06盐酸克伦特罗残留

null第六章 盐酸克伦特罗（clenbuterol，CLB） 及其残留量的检测第六章 盐酸克伦特罗（clenbuterol，CLB） 及其残留量的检测瘦肉精瘦肉精莱克多巴胺（Ractopamine，又名雷托巴胺，培林） 盐酸克仑特罗（clenbuterol） 硫酸沙丁胺醇（Salbutamol） 硫酸特布他林Terbutaline) 西巴特罗 盐酸多巴胺 指能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的一类药物添加剂。 因有毒性极低、代谢快速、无累积性等特点被美国等24个国家允许添加入猪饲料，日本也允许使用培林的猪肉进口，但包括中国和欧盟在内的160多个国家禁用。一、 概 述一、 概 述化学结构： 化学名：羟甲叔丁肾上腺素，α-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐 中文名：瘦肉精；克伦特罗；盐酸克伦特罗；盐酸双氯醇胺；克喘素；氨哮素；氨必妥；氨双氯喘通；氨双氯醇胺 分子式：C12H18C12N20-HCl 相对分子质量：313.65 结构式： 2、理化性质2、理化性质白色或类似白色结晶粉末，无臭，味微苦，易溶于水、甲醇、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚，熔点161 ℃； 化学性质稳定，172℃ 开始分解，经260℃ 油煎5min才会破坏减半。3、药理作用是β2肾上腺素受体激动剂，有使支气管平滑肌舒张的作用，用于治疗支气管哮喘和痉挛，改善通气。 大剂量CLB （药用量10倍以上）可显著抑制糖原合成酶并激活磷酸化酶和脂酶的活性，从而加速脂肪和糖原的分解和转化，促进蛋白质合成，增加瘦肉率。4、代谢4、代谢吸收迅速、在体内残留时间长； 服药后10~20min起效，2~3h在血液浓度达最大峰值并维持5h左右，半衰期25~39h，消除5个半衰期（约97%）需5-8d。易在眼、毛发、内脏（尤其肝、肺、肾）中蓄积。造成肝、肾及神经系统损害。5、中毒表现5、中毒表现骨骼肌兴奋：面颈、四肢肌肉颤动，手抖甚至不能站立，乏力 心肌兴奋：心悸，心动过速，室性早搏，心电图示S-T段压低与T波倒置，血压升高 平滑肌兴奋：呕吐和腹泻 神经系统兴奋：头疼头晕 脂肪分解：血液游离酸↑,血管壁弹性↓,血压↑有高血压、冠心病、甲亢、心律失常者、应用拟交感神经药者或对前药过敏者，反应更强烈。 与糖皮质激素合用可引起低血钾，加剧心律失常 反复使用会产生耐受性6、CLB残留危害事件不断发生6、CLB残留危害事件不断发生CLB残留引起中毒事件最早发生在西班牙，89年10月至90年7月间135人中毒，43个家庭中91% 成员受到影响；92年该国北部地区又暴发232例中毒病例。 1990年秋季法国有8个家庭22人发生CLB中毒 1998年5月香港有17人发生CLB中毒，2000年10月9日又有57人中毒。 1999年10月6日，浙江嘉兴市有57人中毒。 2000年4月14日广东博罗县龙华镇30人中毒，01年11月7日河源县发生747人大规模CLB中毒的事件来自“广州日报” 的报道来自“广州日报” 的报道2006年06月06，佛山市一家旅馆的员工纷纷感觉身体不适前往佛山市第一人民医院治疗。据医院急诊科的医生介绍，经过诊断，这些员工很可能食用了含瘦肉精的肉制品而导致食物中毒。 2006年8月14日惠城区河南岸一间小五金厂5名工人，因吃了瘦肉精超标1000倍的猪肝而引起中毒。2009年广州“瘦肉精”中毒事件 2009年广州“瘦肉精”中毒事件 2009年2月18~20日广州又出现因食用含 “瘦肉精”猪肉导致70人中毒的事件，问题生猪由生猪个体经营者分别收购自湖南省冷水江市、涟源市、新化县、衡阳县几个地区，通过天河牲畜批发市场进入广州天河、增城的肉菜市场进行售卖。