全国艾滋病检测技术规范

第一章 样品的采集和处理----------邢玉兰 全国艾滋病检测技术 National Guideline for Detection of HIV/AIDS （2009年修订版） 中国疾病预防控制中心 二○○九年九月 全国艾滋病检测技术规范 National Guideline for Detection of HIV/AIDS （2009年修订版） 中国疾病预防控制中心 二○○九年九月 前 言 艾滋病在我国的流行已有二十余年，随着感染者不断增加、感染人群的变化和临床病人的日益增多，艾滋病检测工作量逐渐加大，新的监测和检测需求也不断增加，艾滋病检测实验室已遍及全国各级医疗、疾病预防控制、采供血、妇幼保健机构，出入境检验检疫、军队等各个系统。近几年，为了适应基层艾滋病检测的需要，一些没有条件建立规范的艾滋病检测实验室的乡镇卫生院，也陆续建起了艾滋病检测点。遍布全国的实验室网络为艾滋病防治工作提供了重要而坚实的基础。在新的形势下，为了更加有效地支持艾滋病监测、咨询检测（包括VCT和PITC）、新生儿感染早期诊断和抗病毒治疗工作，根据《关于艾滋病抗病毒治疗管理工作的意见》、《中国预防与控制艾滋病中长期规划（1998—2010年）》和“四免一关怀”等重要方针政策，在向各省、市征求意见基础上，在“全国艾滋病检测实验室审评和技术指导专家组”的参与下，中国疾病预防控制中心性艾滋病预防控制中心对《全国艾滋病检测技术规范（2004年版）》进行修改、增补和完善后，制定出《全国艾滋病检测技术规范（2009年版）》，使其既能满足目前艾滋病检测工作的实际需要，又能体现检测技术的发展。 本次主要对以下几个方面内容进行了修改、增补和完善：（1）在样品的采集和处理中，增加了滤纸干血斑样品、快速检测样品的采集和处理，用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定样品、尿液和唾液样品的采集和处理；（2）在HIV抗体检测中，增加了免疫荧光法和化学发光法，进一步明确了不同情况下的检测策略；（3）在HIV核酸检测中，增加了HIV感染产妇所生婴儿HIV感染早期诊断检测流程和适用于窗口期的集合核酸检测方法；（4）根据临床治疗需求，增加了HIV-1的耐药检测；（5）进一步完善了艾滋病检测实验室安全防护和艾滋病检测实验室的质量管理，使其更加符合目前艾滋病防治工作的需求，更加具有可操作性；（6）考虑到技术发展和新的需求，增加了HIV-1新近感染检测和HIV-1的分离培养技术。 修订后的《规范》共九章，包括：样品的采集和处理、HIV抗体检测、HIV-1抗原检测、HIV核酸检测、HIV-1耐药检测、CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测、HIV-1的分离培养、实验室生物安全、艾滋病检测实验室的质量管理。 本《规范》上报卫生部，经获准由中国疾病预防控制中心发至全国艾滋病检测实验室及有关单位。本《规范》将为国家、卫生部与财政部等部委下发的关于艾滋病防治工作的各项政策法规的有效实施提供强有力的技术支持，并具体指导艾滋病检测实验室技术人员开展日常工作。 本《规范》起草单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。 本《规范》参加编写单位：中国人民解放军军事医学科学院、上海市疾病预防控制中心、中国医科大学、北京出入境检验检疫局、北京市疾病预防控制中心、四川省疾病预防控制中心、浙江省疾病预防控制中心、中国生物制品检定所、卫生部临床检验中心、中国医学科学院、天津市疾病预防控制中心、河南省疾病预防控制中心、福建省疾病预防控制中心。 本《规范》编写组人员：蒋岩、汪宁、李敬云、钟平、康来仪、尚红、邵一鸣、肖瑶、朱红、邢文革、姚均、潘品良、邱茂峰、邢玉兰、秦光明、郭志宏、王佑春、申子瑜、季阳、强来英、朱效科、王哲、严延生、朱关福。 本《规范》主要国际咨询专家：世界卫生组织Osborne Connie，张岚。美国疾病预防控制中心GAP项目Bultery Marc, Chin-Yih Ou。克林顿基金中国艾滋病项目Trevor Peter。 本《规范》编写工作联系人：肖瑶 本《规范》自发布之日起实施，同时终止《全国艾滋病检测技术规范(2004年版)》。 本《规范》适用于全国所有的艾滋病检测实验室。 本《规范》解释权属于中国疾病预防控制中心。 目 录 第一章 样品的采集和处理……………………………………………………………………………1 TOC \o "1-3" \h \z \u HYPERLINK \l "_Toc241036890" 1 范围……………………………………………………………………………………………1 2 规范性引用文件………………………………………………………………………………1 3 样品种类及相应的用途………………………………………………………………………1 4 操作步骤………………………………………………………………………………………1 4.1 采样前准备……………………………………………………………………………1 4.2 采集和处理样品………………………………………………………………………2 4.3 样品的保存……………………………………………………………………………3 4.4 样品的运送……………………………………………………………………………3 4.5 样品的接收……………………………………………………………………………3 第二章 HIV抗体检测…………………………………………………………………………………5 1 范围……………………………………………………………………………………………5 2 规范性引用文件………………………………………………………………………………5 3 