文章编号 :1009 - 4237(2003) 03 - 0230 - 03 ·综 述·
骨折愈合的现代研究与局部基因治疗
张建军 ,李兵仓
(第三军医大学野战外科研究所六室 ,重庆 400042)
摘要 : 本文综述了近年来有关骨折愈合研究的部分文献。作者认为 ,生长因子在骨折愈合中起着重
要的作用。应用生长因子或其基因疗法有望成为一种骨折治疗的重要方法 ,特别是应用能诱导未分化间质
细胞定向分化为成骨细胞的骨形态发生蛋白的基因治疗 ,具有应用价值。
关键词 : 骨折愈合 ; 生长因子 ; 基因疗法 ; 骨形态发生蛋白
中图分类号 :R 683 - 34 文献标识码 :A
Study of fracture healing and it’s local gene therapy
ZHANG Jian2jun , LI Bing2cang
(Research Institute of Surgery ,Third Military Medical University ,Chongqing 400042 ,China)
Abstract : To review the study on fracture healing ,and suggest that growth factors may play important roles in frac2
ture healing. Growth factor corresponding gene therapy may become a potential method in fracture healing , especially using
the gene of bone morphogenetic protein which expresses the growth factor and induces the differentiation of progenitor cells
into osteoblast efficaciously.
Key words : fracture healing ; growth factor ; gene therapy ; bone morphogenetic protein
收稿日期 :2001 - 11 - 08 ;修回日期 :2002 - 08 - 27
骨折属平、战时最常见外科损伤之一。平时源于交通事
故的骨折及战时骨折多发而严重 ,致使后期治疗难度增加。
因而 ,骨折救治依然是创伤研究的重要课题之一。提高对骨
折愈合机制的认识仍具重要意义。
1 骨折愈合机制研究的历史及演进
骨组织损伤后 ,可通过再生达到组织形态和生理功能的
完全恢复。早期骨折愈合机制研究主要为细胞生物学研究。
根据细胞形态学特征 ,骨折愈合可分为血肿形成及肉芽组织
修复期、原始骨痂形成期、成熟骨板期和骨重建与塑形期 4
期。
随着分子生物学的发展 ,特别是生长因子 (growth factors ,
GF)及其受体的发现 ,骨折愈合机制的研究也进入分子水平。
研究表明 : 骨折发生后短期内局部组织即已释放多种 GF ,
至修复后期 ,骨与软骨细胞仍产生多种 GF。这些 GF 相互作
用 ,共同促进骨折愈合。从分子水平上探讨骨折愈合的机
制 ,已成为骨折愈合现代研究的重要内容。
2 骨折愈合的现代研究及 GF在骨折愈合过程中的作用
现代研究发现 ,GF存在于体内各种组织 ,其受体多为跨
膜糖蛋白。与骨折愈合密切相关的 GF 可分为两类 ,一类为
远距离细胞产生的丝裂素类 ,其功能与细胞增殖有关 ; 另一
类为局部产生 ,主要以旁分泌或自分泌方式发挥作用 ,促使
软骨、骨原细胞分化成熟。对 GF 促进骨折愈合机制的现代
研究采用组织工程学技术结合动物实验的方法。借此 ,可观
察到各 GF在骨发生过程中的作用和相互影响。两类 GF 主