公安机关对涉案的6名生猪经营者进行传讯，对涉嫌生产、销售不符合卫生食品的3名嫌疑人呈批刑事拘留，并对其他涉案人员进行追踪调查。 “瘦肉精”喂出“健美猪” “瘦肉精”喂出“健美猪” 央视“每周质量”2011年3·15特别节目《“健美猪”真相》报道河南孟州等地养猪场用 “瘦肉精”养猪，有毒猪肉流向了双汇。7、预防方法7、预防方法控制源头，加强法规的宣传，禁止在饲料中掺入瘦肉精。 加强对上市猪肉的检验。 消费者购买猪肉时要拣带些肥膘(1~2cm)的肉，颜色不要太鲜红，猪内脏因瘦肉精残留量多不宜食用。 二、CLB的检验与监测二、CLB的检验与监测㈠、检验、检疫现状 欧共体1988年1月1日开始禁止其作为兽用饲料添加剂，美国也作了相同的规定。目前CLB是欧盟成员国肉品进口必检项目 我国农业部1997年3月下文[农牧发(1997)3号]严禁β-肾上腺素激素在饲料和畜牧生产中使用 国际奥委会将CLB列为兴奋剂名单㈡、最高残留量㈡、最高残留量FDA/WHO规定： 肉0.2，肝、肾0.6，脂肪0.2，奶0.05 我国农业部的规定： 马、牛肌肉0.1，肝、肾0.5，牛奶0.05单位：μg/kg㈢、CLB的检验、检测方法㈢、CLB的检验、检测方法感官识别法： 健康肉淡红色，肉质弹性好，无“出汗” “问题肉”特别鲜红，脂肪非常薄，瘦肉纤维疏松，有“出汗”现象2、仪器法检测法2、仪器法检测法农业部2001年颁布的强制性行业标准——《饲料中盐酸克伦特罗测定》(Ny438-2001)指定的仪器检测方法有： 高效液相色谱法（HPLC）：最低检测限范围为1~15ng/g，半确证法 气相色谱-质谱联用法（GC-MS）：检测限度可达0.5ng/ml(猪尿)，可同时定性、定量，确证性方法仪器法是利用仪器设备对瘦肉精进行定量定性检测，是比较传统的办法，具有检测准确，精度高的特点，日前仍作为仲裁和确认的方法。但需要昂贵的仪器设备作为基本条件，而且操作繁杂、耗时较长，检测成本高，仅限于少数的大型检测机构使用。质谱分析技术的基本原理质谱分析技术的基本原理质谱分析法（Mass Spectrometry，MS）：物质分子的质量谱，是分离和测定分子的质量、强度信息的一种物理方法，并由此表示物质的成分与结构。 质谱分析法的基本原理是：首先将样品中的分子电离，不同质量离子在电场或磁场中，将按其质量和所带的电荷比（质荷比，m/z）进行分离和排序，根据m/z的大小和相对强度形成有规则的质谱，从而对物质进行结构鉴定和定量分析GS—MS法 测定动物性食品中的克伦特罗残留（GB/T5009.192——2003）GS—MS法 测定动物性食品中的克伦特罗残留（GB/T5009.192——2003）详见教材63~65页3、酶联免疫吸附测定（ELISA）法3、酶联免疫吸附测定（ELISA）法特异性强、灵敏度高、酶标板上一次可作多份样品检测，可对CLB进行定性、定量测定，与传统的仪器检测法相比，只需要简单的仪器设备，检测时间大大缩短，目前是生产中快速初筛的主要方法。 （enzyme linked immunosorbent assay）是应用最广泛的免疫检测技术⑴、几个概念⑴、几个概念免疫反应：机体识别和排除进入体内的抗原异物，以维持机体的生理平衡和稳定的保护性反应。两类免疫反应： 非特异性免疫 特异性免疫个体出生时就具有的一系列防卫功能，受遗传因素控制，对入侵抗原的清除没有特异选择性，反应快，反应效应相对稳定。个体在生活过程中，接触抗原物质后诱导产生特异性抗体，从而触发针对该抗原的特异性免疫反应。抗原（Antigen，Ag）抗原（Antigen，Ag）能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞并 能与之结合引起特异性免疫反应的物质完全抗原：既具有免疫原性又具有反应原性的物质。