HIV抗体检测实验室要求……………………………………………………………………5 4 HIV抗体检测的目的和要点…………………………………………………………………5 4.1 HIV抗体检测的目的…………………………………………………………………5 4.2 HIV抗体检测的要点…………………………………………………………………5 5 以诊断为目的的检测策略……………………………………………………………………6 5.1 常规HIV抗体检测的方法和程序……………………………………………………6 5.2 其它HIV抗体检测的方法和程序……………………………………………………9 6 以监测为目的的检测策略……………………………………………………………………13 6.1 适用范围………………………………………………………………………………13 6.2 检测程序及结果报告…………………………………………………………………13 7 以血液筛查为目的的检测策略……………………………………………………………14 8 艾滋病检测实验室检测信息上报……………………………………………………………14 9 质量控制……………………………………………………………………………………15 9.1 抗体检测的统计学室内质量控制…………………………………………………15 9.2 快速检测质控………………………………………………………………………18 第三章 HIV-1抗原检测……………………………………………………………………………19 1 范围…………………………………………………………………………………………19 2 规范性引用文件……………………………………………………………………………19 3 HIV－1P24抗原检测的意义…………………………………………………………………19 4 实验室要求…………………………………………………………………………………19 5 检测方法及程序……………………………………………………………………………19 5.1 试剂…………………………………………………………………………………19 5.2 样品…………………………………………………………………………………19 5.3 定性检测……………………………………………………………………………19 5.4 定量检测……………………………………………………………………………19 5.5 结果报告和解释………………………………………………………………………20 20 第四章 HIV核酸检测………………………………………………………………………………21 1 范围…………………………………………………………………………………………21 2 规范性引用文件……………………………………………………………………………21 3 核酸检测的意义……………………………………………………………………………21 3.1 早期诊断……………………………………………………………………………21 3.2 疑难样本的辅助诊断………………………………………………………………21 3.3 遗传变异监测…………………………………………………………………………21 3.4 耐药性监测…………………………………………………………………………22 3.5 病程监控及预测……………………………………………………………………22 3.6 指导抗病毒治疗及疗效判定………………………………………………………22 4 HIV核酸检测实验室要求……………………………………………………………………22 4.1 实验室分区和功能…………………………………………………………………22 4.2 实验室人员和要求…………………………………………………………………23 4.3 实验室设施和设备…………………………………………………………………23 4.4 实验室生物安全……………………………………………………………………23 4.5 防止实验室核酸残余（Carry-over）污染措施……………………………………23 4.6 废弃物处理……………………………………………………………………24 5 HIV核酸检测方法及程序……………………………………………………………………24 5.1 HIV核酸定性检测……………………………………………………………………24 5.2 HIV核酸定量检测……………………………………………………………………25 5.3 集合核酸定性检测 （Pooling PCR）………………………………………………27 5.4 婴幼儿HIV感染核酸检测……………………………………………………………28 6 质量保证和质量控制………………………………………………………………………29 6.1 实验室分区和环境…………………………………………………………………29 30 30 30 第五章 HIV-1耐药检测……………………………………………………………………………31 1 范围…………………………………………………………………………………………31 2 规范性引用文件……………………………………………………………………………31 3 HIV-1耐药检测的意义………………………………………………………………………31 3.1 耐药监测……………………………………………………………………………31 3.2 耐药检测……………………………………………………………………………31 4 HIV-1耐药检测实验室要求…………………………………………………………………31 4.1 实验室功能分区……………………………………………………………………31 4.2 人员…………………………………………………………………………………31 4.3 设施和设备…………………………………………………………………………31 5 