要有以下几种。
2. 1 胰岛素样生长因子 (insulin2like growth factor , IGF) : IGF
由 IGF2Ⅰ和 IGF2Ⅱ两种相关多肽组成 ,可促进软骨细胞的分
裂增殖及软骨基质的合成 ,为骨组织发生和修复所必需。软
骨细胞含有丰富的 IGF受体 ,对 IGF的促增殖作用反应敏感。
缺乏 IGF将导致严重的软骨生长紊乱。IGF2Ⅰ还可诱导成骨
细胞合成 Ⅰ型胶原 ,从而促进新骨生成。IGF2Ⅰ与 TGF2β有
协同作用。
2. 2 转化生长因子β( transforming growth factorβ, TGF2β) :
TGF2β有多种异构体 ,参与骨折愈合的全过程。在骨折修复
的不同时期 ,TGF -β均有较高的表达。TGF2β还具有促血管
生长活性 ,能诱导软骨生长板内血管的形成 ,加速成骨进程。
同时 ,体外实验还表明 ,TGF2β诱导间质细胞增殖分化 ,形成
骨细胞和软骨细胞。
2. 3 血管内皮细胞生长因子 (vascular endothelium growth fac2
tor ,VEGF) : VEGF可特异性地作用于内皮细胞并促进其增
殖。骨折修复 ,特别是纤维骨痂、软骨痂形成到成熟骨痂生
成阶段 ,血管形成具有重要意义。研究发现[1 ] ,骨折后 5~7
天 ,VEGF 在骨外膜间质细胞已有表达 ,随后在软骨、成骨细
胞内也高度表达。杨述华等[2 ]证明 ,该因子作用于血管内皮
细胞 ,具有增加微静脉、小静脉通透性 ,促进血管内皮细胞分
裂、细胞钙聚集以及诱导血管生成的作用。
2. 4 成纤维细胞生长因子 (fibroblast growth factor , FGF ) :
FGF对所有来源于中胚层的细胞均有促增殖作用。研究发
现 ,骨折后 1 天血肿内已有 FGF 表达。稍后 ,单核/ 巨噬细
胞、多核巨细胞等表达 FGF 并将之分布于骨膜和肉芽组织
中。FGF不但促进软骨细胞的分化、增殖与成熟 ,还促进毛
细血管生成 ,使骨折断端骨痂血管重建时间提前。
2. 5 血小板源性生长因子 (platelet2derived growth factor ,
PDGF) : PDGF为血清中主要有丝分裂原 ,作用于源于中胚层
·032· 创伤外科杂志 2003 年第 5 卷第 3 期 J Trauma Surg ,2003 ,Vol. 5 ,NO. 3
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
的平滑肌细胞、成纤维细胞等。PDGF 也可由巨噬细胞及成
骨细胞系产生 ,促进骨细胞的增殖分化 ,诱导成熟的成骨细
胞合成 I型胶原 ,加快骨组织形成。
2. 6 骨形态发生蛋白 ( bone morphogenetic proteins ,BMP) :
BMP是一类对骨形态发生具有决定性作用的蛋白质 ,能诱导
未分化的间充质细胞分化成骨和软骨 ,对骨原细胞的分化起
决定作用。目前已克隆到十余种 BMP 之 cDNA ,但研究较多
者还限于 BMP22、BMP24 和 BMP27 等少数几种。骨组织结构
形态完整时 ,BMP 处于休眠状态。当骨组织损伤时 ,BMP 释
放并出现活性增强。BMP主要在增生的骨膜、骨髓腔和骨折
部位的肌肉 3 种细胞内表达 ,故以骨折断端的 BMP 浓度最
高 ,更利于发挥其诱导作用。已知不同种属的BMP同源性很
高 ,因而 BMP诱导成骨无明显种属特异性 ,仅其活性存在一
定差异。研究发现 ,BMP22 与 BMP24 的结构与功能均相似 ,
除促进骨折愈合外 ,在胚胎发生过程中也有重要作用。BMP2
2 和 BMP24 还有维持软骨细胞表型 ,促进前祖细胞分化为成
骨样细胞的作用。BMP26 主要在软骨组织表达 ,在体内可诱