如蛋白质（细菌、病毒、动物血清等）。 半抗原：只有反应原性，缺乏免疫原性的物质，如大多数农药、兽药。半抗原与蛋白质等大分子结合后，可具有免疫原性，即半抗原+载体＝完全抗原免疫原性反应原性抗体（Antibody，Ab）抗体（Antibody，Ab）机体在抗原刺激下形成的一类可与抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白（immunoglobulin）天然抗体：天然存在于各种动物血清中的抗体，有凝集和溶解异种动物红细胞的效应 免疫抗体：机体受抗原刺激或接受接种而产生的抗体酶联结合物酶联结合物用酶标记的抗体(或抗原)酶联结合物既要有酶的催化活性，又要保持抗体(或抗原)的免疫活性，同时还要具备一定的稳定性。⑵、ELISA法的原理⑵、ELISA法的原理用酶标记已知抗体(或抗原)，然后与样品在一定条件下反应，如果样品中含有相应的抗原(或抗体)，就会发生特异性免疫反应，生成酶标记的免疫复合物，吸附在固相载体上，不会被缓冲液冲掉。当加入酶的底物时，酶与底物发生反应生成有色产物，颜色的深浅与样品中抗原(或抗体)的量成正比，可用肉眼或借助仪器进行定性定量分析。＋样品 (吸附在固相载体上)已知酶联结合物吸附在固相载体上的酶联免疫复合物酶底物有色产物比色定性定量不会被缓冲液冲掉ELISA法必要的三种物质ELISA法必要的三种物质固相载体：用于吸附Ag(或Ab) 已知的酶标Ab (或Ag) 酶作用的底物⑶、ELISA的应用方法⑶、ELISA的应用方法直接法(测定抗原) 将待测抗原吸附在载体表面，形成固相抗原 加酶标抗体，形成固相抗原—酶标抗体复合物 加底物显色。底物的降解量＝抗原量包被null间接法(测定抗体) 将抗原吸附于固相载体表面形成固相抗原 加待测抗体, 形成固相抗原—抗体复合物 加酶标二抗，形成固相抗原—抗体—抗抗体 洗涤，加底物，测定底物的降解量＝抗体量SubstrateDifferent antigens in samplenull双抗体夹心法(测定抗原) 将已知抗体吸附于固相表面，形成固相抗体; 加待测抗原，形成固相抗体—抗原复合物 加酶标抗体，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物 洗涤，加底物，底物的降解量＝抗原量null竞争法(测定抗原) 将抗体吸附在对照孔和样品孔固相载体表面 对照孔：加酶标抗原 样品孔：加酶标抗原和待测样品，如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会竞争性与固相抗体结合，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。洗涤，加底物显色。样品孔颜色越淡，表示样品中抗原含量越多。对照孔颜色深度与样品孔颜色深度之差，代表受检样品含抗原的量。本法也可用于测定抗体⑷、CLB残留的快速ELISA检测⑷、CLB残留的快速ELISA检测采用ELISA抗原竞争法测定CLB，将固相载体上已包被抗体（羊抗兔IgG抗体）与特异性的抗CLB抗体结合，然后加入待测CLB以及酶偶联CLB，它们竞争与CLB抗体结合；洗涤没有结合的酶标记物，加入底物显色，根据有色物的变化量判断CLB的含量。