杂交瘤技术1

null （一）细胞的融合（一）细胞的融合 是指两个或两个以上细胞合并形成一个细胞的现象。它可使两个不同来源的细胞核在同细胞中表达功能，这样的细胞称异核体。若异核体出现有分裂时，则可使两个不同来源的细胞核的染色体汇聚，形成合并有亲本的大核，这样的细胞称为杂种细胞或杂交细胞（hybrid cell）。 自然情况下： 受精过程就是完美的细胞融合过程 在炎症区，常见巨噬细胞融合成的多核巨细胞，也是细胞融合null1961年 Barski在研究中观察到培养的体细胞发生融合现象 1962年 Okada首先用仙台病毒（流感病毒）诱导细胞融合成功，自发的动物细胞发生频率很小，但当加入病毒后，细胞融合的频率显著增大，因病毒的磷脂包膜与动物细胞膜十分相似，某些病毒的糖蛋白还有促进细胞融合的功能，仙台病毒已成为公认的细胞融合剂。 此外还可用聚乙二醇（polywtheglycol ，PEG）作为细胞融合剂，它可使邻近的细胞膜粘合，继而使细胞合并起来。null杂交细胞的产生是随机的细胞间融合的结果，如何从非杂交的细胞中筛选出成功的，有用的杂种细胞，是十分关键的问题。1964年，little-field创立了HAT选择培养基，又将细胞融合技术推向一个新的发展时期。H为hypoxanthine （次黄嘌呤） A为aminopterin （氨基喋呤） T为thymidine （胸腺嘧啶核苷） HAT选择出理想杂交瘤细胞，选择培养基其机制如下： H为hypoxanthine （次黄嘌呤） A为aminopterin （氨基喋呤） T为thymidine （胸腺嘧啶核苷） HAT选择出理想杂交瘤细胞，选择培养基其机制如下： 糖+氨基酸 氨基喋呤（A）-叶酸拮抗物 核苷酸 DNA 胸腺嘧啶核苷 TMP 核苷酸前体 TK HGPRT 次黄嘌呤 TMP DNA的生物合成途径null一般细胞在培养中合成DNA有二条途径 主要合成途径 即利用糖和氨基酸这些可从培养液中摄取的简单的含碳、含氮复合物来合成嘌呤及嘧啶核苷酸。这一过程需四氢叶酸参与供甲基及甲酰基，故该途径可被叶酸拮抗物氨基喋呤阻断；null补救旁路途径 细胞可通过次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK），将核苷酸前体合成核苷酸以供DNA合成的原料null 氨基喋呤（A)阻止嘌呤嘧啶的合成，凡能在HAT选择培养基中生长的细胞，必须能利用外源性次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T），即HGPRT缺乏的细胞是不能存活的，但当它与正常细胞杂交后，可从正常细胞中获得补救旁路途径所需酶而合成DNA。 null 所以需人为地筛选或致突变，诱发一些细胞缺乏HGPRT或缺乏TK，如用毒性药物8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine,8-AG)作用于细胞株（如SP2/0），可选育出缺乏HGPRT的细胞株，这是因为HGPRT+的细胞利用了8-AG后，因合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT-的细胞可在8-AG的培养基中生长。若这种细胞单独存在于HAT培养基中不能存活，而将死去。由此可见，HAT选择培养基及补救旁路途径酶缺乏的突变细胞株的建立，是细胞融合后选择出杂交细胞株的关键因素。