痘苗病毒检测方法的建立

［收稿日期］! "##$ % && % #" ［作者简介］! 段鸿元（&’(" %），男，河北省清苑县人，硕士。 ! 通讯联系人，)*+,-.：/-01213 45678 95+ 痘苗病毒检测方法的建立 段鸿元，邓永强，赵! 慧，于! 曼，李豫川，严! 格，秦鄂德! （军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点，北京! &###(&） ［摘要］! 目的：建立痘苗病毒的检测方法。方法：采用细胞病变法观察痘苗病毒感染的 :1;,细胞，通过电镜直接 观察病毒颗粒的形态特征，观察鸡胚绒毛尿囊膜上形成的痘斑并用分子生物学方法痘苗病毒 :< 基因片段。 结果与结论：痘苗病毒感染 :1;,细胞 =$ 6后出现典型细胞病变。在病毒感染细胞 $( 6后的培养上清和胞浆中均 可通过电镜观察到病毒颗粒。感染的鸡胚绒毛尿囊膜上出现痘斑。进一步采用 >?@ 法扩增病毒的 :< 基因， @A;>限制性内切酶片段多态性分析和序列测定证明该序列与已知序列一致。所建立的痘苗病毒系列检测方法， 为天花相关病毒的实验室诊断奠定了基础。 ［关键词］! 痘苗病毒；诊断；天花病毒 ［中图分类号］! @=(=B &" ［文献标识码］! < ［文章编号］! ! &###*CC#&（"##C）#=*#"("*#= !"#$%&’"()*+# ,- .*#*/#’,+ )*#(,." -,0 1$//’+’$ 1’02" !"#$ %&’()*+,’，!-$. *&’()/0,’(，1%#2 %+0，*" 3,’，45 *+)67+,’，*#$ .8，/5$ -)!8! （DE,E1 F1G ;,H5I,E5IG 5J >,E65K10 ,02 L-54197I-EG，M04E-E7E1 5J N-9I5H-5.5KG ,02 )O-21+-5.5KG，<9,21+G 5J N-.-E,IG N12-* 9,. D9-10914，L1-P-0K &###(&，?6-0,） ［3%"#0$/#］4 5%6*/#’1*：Q5 14E,H.-46 , 41I-14 5J 21E19E-50 +1E6524 J5I R,99-0-, R-I748 7*#(,."：Q61 9GE5O,E6-9 1JJ19E （?>)）5J :1;, 91..4 -0J19E12 S-E6 R,99-0-, R-I74 S,4 5H41IR128 Q61 J1,E7I1 5J R-I74 O,IE-9.14 S,4 2-49I-+-0,E12 7021I 1.19EI50 +-9I5495O18 Q61 R,99-0-, R-I74 O59T4 97.E-R,E12 50 ,..,0E5-9 +1+HI,01 5J 96-9T10 1+HIG5 S1I1 ,H41IR128 :< K101 JI,K+10E 5J R,99-0-, S,4 ,0,.GU12 S-E6 +5.197.,I H-5.5K-9,. +1E652488*"2&#" $+. 9,+/&2"’,+：QGO-9,. ?>) 5J :1;, 91..4 ,OO1,I12 ,E =$ 6 ,JE1I -0J19E-50 S-E6 R,99-0-, R-I748 V-I74 O,IE-9.14 -0 H5E6 474O104-50 ,02 O.,4+, 5J E61 97.E7I14 S1I1 J5702 7021I E61 1.19EI50 +-9I5495O1 ,E $( 6 ,JE1I -0J19E-508 V-I74 O59T4 ,.45 KI1S 50 E61 +1+HI,018 Q610 :< K101 JI,K* +10E S,4 ,+O.-J-12 ,02 950J-I+12 S-E6 I14EI-9E-50 JI,K+10E .10KE6 O5.G+5IO6-4+（@A;>）8 Q61 21E19E-50 +1E6524 J5I R,9* 9-0-, R-I74 S1I1 21R1.5O12 ,02 OI5R-21 , H,41 J5I .,H5I,E5IG 2-,K054-4 5J R,I-5.,*I1.,E12 R-I74148 ［:*; <,0."