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骨折愈合的现代研究与局部基因治疗

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骨折愈合的现代研究与局部基因治疗 文章编号 :1009 - 4237(2003) 03 - 0230 - 03 ·综 述· 骨折愈合的现代研究与局部基因治疗 张建军 ,李兵仓 (第三军医大学野战外科研究所六室 ,重庆  400042)   摘要 :  本文综述了近年来有关骨折愈合研究的部分文献。作者认为 ,生长因子在骨折愈合中起着重 要的作用。应用生长因子或其基因疗法有望成为一种骨折治疗的重要方法 ,特别是应用能诱导未分化间质 细胞定向分化为成骨细胞的骨形态发生蛋白的基因治疗 ,具有应用价值。 关键词 : 骨折愈合 ; 生长因子 ; 基因疗法 ; 骨...
骨折愈合的现代研究与局部基因治疗
文章编号 :1009 - 4237(2003) 03 - 0230 - 03 ·综 述· 骨折愈合的现代研究与局部基因治疗 张建军 ,李兵仓 (第三军医大学野战外科研究所六室 ,重庆  400042)   摘要 :  本文综述了近年来有关骨折愈合研究的部分文献。作者认为 ,生长因子在骨折愈合中起着重 要的作用。应用生长因子或其基因疗法有望成为一种骨折治疗的重要方法 ,特别是应用能诱导未分化间质 细胞定向分化为成骨细胞的骨形态发生蛋白的基因治疗 ,具有应用价值。 关键词 : 骨折愈合 ; 生长因子 ; 基因疗法 ; 骨形态发生蛋白 中图分类号 :R 683 - 34   文献标识码 :A Study of fracture healing and it’s local gene therapy ZHANG Jian2jun , LI Bing2cang (Research Institute of Surgery ,Third Military Medical University ,Chongqing 400042 ,China) Abstract : To review the study on fracture healing ,and suggest that growth factors may play important roles in frac2 ture healing. Growth factor corresponding gene therapy may become a potential method in fracture healing , especially using the gene of bone morphogenetic protein which expresses the growth factor and induces the differentiation of progenitor cells into osteoblast efficaciously. Key words : fracture healing ; growth factor ; gene therapy ; bone morphogenetic protein 收稿日期 :2001 - 11 - 08 ;修回日期 :2002 - 08 - 27   骨折属平、战时最常见外科损伤之一。平时源于交通事 故的骨折及战时骨折多发而严重 ,致使后期治疗难度增加。 因而 ,骨折救治依然是创伤研究的重要课题之一。提高对骨 折愈合机制的认识仍具重要意义。 1  骨折愈合机制研究的历史及演进 骨组织损伤后 ,可通过再生达到组织形态和生理功能的 完全恢复。早期骨折愈合机制研究主要为细胞生物学研究。 根据细胞形态学特征 ,骨折愈合可分为血肿形成及肉芽组织 修复期、原始骨痂形成期、成熟骨板期和骨重建与塑形期 4 期。 随着分子生物学的发展 ,特别是生长因子 (growth factors , GF)及其受体的发现 ,骨折愈合机制的研究也进入分子水平。 研究表明 : 骨折发生后短期内局部组织即已释放多种 GF , 至修复后期 ,骨与软骨细胞仍产生多种 GF。这些 GF 相互作 用 ,共同促进骨折愈合。从分子水平上探讨骨折愈合的机 制 ,已成为骨折愈合现代研究的重要内容。 2  骨折愈合的现代研究及 GF在骨折愈合过程中的作用 现代研究发现 ,GF存在于体内各种组织 ,其受体多为跨 膜糖蛋白。与骨折愈合密切相关的 GF 可分为两类 ,一类为 远距离细胞产生的丝裂素类 ,其功能与细胞增殖有关 ; 另一 类为局部产生 ,主要以旁分泌或自分泌方式发挥作用 ,促使 软骨、骨原细胞分化成熟。对 GF 促进骨折愈合机制的现代 研究采用组织工程学技术结合动物实验的方法。