（二）单克隆抗体 （monoclonal antibody technique McAb)（二）单克隆抗体 （monoclonal antibody technique McAb) B淋巴细胞在抗原刺激下能增殖分化，转变成产生抗体的浆细胞。若将单个产生特异性抗体的B淋巴细胞分离出来，使之在体外分化增殖，产生一大群即一个克隆的细胞，这样便可得到大量的、结构相同的、均一的、针对抗原某一决定簇的抗体，这种由一个克隆B淋巴细胞产生的抗体又称单克隆抗体。null由于B淋巴细胞不能在体外无限增殖，而体内是无法制备单克隆抗体的，抗原接种于机体产生的均为多克隆抗体。因此给单克隆抗体的制备带来困难。体外细胞融合技术为单克隆抗体的制备奠定了基础。null1975年Koehlert和Milstein利用杂交瘤技术，使以绵羊红细胞（SRBC）免疫后小鼠的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0或NS-1）融合，建立了能定向产生SRBC单克隆抗体的杂交细胞株，这一杂交细胞株具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力，又具有肿瘤细胞在体外无限增殖的特点，因此可以不断地从细胞培养上清液中获得单克隆抗体。单克隆抗体的问世被誉为免疫学中的一次革命，它对生物学、医学各领域产生了巨大的影响1、单克隆抗体制备全过程1、单克隆抗体制备全过程可溶性抗原或 免疫鼠（末次免疫后3-5d） 骨髓瘤细胞SP2/0 颗粒性抗原 解剖取脾制成细胞悬液 取对数生长期制成 细胞悬液 离心1000rpm 10min计数 1000rpm 10min计数 1.5-6x108 1:1或4:1 1.5x108 混合，离心1000rpm 10min 饲养细胞 去上清，加PEG融合（预温） 加无血清1640稀释（预温） 正常鼠腹腔液 1000rpm 10min离心去上清 加HAT培养液 离心计数 分装培养板 37℃ 5% CO2培养 前一日分装于培养板 逐日观察，隔日换液，HAT两周，HT一周后， 37℃ 5% CO2 过夜 改用正常培养 检测抗体（+） 克隆化，扩大培养冻存2、杂交瘤技术是否能获得预想的单克隆抗体，取决于三个基本环节和二个决定因素 以图示它们之间关系：2、杂交瘤技术是否能获得预想的单克隆抗体，取决于三个基本环节和二个决定因素 以图示它们之间关系：浆细胞瘤细胞系选择培养基饲养细胞（HAT）（104/ml以上）免疫鼠脾细胞良好、合适融合剂 良好合适3、杂交瘤技术制备单克隆抗体中的注意事项3、杂交瘤技术制备单克隆抗体中的注意事项要严格防止污染 所有细胞都要作长期培养，冻存复苏等，操作特别小心，环境及所有物品严格消毒灭菌 5-10%CO2空气环境下可提供较好的缓冲条件，能保持pH为弱酸性null胎牛血清或新生牛血清必须事前进行筛选，至少支持亲代骨髓瘤细胞生长方能使用。 试验牛血清的支持能力的方法为：把各批胎牛血清分别加入培养液中，对SP2/0或NS-1细胞进行有限稀释（230个细胞悬液于4.6ml培养液中5个细胞/0.1ml/孔分装于96孔板中36孔，余下1ml，再加4ml培养液共5ml时，1个细胞/0.1ml/孔X36孔，余下细胞液1.4ml，再加入培养液1.4ml，0.5个细胞/0.1ml/孔X24孔），不加入饲养细胞，一个好的胎牛血清支持SP2/0 ，NS-1细胞株克隆100%生长，但实际上有70-50%生长也就够满意了。一般来说，经过试验只有10-20%的牛血清批号合格。