］4 R,99-0-, R-I74；21E19E-50；R,I-5., R-I74 ! ! 天花病毒、痘苗病毒、牛痘病毒和猴痘病毒均为痘病毒 科正痘病毒属的重要成员，它们可引起人兽共患疾病。尽管 自 &’(( 年以来世界范围流行的天花已被控制，但是仍不能 排除其可能再次自然流行［&］。"##= 年美国发生了猴痘病毒 的人间流行；当前全球范围都面临着包括天花病毒在内的生 物恐怖袭击的威胁。另外，自上世纪 W# 年代停止接种天花 疫苗后，人群对天花病毒缺乏抵抗力。因此，无论是对卫生 防疫，还是反生物恐怖的需要，建立痘病毒的检测方法都具 有重要意义。 本研究以痘苗病毒天坛株为对象，建立相关的实验室检 测方法。由于正痘病毒属成员的基因组同源性较高且形态、 结构相似，因此建立这些方法对其他痘病毒的检测都具有借 鉴意义。 =4 材料和方法 =8 =4 病毒株和细胞系 痘苗病毒天坛株，北京生物制品研究所提供。:1;, 细 胞，由本室保存。 =8 >4 鸡胚 &= 日龄鸡胚，购自北京梅里亚维通公司。 =? @4 痘苗病毒的 A*B$细胞感染及病变观察 用含 &#X小牛血清的 YN)N培养液培养 :1;,细胞，待 细胞长成单层后弃去培养液。将 &#"和 &#=倍稀释的病毒培 养液接种 :1;,细胞后于 =(Z吸附 & 6，然后补加含 "X小牛 血清的 YN)N维持液。感染细胞 =$ 6 后观察 :1;, 细胞病 变。感染后 $( 6收毒。 =8 C4 病毒形态学观察 分别收集感染病毒 $( 6的 :1;,细胞及其培养上清，经 戊二醛固定。收集培养上清，对感染细胞制作超薄切片，于 电镜下观察。 "(" ! 军事医学科学院院刊! "##C 年 [ 月 第 "’ 卷 第 = 期 L7.. <9,2 N-. N12 D9-，\70 "##C；! ! V5. "’! ]5 =! 万方数据 !! "# 痘苗病毒感染鸡胚绒毛尿囊膜 从鸡胚蛋壳的侧面将病毒悬液接种绒毛尿囊膜，接种量 为 "# !$。于 %&’孵箱中培养 (& ) 后收获尿囊膜并观察痘 斑。 !$ %# 痘苗病毒基因组 &’(的制备及 )*+扩增 !! %! !# 基因组 *+,的制备- 用 #! ."/的胰酶消化感染病 毒的 0123细胞，% ### 4 5 678离心 " 678，收集的细胞沉淀用 9:;重悬，于 <"’水浴灭活 %# 678。重复离心，收集沉淀。 再用 . 6$ 9:;重悬细胞。将细胞悬液置冰浴，用 =>?&"# 型 超声波粉碎仪（美国 ;@87AB C D3E1473$B公司产品）破碎细胞。 超声波破碎仪功率输出 (# F，时间 % 678，每 " B 暂停 " B。 细胞经破碎后加入 G# !$ H+3B1，%&’反应 %# 678。待溶液 温度降至室温后用 94@61I3 公司 *+, 试剂盒提取基因组 *+,。加入 (## !$蛋白沉淀液，混匀后在冰浴中骤冷 " 678， 然后 G% ### 4 5 678 离心 " 678。收集上清，用异丙醇沉淀核 酸。以同样条件离心 " 678，收集 *+,沉淀。用 &#/乙醇洗 沉淀一次。空气干燥沉淀，加入 G## !$水溶解 *+,，于 J"’ 加热 G )，分装保存于 (’。 !! %! ,# 0,基因的 9>H扩增- 根据痘苗病毒血细胞凝集素 （)163II$KE7878，0,）基因序列合成上、下游引物： 上游引物："L?,MN ,>, >N, MMN >>, ,M, >? %L； 下游引物："L?>M, N,> MMM NMM MM> MN?%L。 扩增条件：<.’，%# B；""’，%# B；&.’，G 678。共 %" 循 环。!"# O$KB " *+, 聚合酶（上海生物工程公司产品）。扩 增产物用 G! "/琼脂糖凝胶进行电泳。 !- .# /(基因的酶切及序列分析 用 P73I18公司 *+, 提取试剂盒回收扩增的基因片段， 然后将 0,片段克隆到 M?13BQ载体上。