借此 ,可观 察到各 GF在骨发生过程中的作用和相互影响。两类 GF 主 要有以下几种。 2. 1  胰岛素样生长因子 (insulin2like growth factor , IGF) : IGF 由 IGF2Ⅰ和 IGF2Ⅱ两种相关多肽组成 ,可促进软骨细胞的分 裂增殖及软骨基质的合成 ,为骨组织发生和修复所必需。软 骨细胞含有丰富的 IGF受体 ,对 IGF的促增殖作用反应敏感。 缺乏 IGF将导致严重的软骨生长紊乱。IGF2Ⅰ还可诱导成骨 细胞合成 Ⅰ型胶原 ,从而促进新骨生成。IGF2Ⅰ与 TGF2β有 协同作用。 2. 2  转化生长因子β( transforming growth factorβ, TGF2β) : TGF2β有多种异构体 ,参与骨折愈合的全过程。在骨折修复 的不同时期 ,TGF -β均有较高的表达。TGF2β还具有促血管 生长活性 ,能诱导软骨生长板内血管的形成 ,加速成骨进程。 同时 ,体外实验还表明 ,TGF2β诱导间质细胞增殖分化 ,形成 骨细胞和软骨细胞。 2. 3  血管内皮细胞生长因子 (vascular endothelium growth fac2 tor ,VEGF) : VEGF可特异性地作用于内皮细胞并促进其增 殖。骨折修复 ,特别是纤维骨痂、软骨痂形成到成熟骨痂生 成阶段 ,血管形成具有重要意义。研究发现[1 ] ,骨折后 5~7 天 ,VEGF 在骨外膜间质细胞已有表达 ,随后在软骨、成骨细 胞内也高度表达。杨述华等[2 ]证明 ,该因子作用于血管内皮 细胞 ,具有增加微静脉、小静脉通透性 ,促进血管内皮细胞分 裂、细胞钙聚集以及诱导血管生成的作用。 2. 4  成纤维细胞生长因子 (fibroblast growth factor , FGF ) : FGF对所有来源于中胚层的细胞均有促增殖作用。研究发 现 ,骨折后 1 天血肿内已有 FGF 表达。稍后 ,单核/ 巨噬细 胞、多核巨细胞等表达 FGF 并将之分布于骨膜和肉芽组织 中。FGF不但促进软骨细胞的分化、增殖与成熟 ,还促进毛 细血管生成 ,使骨折断端骨痂血管重建时间提前。 2. 5  血小板源性生长因子 (platelet2derived growth factor , PDGF) : PDGF为血清中主要有丝分裂原 ,作用于源于中胚层 ·032· 创伤外科杂志 2003 年第 5 卷第 3 期  J Trauma Surg ,2003 ,Vol. 5 ,NO. 3 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 的平滑肌细胞、成纤维细胞等。PDGF 也可由巨噬细胞及成 骨细胞系产生 ,促进骨细胞的增殖分化 ,诱导成熟的成骨细 胞合成 I型胶原 ,加快骨组织形成。 2. 6  骨形态发生蛋白 ( bone morphogenetic proteins ,BMP) : BMP是一类对骨形态发生具有决定性作用的蛋白质 ,能诱导 未分化的间充质细胞分化成骨和软骨 ,对骨原细胞的分化起 决定作用。目前已克隆到十余种 BMP 之 cDNA ,但研究较多 者还限于 BMP22、BMP24 和 BMP27 等少数几种。骨组织结构 形态完整时 ,BMP 处于休眠状态。当骨组织损伤时 ,BMP 释 放并出现活性增强。BMP主要在增生的骨膜、骨髓腔和骨折 部位的肌肉 3 种细胞内表达 ,故以骨折断端的 BMP 浓度最 高 ,更利于发挥其诱导作用。已知不同种属的BMP同源性很 高 ,因而 BMP诱导成骨无明显种属特异性 ,仅其活性存在一 定差异。研究发现 ,BMP22 与 BMP24 的结构与功能均相似 , 除促进骨折愈合外 ,在胚胎发生过程中也有重要作用。BMP2 2 和 BMP24 还有维持软骨细胞表型 ,促进前祖细胞分化为成 骨样细胞的作用。BMP26 主要在软骨组织表达 ,在体内可诱 导软骨组织生长和软骨内成骨。BMP27 可在骨、肾、肾上腺、 膀胱和脑组织中表达 ,特别在骨发育和骨愈合过程中表达升 高。BMP27 对未分化的间质细胞可诱导其分化为软骨细胞 , 对已分化的成骨细胞则使其碱性磷酸酶和骨钙素表达增加 , 增加成骨活性。 3  BMP在骨折治疗中的应用及局部基因疗法 由于 GF在骨折愈合中的作用 ,研究人员已预见到其潜 在的临床价值。特别是BMP与骨诱导关系最为密切 ,因而对 其研究也更深入。在国外 ,八十年代末已将BMP成功用于临 床骨不连的治疗[3 ] 。