导软骨组织生长和软骨内成骨。BMP27 可在骨、肾、肾上腺、
膀胱和脑组织中表达 ,特别在骨发育和骨愈合过程中表达升
高。BMP27 对未分化的间质细胞可诱导其分化为软骨细胞 ,
对已分化的成骨细胞则使其碱性磷酸酶和骨钙素表达增加 ,
增加成骨活性。
3 BMP在骨折治疗中的应用及局部基因疗法
由于 GF在骨折愈合中的作用 ,研究人员已预见到其潜
在的临床价值。特别是BMP与骨诱导关系最为密切 ,因而对
其研究也更深入。在国外 ,八十年代末已将BMP成功用于临
床骨不连的治疗[3 ] 。目前 ,国内对此已开展的研究主要有 :
(1) 天然 BMP的提取、纯化及活性测定 ,动物模型的建立、诱
导成骨和骨折治疗实验[4 ,5 ] ; (2) BMP 的免疫源性研究 ,成
功筛选了 bBMP抗体杂交瘤并用单克隆抗体测定了正常体内
各组织和骨肿瘤中的 BMP 的定位分布[6 ] ; (3) 内源性 BMP
引导骨再生的研究[7 ] ; (4) 人 BMP23 基因真核表达载体的
成功构建及基因重组 BMP 的成功表达[8 ,9 ] ; 同时 ,用 BMP21
~7cDNA 片段作探针 ,进行了相应基因在骨折等疾病中表达
规律的研究 ; (5) BMP与其它 GF协同作用研究[10 ,11 ] 。国内
工作者还针对临床上骨缺损等疾病的特点 ,研制了多种 BMP
的载体和缓释系统[12 - 14 ] ,取得了良好的效果。李亚非等[15 ]
采用经皮注射 BMP 和 FGF 及郑正庭等[16 ]注射 BMP 和自体
红骨髓修复兔骨缺损、骨不连也取得了满意的结果。这些均
表明 BMP可能成为一种生物制剂用于临床。然而 ,BMP 制
备困难、产量少 ,局部应用时代谢较快 ,与生物材料、无机或
有机材料复合后 ,材料的降解过程可能干扰局部的代谢平衡
等一系列问题又限制了其广泛应用。鉴于此 ,研究人员借鉴
现代生物工程技术 ,开展了骨折愈合的基因治疗研究。
骨折愈合机制的现代研究表明 ,骨折治疗可能是最适合
采用基因疗法的疾病之一 ,因其只需要一种或几种相关 GF
基因在骨折局部短暂表达 ,即可有效地促进骨折愈合。若使
用体内基因转移法 ,只需将携带目的基因的修饰质粒或病毒
直接注射于骨折部位。质粒载体抗原性较小、容纳外源基因
长度较大、整合和扩散危险性小。骨折治疗 ,因不需要外源
基因永久表达 ,质粒直接注入可能尤其简便易行。Fang
等[17 ]将插入 BMP24 基因的质粒与胶原复合后植入骨缺损部
位后 4 周 ,发现 BMP24 基因表达 ,新骨生成。他们还联合转
入了携带可转译甲状旁腺激素第 1~34 氨基酸之基因片段
的腺病毒载体。结果发现该激素片段与 BMP24 均可表达 ,骨
缺损修复亦较单纯应用 BMP24 基因明显加快。这表明适当
的联合基因转移在生物效应水平具有协同作用。若采用体
外基因转移法 ,需将筛选所得之体外转染阳性细胞再植回体
内进行表达。此法转移效率高 ,且不会将外源基因转入非靶
细胞 ,实践中多以修饰后的逆转录病毒或腺病毒做载体。经
改建作为载体的逆转录病毒已丧失感染能力而仅保持与细
胞表面结合的能力 ,且其只可转染处于分裂状态的靶细胞。
它一旦与细胞结合 ,即可进入细胞并将自身基因随机整合到
细胞基因组上。腺病毒载体具有颗粒稳定、感染效率高、并
可感染非分裂细胞等特点。但它不将自身基因整合到宿主
染色体上 ,因而不会引起插入突变 ,且自身基因表达短暂。
Lieberman 等[18 ]制备了携带 BMP22 基因的腺病毒载体并将之
转入骨髓基质细胞系 W220 细胞 ,结果有 BMP22 表达。将此
转染阳性细胞与脱钙骨基质复合 ,然后植入免疫缺陷鼠股四
头肌内 ,发现有丰富的异位骨生成。若将此转染阳性细胞植
入骨缺损模型 ,可使骨缺损完全修复。他们还将此腺病毒载
体转染骨髓细胞 ,然后治疗大鼠股骨缺损[19 ] ,结果此基因治