用限制性内切酶 !"# "对回收的 0,片段进行酶切分析并测序。 ,# 结果 ,- !# 痘苗病毒引起的 /012细胞病变观察 痘苗病毒可感染多种哺乳动物细胞。在 0123细胞上观 察感染细胞的病变情况发现，感染 .% ) 后细胞开始圆缩。 感染 %( )后细胞病变明显，大量细胞收缩并聚集。结果 明，痘苗病毒可使 0123细胞产生明显的病变，故可作为初步 判定的依据。 图 !# 痘苗病毒感染的 /012细胞的病变 ,!正常 0123细胞对照；:!痘苗病毒感染的 0123细胞 ,! ,# 痘苗病毒形态学观察 对痘病毒的检测以电镜观察最为直接。正痘病毒的大 小和外形相似，通常呈砖形或大卵圆形，有一个双凹面的核 心体，两个侧小体和包膜［.］。但是对每一种病毒的形态又有 各自的特点。感染性痘苗病毒颗粒大多存在于细胞内，细胞 外的仅占 G/ R.#/［.］，胞外病毒颗粒具有额外的一层脂蛋 白外膜。通过对感染上清负染后在电镜下可观察到病毒颗 粒呈砖头形或棒状，含有胞膜，大小为 &## 86 S (## 86 R G (## 86 S (## 86（图 .），明显大于通常认为的 .". 86 S G"T 86［.］。电镜下观察细胞内病毒颗粒的超薄纵切片可见胞 内病毒呈卵圆形，内有哑铃形核心体，外被包膜，有的还可看 到两个侧小体。病毒颗粒大小为 %G# 86 S G## 86 至 (." 86 S %&" 86（图 %）。表明同一株痘苗病毒在胞内和胞 外其形态和大小均存在差异。 图 ,# 培养上清中经负染的痘苗病毒电镜照片 标尺 U "## 86 %&.- 第 % 期- - - - - - - - - - - - - - - 段鸿元，等 V 痘苗病毒检测方法的建立 万方数据 图 !" 痘苗病毒感染细胞超薄切片的电镜照片 标尺 ! "## $% #& !" 痘苗病毒感染鸡胚绒毛尿囊膜的痘斑观察 由于痘病毒在鸡胚绒毛尿囊膜上可产生痘斑，为此将不 同剂量的病毒接种到 ’( 日龄鸡胚绒毛尿囊膜上。结果表 明，在感染 " ) ( *的绒毛尿囊膜上可以观察到白色不透明痘 斑，大小不规则（图 +）。随病毒感染剂量的增加和感染时间 的延长，绒毛尿囊膜出现一定程度的溃烂和坏死，而正常尿 囊膜则血管分布丰富，未见上述改变（图略）。 图 $" 痘苗病毒感染鸡胚绒毛尿囊膜痘斑实验结果 #& $" 痘苗病毒的分子生物学检测 痘苗病毒基因组庞大，碱基对约 "## ,-［+］。其血凝素基 因 ./可将正痘病毒属和其他痘病毒区别开［0］。本研究用 特异片段扩增结合限制性内切酶酶切图谱对该片段进行鉴 定。扩增 ./片段约为 1+# -2，与预期大小一致。用 !"# ! 内切酶分析扩增的 ./片段得到 + 个片段（图 0），其大小分 别为 +0#，"1#，’## 和 1# -2，其中 ’## -2和 1# -2片段在电泳 中重叠。这些片段的大小与预期一致。进一步对扩增的 ./ 基因进行序列分析表明其与痘苗病毒天坛株是一致的。 !" 讨" 论 痘苗病毒可在兔肾、睾丸、鸡胚、牛胚、.345 和 4 细胞等 多种细胞上增殖。.345细胞感染痘苗病毒后很快出现典型 的病变，这一变化可作为病毒分离的依据。对痘病毒的检测 以电镜观察最为直接。所有痘病毒的形态结构均相似，根据 此特点可以在电镜下直接观察其典型形态。但应注意，同一 株痘苗病毒的形态和大小在胞内和胞外存在较大的差异，这 可能与病毒的不同增殖阶段的状态有关。针对病毒形态差 异的观察有助于对痘病毒的鉴别。鸡胚对痘病毒 图 %" 痘苗病毒 &’基因的扩增和酶切图谱 ’6 74 " ### 78/ 物；"6 ./ 基因片段 !"# !内切酶酶切图谱；(6 扩增的 ./基因片段 敏感，通常痘苗病毒培养的上限温度较天花病毒高，为 +’9， 天花病毒为 (:& 09；痘苗病毒的痘斑也较天花病毒的大，而 天花病毒的痘斑更规则［;］。病毒感染鸡胚绒毛尿囊膜后出 现痘斑的时间和形态及培养温度的不同均有利于分离和鉴 别痘苗病毒。痘病毒的检测主要包括血清学方法、电镜观 察、痘斑试验和分子生物学方法等。