻干燥沉淀，加入一定体积有机溶剂石油醚一定温度下恒温回流提取一定时间，旋蒸浓缩制得β-胡萝卜素油状物。β-胡萝卜素用溶剂定容稀释后,用紫外分光光度计测定吸光度值,之后用β-胡萝卜素标准曲线计算其含量。 3、标准曲线的绘制 避光准确称取β-胡萝卜素标准品12.5mg（精确至0.0001g），置于50ml烧杯中，加少量三氯甲烷使其溶解，转移到再用石油醚定容至100mL棕色容量瓶，用石油醚稀释至刻度，摇匀后即得（0.125g/ml）。精确吸取上述溶液（0.125g/ml）5ml置于50ml烧杯中，用石油醚稀释至刻度，摇匀即得（12.5μg/ml）。精确移取1.0mL、2mL、3.0mL、4mL、5mL定容至25mL棕色容量瓶中,摇匀，即得(每毫升含0.5,1.0,1.5,2.0,2.5μg)标准系列溶液。用1cm比色皿，以石油醚为参比溶液，在450nm比色,测定吸光值。 样品中天然β-胡萝卜素的含量以质量分数以下式计算。 X1=[E×K×f/(m×E1)] ×100 X1:样品天然β-胡萝卜素的含量，%； E：样品溶液的吸光度； E1：1%浓度的β-胡萝卜素标准溶液的吸光度； m:样品质量，mg; K:稀释倍数 f:天然β-胡萝卜素标样的纯度。 四、薄层色谱纯化实验 （1）材料及试剂：硅胶G-0.5%羧甲基纤维素钠自制薄层板(105℃活化1h,放入干燥器备用)；石油醚、丙酮(均为分析纯)，实验用水为去离子水。 （2）薄层层析板的制备：称取1:1配比的硅胶和硅藻土各2g于研钵中，分两次加人0.5%羧甲基纤维素钠水溶液共约12mL，调匀后倒在玻璃板上，使吸咐剂均匀分布在板上，置水平架上自然干燥后，再放人80℃烘箱内活化1-2 h，置干燥箱内保存备用。 （3）标准液的配制，待测液：同上 进行薄层层析，点样为0.lmL，以石油醚作为展开剂，展开后洗脱定容至5mL，以石油醚作空白，450nm波长下测吸光度值。 五、β-胡萝卜素检测方法比较 传统的测定β-胡萝卜素的方法有比色法,但这种方法步骤繁琐,条件苛刻,分析时间长。近年来对高效液相色谱法测定β-胡萝卜素，流动相采用甲醇-异丙醇、甲醇-二氯甲烷、乙腈-四氢呋喃-水等,洗脱时间较长。采用甲醇-四氢呋喃(V/V=55/45)进行洗脱的方法,结果表明,洗脱时间仅为用乙腈-四氢呋喃-水作流动相洗脱时间的1/3(前者5—7min,后者17min),且峰形尖锐。 采用高效液相色谱法测定蔬菜中-胡萝卜素，待用溶液在以下条件进样：色谱条件色谱柱sphersorb C18柱4.6 150mm流动相甲醇+乙腈90+10流速1.0ml/min柱温40℃进样量10μl波长448nm。在色谱图然后根据-胡萝卜素浓度与峰面积标准曲线得出-胡萝卜素浓度进而计算出胡萝卜中-胡萝卜素含量。 六、β-胡萝卜素稳定性研究 β-胡萝卜素的稳定性试验表明：β-胡萝卜素对光、热的稳定性较差；常见防腐剂苯甲酸钠对β—胡萝卜素的稳定性基本没有影响；一价金属离子Na+和K+对β-胡萝卜素稳定性的影响都不是很明显，Na+和K+浓度的变化对稳定性基本没有影响；在二价离子中，Cu2+对β—胡萝卜素稳定性影响最为明显，其次是Fe2+和Zn2+，Mg2+和Ca2+对β-胡萝卜素稳定性影响最小。Cu2+随着浓度的增加对β-胡萝卜素稳定性影响增强，其他几种二价金属离子浓度的改变对β-胡萝卜素稳定性基本没有影响；在三价离子中，A13+对β-胡萝卜素稳定性影响不大，但是，Fe3+对β-胡萝卜素稳定性影响明显。在常见金属离子对β-胡萝卜素稳定性影响试验中，Cu2+和Fe3+对β-胡萝卜素稳定性影响明显可能与这两种金属离子具有较强的氧化性有关。