疗组 24 只大鼠与 BMP 治疗组 (植入 20μg 重组人 BMP) 16 只
大鼠股骨缺损于 8 周后放射线检查均达到愈合。Arden 等[20 ]
用表达 BMP22 的腺病毒载体转染 U87MG细胞后植入裸鼠体
内进行软骨生成诱导 ,发现 3~6 天时原始间充质细胞出现 ,
9 天时分化为软骨细胞 ,12 天时分泌软骨基质 ,16 天时软骨
细胞分化为成骨细胞并开始矿化 ,21 天时可见成骨细胞和未
成熟骨髓。Breitbart 等[21 ]将携带 BMP27 基因的逆转录病毒
载体转染家兔骨膜细胞治疗家兔颅骨缺损 ,结果发现蛋白表
达 ,骨缺损修复 ,并最终达到组织结构和功能的完全恢复 ,而
对照组则未能。这些研究都表明了基因治疗与直接应用
BMP同样具有促进骨缺损修复的能力 ,且前者具有后者所不
具备的一些特点 ,因而具有较好的应用前景 ,有望成为一种
新的治疗手段。
骨折愈合是一个复杂的过程 ,其间多种 GF 以不同方式
发挥作用。特别是 BMP ,对骨折愈合的影响尤为重要。虽然
对BMP的深入研究已表明其在基因治疗中的地位 ,但要将
之付诸临床应用 ,仍需对影响外源基因载体内外表达的因
素、最适靶细胞的选择等诸多内容进一步研究。总之 ,有理
由相信 ,基因疗法用于骨折愈合因其特殊的优点 ,有良好的
应用前景。
参考文献 :
[1 ] 郝永强 ,戴克戎. 骨折愈合过程中血管内皮细胞生长因子表达的
实验研究[J ] . 中华骨科杂志 ,1999 ,19 (11) :683 - 686.
[2 ] 杨述华 ,杨操 ,许伟长 ,等. 人血管内皮细胞生长因子的 cDNA 克
隆及其在兔成骨细胞中的表达 [J ] . 中华骨科杂志 ,2000 ,20 (2) :
99 - 102.
[3 ] Johnson EE ,Urist MR , Geralda A ,et al . Repair of segmental defects of
the tibia with cancellous bone graphs augmented with human bone mor2
·132·创伤外科杂志 2003 年第 5 卷第 3 期 J Trauma Surg ,2003 ,Vol. 5 ,NO. 3
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
phogenetic protein[J ] . Clin Orthop ,1988 ,236 :249 - 257.
[4 ] 李亚非 ,胡蕴玉 ,李雪冰 ,等.骨粒粒度与强化搅拌对骨形态发生蛋
白提取量和活性的影响[J ] .中华骨科杂志 ,1996 ,16 (2) :118 - 120.
[5 ] 刘莉 ,赵明 ,王会信 ,等. 重组人骨形态发生蛋白22 诱导成骨作用
的实验研究[J ] . 中华骨科杂志 ,1995 ,15 (8) :519 - 522.
[6 ] 马真胜 ,胡蕴玉 ,王臻 ,等.骨形态发生蛋白 4(BMP4) 基因表达在骨
折愈合过程中的定位研究[J ].中华骨科杂志 ,1997 ,17(8) :517 - 519.
[7 ] 张子军 ,卢世璧 ,王继芳 ,等. 引导性骨再生中内源性BMP 的作用
[J ] . 中华骨科杂志 ,1996 ,16 (11) :719 - 723.
[8 ] 司晓辉 ,杨连甲 ,金岩. 稳定表达人骨形成蛋白 2 成纤维细胞的
建立与鉴定[J ] . 第四军医大学学报 ,1999 ,20 (2) :127 - 129.
[9 ] 韩一生 ,惠宏襄 ,崔大详 ,等. 人骨形态发生蛋白的23 基因真核表
达载体 (PcDNA32hBMP3) 构建 [J ] . 第四军医大学学报 ,1999 ,20
(4) :313 - 314.