（三）SP2/0或NS-1细胞系需通过8-氮鸟嘌呤选择出来（三）SP2/0或NS-1细胞系需通过8-氮鸟嘌呤选择出来 SP2/0对32ug/ml 8-AG有抗力，NS-1对20ug/ml AG有抗力。进行细胞融合前最好进行8-AG处理，有利于HAT选择培养基筛选，而且SP2/0或NS-1必须是对数生长期，细胞密度要控制在105/ml，细胞活力达95%，进行细胞融合时1.5x108细胞数，一旦发现细胞株已过度生长或者已经衰老而趋于死亡，最好不要去抢救培养物，再从冰冻的备用管中重新复苏细胞(4)小鼠免疫脾细胞(4)小鼠免疫脾细胞 大多数情况下，并不需要高度免疫，其原则为： 可溶性抗原，则将100ug抗原的铝沉淀物与2X109灭活百日咳杆菌腹腔注射,1-3周后再用10ug水溶性抗原，腹腔或静脉注射以加强免疫，三天后脾细胞进行融合 细胞抗原，初次和加强免疫用2X107细胞或略少些，腹腔注射。最后免疫后三天进行细胞融合。 如果用要高度免疫的小鼠作脾细胞，则小鼠必须进行休息3-4周后，再作最后的加强免疫。 免疫脾细胞配制成1.5X108~6.0X108 用于融合（5）50%PEG配制（5）50%PEG配制 秤20-50g PEG1500~4000粉剂，放于玻璃瓶中，高压灭菌（121-132℃）20min，溶化呈液状，PEG尚未凝固时，加入RPM1 1640 20-50ml，与PEG重量相当，立即充分混合，此为50%PEG保存于室温，呈碱性，不必调节pH （6）整个细胞融合过程大约要6-7分钟，如下分配（6）整个细胞融合过程大约要6-7分钟，如下分配①37℃水浴箱；RPM1 1640含15%牛血清100ml；不含牛血清RPM1 1640 100ml，和50%PEG三者均置于37 ℃水浴备用。 重叠二个烧杯中。玻璃烧杯以盛37 ℃的水，作为超净工作台临时水浴用。 50ml离心管，锥形底，台式离心机， 1-10ml刻度吸管，秒表，96孔和24孔塑料组织培养板。null②1.5x108 sp2/0细胞和1.5~6.0x108免疫脾细胞放于一个50ml离心管中，充分混合，并1500rpm，10min，室温使混合细胞成为一个紧密的团块。移去上清液，保留全部细胞沉淀物，放置于37℃玻璃杯水浴中。 ③用1ml吸管吸取1ml保温于37 ℃的50%PEG溶液，慢慢加入混合细胞管中（至少要1min以上），当PEG加入时，就用吸管的尖，轻轻搅动细胞的团块，不要把团块弄散，此时就计数时间。 ④继续搅动团块1分钟，目的使所有的细胞尽可能地与PEG接触，此时务必使细胞悬液成为均匀的细胞小块。null⑤用吸管，慢慢加入预温的无血清1640 1ml ，1min，目的稀释PEG；再加入1ml，1min。最后加入7ml ，2-3min内加入，并持续轻轻搅动以免细胞破坏。 ⑥离心细胞悬液1000rpm，室温10 min，去上清 ⑦用吸管取预温的15%牛血清1640，先加10ml于细胞沉淀物中，对准细胞团加液，使细胞颗粒均匀分布于悬液中；再加入90ml。 加入已含有饲养细胞的96孔板（0.1ml/孔， 5.0X105或106 ） ，或24孔板（ 1ml/孔，3.0X106) (7)HAT 和HT选择培养(7)HAT 和HT选择培养①细胞融合前一天或当天，从正常鼠腹腔采取巨噬细胞用HAT营养液配制成6X104/ml，96孔板，每孔加入0.05ml，含3x103；24孔板，每孔加入0.5ml即每孔2.5x105，然后每孔接种融合细胞分别为106/0.1ml/孔和5x105/1ml/孔，接种当天为0天。 ②接种后第一天，各培养孔加0.1mlHAT培养液，可用吸管在各孔中加入2滴。null③在第2、3、5、8和11天，各孔吸出半量培养液，再加入2滴HAT培养液，第11天后每隔3-4天换液一次；24孔板接种后第8天（7-10天）进行换液，吸出旧液1ml，加入新HAT 1ml，以后第10、12天，再换HAT培养液，14天后换HT培养液，以后每3-4天换液一次。null④第1、2、3天时培养液显得十分酸，HAT的选择很快地使细胞减少，很多培养孔细胞死亡。此时，骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT酶，而不能合成DNA，未杂交的正常脾细胞在体外不能长期存活，只有杂交瘤细胞可以存活，并开始增殖，产生抗体或不产抗体。用相差倒置显微镜观察，常于第6-14天可见到一些新生细胞很象它的亲代细胞从细胞碎片中成群生长出来形成集落，活的和生长着的细胞很突出，发亮而且透明，带有浅绿色。而死亡细胞呈棕色或黑色不透明。null⑤此时，将HAT培养液换为HT培养液，培养一周左右，目的在于洗出残留于细胞内的氨基喋呤。换液必须尽早进行（一般在融合后第14天，通常一块板同时换液，避免有的孔为HAT，有的孔为HT，有的孔为1640）。 ⑥培养的细胞应正规地喂养（每三天换去一半旧液），不搅动细胞。 杂交瘤在96孔板上可长达4周，有时可达6周，在成功的细胞杂交中，几乎每孔都可以长出克隆。（8）初筛确定杂交细胞是否产生抗体（8）初筛确定杂交细胞是否产生抗体 细胞杂交后2-4周，收获各细胞培养孔上清液（必须在最后一次换液后3-4天，让抗体能有积聚的时间）。 每一培养孔更换一支毛细吸管，以免交叉。抗体测定可用未稀释上清，也可用稀释过的（1：5，1：10）。 测定方法由研究工作的目的所决定的，但必须是精确、可靠、快速而且可重复。保留哪些孔，废弃哪些孔，必须很快作出决定。（9）克隆化（9）克隆化 由于在一个培养孔内不单单只存在一种杂交瘤细胞系，因此一旦发现上清液中出现特异抗体后，就要及早克隆，以防止单克隆抗体细胞系被竞争淘汰。 克隆化后获得所需要的分泌性、特异性单克隆抗体。 分泌抗体的克隆一般生长都较慢。null克隆方法 显微挑选法：即在显微镜下，用毛细吸管挑选一个细胞进行培养。 琼脂空斑法：将软琼脂中特异空斑，再在空斑中心取细胞 FACS选取法：应用FACS将特异性杂交瘤细胞选出单个放入96孔培养板中培养 有限稀释法（较常用）：使96孔板上其中36孔每孔5个细胞，另36孔每孔1个细胞，余下24孔每孔0.5个细胞；亦有经连续稀释成最终30个/ml，每孔0.1ml接种48孔。null 克隆细胞培养液为RPM1 1640内含有15%牛血清，并含有107胸腺细胞/ml，如果克隆直接取自基础板，则应用HT培养液加入胸腺细胞是为了促进克隆细胞的生长。 要求有230个活细胞悬浮于含有胸腺细胞的克隆营养液4.6ml中，平均含5个/0.1ml/孔，共接种36孔，余下1ml，再加入4ml上述培养液，共5ml，平均含1个/0.1ml/孔，再接种36孔，还余下1.4ml，再加克隆液1ml，平均含0.5个/0.1ml/孔，共接种24孔，这样96孔板上有三个浓度的细胞浓度。 待细胞生长后即可挑出单克隆杂交瘤细胞株，每5、12天滴二滴营养液，14天测抗体；取6个抗体阳性的克隆，分别接种到1ml含胸腺细胞培养液，一周后测定上清液抗体；取2个抗体阳性克隆到5ml的培养液孔中，进一步增殖，此时每个阳性克隆至少冻存6小支，以防杂交瘤细胞传代过程中丢失。