显色为蓝色，加入反应停止液后转为黄色 若待测的CLB多，则与抗体结合的酶联CLB少，有色物的量就少，吸光强度与CLB浓度直接相关 ①、 原 理null阳性 (positive)NO COLORnull阴性 (negative)null阴性 (negative)加反应停止液后②、试剂②、试剂高氯酸 (0.1mol/L) 异丙醇+乙酸乙脂(40+60) 氢氧化钠 (1mol/L) 磷酸二氢钠缓冲液(PBS，0.1mol/L，pH=6.0) 克伦特罗酶联免疫试剂盒 96孔板(12条×8孔)包被有针对克伦特罗IgG的包被抗体 过氧化物酶标记物（浓缩液） 克伦特罗抗体（浓缩液） 酶底物和显色剂：过氧化氢(或过氧化尿素) + 四甲基联苯胺(TMB) 反应停止液：1mol/L硫酸 稀释用缓冲液：PBS③、仪器③、仪器超声波清洗器 具塞磨口玻璃离心管：11.5 cm(长)×3.5 cm(内径) 离心机（5000r/min） 振荡器 旋转蒸发器 涡漩式混合器 匀浆器 酶标仪（配450nm滤光片） 针筒式微孔过滤膜(0.45μm，水相) 微量移液器：单道20μl、50μl、100μl和多道50~250μl④、试样测定步骤④、试样测定步骤样品提取 试剂和试样的准备 ELISA法测定 加样→温育→洗涤→显色→比色 结果计算，定量样品提取的主要环节样品提取的主要环节样品中加入高氯酸溶液，用超声波加热提取 用异丙醇—乙酸乙酯（40：60）萃取 取有机相浓缩样品提取的步骤样品提取的步骤肌肉、肝脏、肾试样10g20ml 0.1mol/L高氯酸溶液+匀浆，置于磨口玻璃离心管中，超声波清洗器中超声20min80℃水浴加热30min，冷却后离心15min(4500r/min)沉淀用5ml 0.1mol/L高氯酸溶液洗涤，再离心置于磨口玻璃离心管中，用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至9.5±0.1（若有沉淀，再离心10min）+氯化钠8g+25ml异丙醇+乙酸乙脂(40+60)振荡器振荡20min，放置5min吸 取 上 层 有 机 相下层用20ml异丙醇+乙酸乙脂(40+60)再萃取1次转移至5ml玻璃离心管中，用0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0)定容至刻度经针筒式微孔滤膜过滤，洗涤3次于60 ℃旋转蒸发器上浓缩近干，用1ml 0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0)充分溶解残留物取 上 清 液②、试剂、试样的准备②、试剂、试样的准备稀释酶标记物和CLB抗体 试验用试剂应提前1~2h从冰箱中取出，待温度与室温平衡后使用，试剂完毕后不需用的部分应及时放回冰箱保存 稀释前要仔细振摇，用缓冲液以1：10的比例稀释 因稀释后的酶标记物和抗体稳定性变差，仅按实际需要量稀释 微孔板按实际需要取用，剩下的于干燥剂一起重新密封保存于2~8℃。 试样准备：取提取物20μl进行分析，高残留试样用蒸馏水进一步稀释。③、测定③、测定倾空微孔板, 用250ul冲洗液重复洗板2遍以上加100ul稀释后的克伦特罗抗体溶液到每个孔中，充分混合并在室温孵育15min加20ul标准溶液或处理好的待测试样倾空微孔板, 用250ul缓冲洗液重复洗板2遍以上加酶底物(H2O2 和TMB各50ul)，充分混合并室温孵育15min加100ul反应停止液，混合后尽快在450nm波长处测量吸光度室温20-25℃避光孵育30min+100ul稀释的酶联标记物④、结果计算，定量④、结果计算，定量绘制标准曲线 测定6个梯度的克伦特罗标准溶液（0、100、300、900、2700、8100 ng／L）吸光度值（A）。以0浓度A0值为分母，其他标准浓度的A值为分子，再乘以100，得出相对吸光度。以相对吸光度为纵坐标，对应的5个CLB标准浓度为横坐标，在半对数坐标上绘制标准曲线（该定标模型在200～2000ng／kg范围内是线性的）。相对吸光度值（%）= A / A0×100nullnull计算试样中CLB含量：X——试样中CLB含量，μg/kg或μg/L A——试样相对吸光度值(%) 对应的CLB含量，ng/L F——试样稀释倍数 M——试样的取样量