[10 ] 杜俊杰 ,胡蕴玉 ,罗卓荆 ,等. 人重组骨形态发生蛋白22 和β转
化生长因子在诱导成骨中的协同作用[J ] . 第四军医大学学报 ,
1999 ,20 (7) :555 - 558.
[11 ] 李亚非 ,胡蕴玉 ,吕荣 ,等. 成纤维细胞生长因子增强骨形态发
生蛋白在小鼠体内骨诱导作用 [J ] . 中华骨科杂志 , 1995 , 15
(12) :837 - 838.
[12 ] 陈克明 ,李旭生 ,刘兴炎 ,等.骨形态发生蛋白复合纤维蛋白载体
修复骨缺损的实验研究[J ] .中华骨科杂志 ,1998 ,18(2) :68 - 70.
[13 ] 罗卓荆 ,胡蕴玉 ,王茜. 去抗原牛松质骨块/ bBMP 符合材料修复
兔长骨骨缺损[J ] . 第四军医大学学报 ,2000 ,21 (1) :48 - 51.
[14 ] 孙明学 ,马贵骧. BMP/ DBM修复关节软骨缺损的实验研究[J ] .
中华骨科杂志 ,1996 ,16 (9) :578 - 580.
[15 ] 李亚非 ,胡蕴玉 ,李青 ,等. 经皮注射骨形态发生蛋白和成纤维
细胞生长因子促进兔骨缺损愈合 [J ] . 中华骨科杂志 ,1995 ,15
(9) :624 - 627.
[16 ] 郑正庭 ,马平 ,吕荣 ,等. 经皮注射骨形态发生蛋白和自体红骨
髓修复兔骨缺损和骨不连[J ] . 第四军医大学学报 ,1999 ,20 (8) :
726 - 729.
[17 ] Fang J ,Zhu Y,Smiley E ,et al . Stimulation of new bone formation by di2
rect transfer of osteogenetic plasmid genes[J ] . Proc Natl Acad Sci USA ,
1996 ,93 :5753 - 5758.
[18 ] Lieberman JR ,Le LQ ,Wu L ,et al . Regional gene therapy with a BMP2
22producing murine stromal cell line induces heterotopic and orthotopic
bone formation in rodents[J ] . J Orthop Res ,1998 ,16 (3) ,330 - 339.
[19 ] Lieberman JR ,Daluiski A ,Steven S ,et al . The effect of regional gene
therapy with bone morphogenetic proteins222producing bone2marrow
cells on the repair of segmental femoral defects in rats[J ] . J Bone Joint
Surg(Am) ,1999 ,81 (7) :905 - 917.
[20 ] Arden TD ,Pittman DD ,Hankins GRJ ,et al . In vivo endrochondral bone
formation using a bone morphogenetic protein 2 adenoviral vector [J ] .
Hum Gene Ther ,1999 ,10 :2245 - 2253.
[21 ] Breitbart AS , Grande DA , Mason JM , et al . Gene2enhanced tissue en2
gineering : applications for bone healing using cultured periosteal cells
transduced retrovirally with the BMP27 gene[J ] . Ann Plast Surg ,1999 ,
42(5) :488 - 495.
(本文编辑 :贺 羽)
(上接第 234 页)
[6 ] Ignatius AA ,Betz O ,Augat P ,et al . In vivo investigations on composites
made of resorbable ceramics and poly(lactide) used as bone graft substi2
tutes[J ] . J Biomed Mater Res ,2001 ,58(6) :701 - 709.
[7 ] 段宏 ,宋跃明 ,熊敏. 国产聚乳酸2DL2乳酸螺钉力学和生物降解
吸收的实验研究[J ] . 中华创伤杂志 ,2000 ,16 (6) :350 - 352.
[8 ] Robinson BP , Hollinger JO ,Szachowicz EH ,et al . Calvarial bone repair
with porous D.L2Polylactide[J ] . Otalaryngol Head Neck Surg ,1995 ,112
(6) :707 - 713.