（10）抗体生产（10）抗体生产 细胞培养物上清液的抗体含量可达10-60ug（微克） 转瓶培养时，1升培养液可产生的抗体10-60mg（毫克），要达到这个水平，细胞往往因过度生长而开始死亡，应取50-100ml生长良好的细胞作为种子，冻存。null 小鼠体内产生抗体：2x106生命力旺盛的杂交瘤，注射于Balb/c鼠皮下，注射后10-30天，即可见到肿瘤，一旦肿瘤出现，可连续采取小鼠血液，提取特异性抗体，血清中特异性抗体浓度一般为1-10mg/ml。 诱发腹水瘤有时很困难，预先腹腔注射降植烷(Pristane )0.5ml 对形成腹水瘤有促进作用，3-10天后再腹腔注射2X106的杂交瘤细胞，注射7-10天往往可形成巨大腹水，腹水可望获得每毫升几毫克抗体，同时血清中也含有抗体。（11）抗体的纯化（11）抗体的纯化 有硫酸铵沉淀法、免疫亲和层析法 现介绍葡萄球菌蛋白质A-Sepharose 柱色层分析法 小鼠的IgG2a，IgG2b,IgG3及一些IgG,IgM都能与A蛋白相结合。 其原理：葡萄球菌A蛋白具有与人及多种哺乳动物的IgG的FC片段发生非特异性结合的特点而纯化的。方法：方法：1.5g protein A-Sepharose CL4B 于pH8.6的 Tris缓冲液，把胶溶液装入合适的柱子（底液为5-6ml） 收获组织培养液，并用稀NaOH调pH到8.6 把组织培养液装入A蛋白柱，用Tris缓冲液洗柱子三次（1000ml组织培养液，含有抗体10-60mg时。在pH8.6的情况下，很容易通过A蛋白柱） 进行分步洗脱，用下列不同的缓冲液，pH7.0磷酸缓冲液，pH5.5枸椽酸缓冲液，pH4.3醋酸缓冲液分别洗脱，直至杂交瘤细胞的抗体完全洗出来，根据收集组分，经OD280nm测定，计算蛋白浓度，此过程中禁止使用pH过低的缓冲液。null合并含有抗体的各个部分，用0.05MTris 0.15MNaCl pH8.1缓冲液透析 层析柱用pH2.3的盐酸甘氨酸缓冲液洗柱子，然后用Tris缓冲液pH8.6平衡（内含 0.02%NaN3）（12）杂交瘤细胞的保存（12）杂交瘤细胞的保存 因为细菌的污染和细胞的突变，使杂交瘤难以维持，冻存几批早期杂交细胞，预防意外是必要的。 无菌DMEN含20%牛血清加10% DMSO（二甲基亚砜），冻存液DMSO不需除菌过滤或高压灭菌，它具有毒，本身就是灭菌液体，过滤会破坏滤膜，高压灭菌又能破坏DMSO。2X106-5X106细胞加入1ml冻存液，盖紧冻存管，置于-70℃一天后转入液氮中贮存。（13）细胞复苏（13）细胞复苏 冻存管由液氮中取出，即刻投入37-40℃水浴中，很快融化，用吸管吸出细胞到50ml离心管，内有50ml细胞生长液，1000rpm ，10min，去上清，细胞沉淀物，再悬浮于10ml生长培养液，室温静止10min，再悬于5ml生长培养液，转移到25ml细胞培养瓶，置37 ℃ 5%CO2 孵箱培养，有些细胞在复苏后1天左右即会死去。（14）杂交瘤抗体的贮存（14）杂交瘤抗体的贮存 因为反复冷冻和融化往往导致杂交瘤抗体变性，所以对培养液，血清或纯化的杂交瘤蛋白，通常不采用反复冷冻干燥和融化的。对培养上清可加0.1%NaN3在4℃保存，对血清和腹水可以小容量分装，冻存-70 ℃以下，在-20 ℃保存亦可。将它们以硫酸铵沉淀物的形式（加等体积的饱和硫酸铵），保存在4 ℃是一种节约、完全和长期贮存的方法。对纯化的杂交瘤蛋白保存在4 ℃下，含0.1% NaN3的PBS中。