目前 ,国内对此已开展的研究主要有 : (1) 天然 BMP的提取、纯化及活性测定 ,动物模型的建立、诱 导成骨和骨折治疗实验[4 ,5 ] ; (2) BMP 的免疫源性研究 ,成 功筛选了 bBMP抗体杂交瘤并用单克隆抗体测定了正常体内 各组织和骨肿瘤中的 BMP 的定位分布[6 ] ; (3) 内源性 BMP 引导骨再生的研究[7 ] ; (4) 人 BMP23 基因真核表达载体的 成功构建及基因重组 BMP 的成功表达[8 ,9 ] ; 同时 ,用 BMP21 ~7cDNA 片段作探针 ,进行了相应基因在骨折等疾病中表达 规律的研究 ; (5) BMP与其它 GF协同作用研究[10 ,11 ] 。国内 工作者还针对临床上骨缺损等疾病的特点 ,研制了多种 BMP 的载体和缓释系统[12 - 14 ] ,取得了良好的效果。李亚非等[15 ] 采用经皮注射 BMP 和 FGF 及郑正庭等[16 ]注射 BMP 和自体 红骨髓修复兔骨缺损、骨不连也取得了满意的结果。这些均 表明 BMP可能成为一种生物制剂用于临床。然而 ,BMP 制 备困难、产量少 ,局部应用时代谢较快 ,与生物材料、无机或 有机材料复合后 ,材料的降解过程可能干扰局部的代谢平衡 等一系列问题又限制了其广泛应用。鉴于此 ,研究人员借鉴 现代生物工程技术 ,开展了骨折愈合的基因治疗研究。 骨折愈合机制的现代研究表明 ,骨折治疗可能是最适合 采用基因疗法的疾病之一 ,因其只需要一种或几种相关 GF 基因在骨折局部短暂表达 ,即可有效地促进骨折愈合。若使 用体内基因转移法 ,只需将携带目的基因的修饰质粒或病毒 直接注射于骨折部位。质粒载体抗原性较小、容纳外源基因 长度较大、整合和扩散危险性小。骨折治疗 ,因不需要外源 基因永久表达 ,质粒直接注入可能尤其简便易行。Fang 等[17 ]将插入 BMP24 基因的质粒与胶原复合后植入骨缺损部 位后 4 周 ,发现 BMP24 基因表达 ,新骨生成。他们还联合转 入了携带可转译甲状旁腺激素第 1~34 氨基酸之基因片段 的腺病毒载体。结果发现该激素片段与 BMP24 均可表达 ,骨 缺损修复亦较单纯应用 BMP24 基因明显加快。这表明适当 的联合基因转移在生物效应水平具有协同作用。若采用体 外基因转移法 ,需将筛选所得之体外转染阳性细胞再植回体 内进行表达。此法转移效率高 ,且不会将外源基因转入非靶 细胞 ,实践中多以修饰后的逆转录病毒或腺病毒做载体。经 改建作为载体的逆转录病毒已丧失感染能力而仅保持与细 胞表面结合的能力 ,且其只可转染处于分裂状态的靶细胞。 它一旦与细胞结合 ,即可进入细胞并将自身基因随机整合到 细胞基因组上。腺病毒载体具有颗粒稳定、感染效率高、并 可感染非分裂细胞等特点。但它不将自身基因整合到宿主 染色体上 ,因而不会引起插入突变 ,且自身基因表达短暂。 Lieberman 等[18 ]制备了携带 BMP22 基因的腺病毒载体并将之 转入骨髓基质细胞系 W220 细胞 ,结果有 BMP22 表达。将此 转染阳性细胞与脱钙骨基质复合 ,然后植入免疫缺陷鼠股四 头肌内 ,发现有丰富的异位骨生成。若将此转染阳性细胞植 入骨缺损模型 ,可使骨缺损完全修复。他们还将此腺病毒载 体转染骨髓细胞 ,然后治疗大鼠股骨缺损[19 ] ,结果此基因治 疗组 24 只大鼠与 BMP 治疗组 (植入 20μg 重组人 BMP) 16 只 大鼠股骨缺损于 8 周后放射线检查均达到愈合。Arden 等[20 ] 用表达 BMP22 的腺病毒载体转染 U87MG细胞后植入裸鼠体 内进行软骨生成诱导 ,发现 3~6 天时原始间充质细胞出现 , 9 天时分化为软骨细胞 ,12 天时分泌软骨基质 ,16 天时软骨 细胞分化为成骨细胞并开始矿化 ,21 天时可见成骨细胞和未 成熟骨髓。Breitbart 等[21 ]将携带 BMP27 基因的逆转录病毒 载体转染家兔骨膜细胞治疗家兔颅骨缺损 ,结果发现蛋白表 达 ,骨缺损修复 ,并最终达到组织结构和功能的完全恢复 ,而 对照组则未能。这些研究都表明了基因治疗与直接应用 BMP同样具有促进骨缺损修复的能力 ,且前者具有后者所不 具备的一些特点 ,因而具有较好的应用前景 ,有望成为一种 新的治疗手段。 骨折愈合是一个复杂的过程 ,其间多种 GF 以不同方式 发挥作用。特别是 BMP ,对骨折愈合的影响尤为重要。虽然 对BMP的深入研究已表明其在基因治疗中的地位 ,但要将 之付诸临床应用 ,仍需对影响外源基因载体内外表达的因 素、最适靶细胞的选择等诸多内容进一步研究。总之 ,有理 由相信 ,基因疗法用于骨折愈合因其特殊的优点 ,有良好的 应用前景。 参考文献 : [1 ] 郝永强 ,戴克戎. 骨折愈合过程中血管内皮细胞生长因子表达的 实验研究[J ] . 中华骨科杂志 ,1999 ,19 (11) :683 - 686. 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