由于痘病毒各成员之间 存在交叉反应，血清学方法如血凝素试验和免疫荧光试验等 不能用于痘病毒的鉴别。 利用分子生物学方法对特异基因进行扩增和酶切分析 可对痘病毒实现快速、准确的检测。由于痘苗病毒和天花病 毒的基因组同源性超过 1#<，因此，为了区别不同毒株的特 异片段，仍需对该片段进行限制性酶切分析，这样才可将被 检测的病毒确定到种［+］。因此，分子生物学方法对于痘病毒 的快速检测十分重要。本研究所建立的方法对天花病毒相 关的痘病毒属病毒的实验室诊断提供了借鉴。 ［参考文献］ ［’］= >-?5@A% BC，DEF3G@ 7/，C5F3@ CC，$% "&& H35FIJA%3 KLH 5GG5M JN *3J3OJ G%5FF2NP QA?EG［ R］& R LFA$ BAO?N-ANF，"##(，+’（ :）： (:(0 S (:(1& ［"］= 侯云德&分子病毒学［B］&北京：学苑出版社，’11#& ""& ［(］= 金= 奇，陈南海，姚二梅，等&痘苗病毒天坛株基因组旁侧区结 构及开放读码框架的分析［R］&病毒学报，’11T，’(（’）：" S 0& ［+］= HN22 C4，RA$ U，R5$AO3 L，$% "&& KLH GJ?5J3VM WN? A*3$JAWAO5JAN$ 5$* *AWW3?3$JA5JAN$ NW G%5FF2NP 5$* NJ@3? N?J@N2NPQA?EG3G［ R］& R LFA$ BAO?N-ANF，’110，((（:）："#;1 S "#T;& ［0］= 85,5$N R.& .E%5$ 2?NQA?EG *AG35G3G 5$* F5-N?5JN?M *A5V$NGAG［/］& >$：*3 F5 B5X5 4B，K3J3?GN$ YB，3*G& B3*AO5F QA?NFNVM［B］& 83Z [N?,：YFG3QA3?，’1:"& ’"0 S ’+T& ［;］= 邓= 钢&痘病毒感染［/］& 见：黄祯祥主编& 医学病毒学基础及 实验技术［B］&北京：科学出版社，’11#& :;1 S :T+& （本文编辑= 杨兆弘） +T" 军事医学科学院院刊= "##0 年 ; 月 第 "1 卷 第 ( 期= 万方数据 痘苗病毒检测方法的建立 作者： 段鸿元， 邓永强， 赵慧， 于曼， 李豫川， 严格， 秦鄂德， Duan Hong-Yuan， Deng Yong-qiang， ZHAO Hui， YU Man， LI Yu-Chuan， Yan GE， QIN E-De 作者单位： 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室,北京,100071 刊名： 军事医学科学院院刊 英文刊名： BULLETIN OF THE ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES 年，卷(期)： 2005,29(3) 参考文献(6条) 1.金奇;陈南海;姚二梅 痘苗病毒天坛株基因组旁侧区结构及开放读码框架的分析[期刊论文]-病毒学报 1997(01) 2.侯云德 分子病毒学 1990 3.Ibrahim MS;Kulesh DA;Saleh SS Real-time PCR assay to detect smallpox virus[外文期刊] 2003(08) 4.邓钢 痘病毒感染 1990 5.Nakano JH Human provirus diseases and laboratory diagnosis 1982 6.Ropp SL;Jin Q;Janice C PCR strategy for identification and differentiation of smallpox and other orthopoxviruses 1995(08) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_jsyxkxyyk200503020.aspx