[9 ] 曹谊林 ,商庆新. 软骨、骨组织工程的现状与趋势 [J ] . 中华创伤
杂志 ,2001 ,17 (1) :7 - 9.
[10 ] Quirk RA ,Chan WC ,Davies MC ,et al . Poly (L2lysine)2GRGDS as a
biomimetic surface modifier for poly ( lactic acid) [ J ] . Biomaterials ,
2001 ,22 (8) :865 - 872.
[11 ] Ishang2Riley SL ,Grane2Kruger GM ,Yaszemsky MJ ,et al . Three2dimen2
sional culture of rat calvarial osteoblast in porous biodegradable poly2
mers[J ] . Biomaterials ,1998 ,19 (15) :1405 - 1412.
[ 12 ] Widmer MS ,Gupta PK,Lu L ,et al . Manufacture of porous biodegradable
polymer conduits by an extrusion process for guided tissue regeneration
[J ] . Biomaterials ,1998 ,19 (21) :1945 - 1955.
[13 ] 王常勇 ,王勤 ,毛天球 ,等. 生物降解聚合物2聚乳酸泡沫材料
(D ,L2PLA)的研制及物理机械性能检测 [J ] . 生物医学工程学杂
志 ,2000 ,17 (4) :396 - 399.
[14 ] Attawia MA ,Herbert KM ,Laurencin CT. Osteoblast2like cell adherence
and migration through 4 dimensional porous polymer matrices [ J ] .
Biochem Biophyes Commun ,1995 ,213(2) :639 - 644.
[ 15 ] Stal S ,Tjelmeland K,Hick J ,et al . Compartmentalized bone regeneration
of cranial defects with biodegradable barriers : an animal model [J ] . J
Craniofac Surg ,2001 ,12 (1) :41 - 47.
[16 ] Stoller NH ,Johnson LR , Garrett S ,et al . Periodontal regeneration of a
class Ⅱfurcation defect utilizing a bioabsorbable barrier in a human :a
case study with histology[J ] . J Periodontol ,2001 ,72 (2) :238 - 242.
[17 ] 于雷 ,靳安民. 聚乳酸膜管在引导性骨再生中的实验观察 [J ] .
骨与关节损伤杂志 ,2000 ,15 (5) :361 - 363.
[18 ] Miki T ,Imai Y. Osteoinductive potential of freeze2dried ,biodegradable ,
poly (glycolic acid2co2lactic acid) disks incorporated with bone mor2
phogenetic protein in skull defects of rats [ J ] . Int J Oral Maxillofac
Surg ,1996 ,25 (5) :402 - 406.
[19 ] Miki T ,Masaka K, Imai Y,et al . Experience with freeze2dried PGLA/
HA/ rhBMP22 as a bone graft substitute [J ] . J Craniomaxillofac Surg ,
2000 ,28 (5) :294 - 299.
[20 ] Heckman JD , Ehler W ,Brooks BP ,et al . Bone morphogenetic protein
but not transforming growth factor2beta enhances bone formation in ca2
nine diaphyseal nonunions implanted with a biodegradable composite
polymer[J ] . J Bone Joint Surg(Am) ,1999 ,81 (12) :1717 - 1729.
[21 ] 谭祖键 ,李起鸿 ,许建中 ,等.聚乳酸作为骨形态发生蛋白载体修
复骨缺损的实验研究[J ] .中华骨科杂志 ,2000 ,20(12) :742 - 746.
[22 ] 张亮 ,靳安民 ,郭志民 ,等. 三维多孔骨修复材料 DL2PLA 及β2
TCP/ DL2PLA 的体外降解研究 [J ] . 骨与关节损伤杂志 ,2001 ,16
(3) :184 - 186.
[23 ] 裴国献 ,陈滨. 医学临床对组织工程学的
[J ] . 中华创伤杂
志 ,2001 ,17 (7) :289 - 391.
(本文编辑 :郭 卫)
·232· 创伤外科杂志 2003 年第 5 卷第 3 期 J Trauma Surg ,2003 ,Vol. 5 ,NO. 3
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net