HIV-1耐药检测方法及程序…………………………………………………………………32 5.1方法……………………………………………………………………………………32 5.2 试剂…………………………………………………………………………………32 5.3 扩增目的基因片段及测序…………………………………………………………32 5.4 耐药和结果报告………………………………………………………………33 6 质量保证与质量控制………………………………………………………………………33 6.1 室内质控……………………………………………………………………………33 6.2 实验室能力验证……………………………………………………………………34 第六章 CD4+和CD8+T淋巴细胞检测………………………………………………………………35 1 范围…………………………………………………………………………………………35 2 规范性引用文件……………………………………………………………………………35 3 CD4+ 和CD8+T淋巴细胞检测的意义………………………………………………………35 4 CD4+ 和CD8+T淋巴细胞检测实验室要求…………………………………………………36 4.1 人员…………………………………………………………………………………36 4.2 设施和设备…………………………………………………………………………36 4.3 功能分区……………………………………………………………………………36 5 常规CD4+ 和CD8+T淋巴细胞检测的方法和程序…………………………………………36 5.1 样品采集、运输和接收………………………………………………………………36 5.2 方法…………………………………………………………………………………37 5.3 实验资料的记录……………………………………………………………………37 5.4 结果报告……………………………………………………………………………37 6 质量控制……………………………………………………………………………………38 第七章 HIV-1的分离培养…………………………………………………………………………39 1 范围…………………………………………………………………………………………39 2 规范性引用文件……………………………………………………………………………39 3 HIV-1分离的意义……………………………………………………………………………39 4 实验室要求…………………………………………………………………………………39 4.1 实验室………………………………………………………………………………39 4.2 设备…………………………………………………………………………………39 4.3 材料…………………………………………………………………………………39 5 HIV-1分离的方法及程序……………………………………………………………………39 40 第八章 实验室生物安全……………………………………………………………………………41 1 范围…………………………………………………………………………………………41 2 规范性引用文件……………………………………………………………………………41 3 HIV的生物危害………………………………………………………………………………41 4 HIV相关检测的生物安全级别………………………………………………………………41 5 生物安全保证措施…………………………………………………………………………41 5.1 建立安全制度………………………………………………………………………41 5.2 培训和管理…………………………………………………………………………42 5.3 个人保健和防护……………………………………………………………………42 5.4 安全操作……………………………………………………………………………43 5.5 使用利器注意事项…………………………………………………………………44 6 污染物处理…………………………………………………………………………………44 7 意外事故处理………………………………………………………………………………44 8 职业暴露后预防……………………………………………………………………………45 8.1 局部急救处理………………………………………………………………………46 8.2 对暴露感染的危险进行评估………………………………………………………46 8.3 确定是否需要药物预防及其…………………………………………………46 8.4 暴露后预防方案……………………………………………………………………48 8.5 暴露后预防的时间…………………………………………………………………48 8.6 暴露后预防的监测…………………………………………………………………48 8.7 药品储备点的建立及管理…………………………………………………………49 50 50 50 50 50 50 50 3.4 样品采集、运送和处理………………………………………………………………51 3.5 检测方法和试剂的选择……………………………………………………………51 3.6 设备维护与校准……………………………………………………………………51 3.7 实验耗材……………………………………………………………………………52 3.8 文件和文件管理……………………………………………………………………52 4 质量控制……………………………………………………………………………………53 5 质量评价……………………………………………………………………………………53 5.1 内部质量评价………………………………………………………………………54 5.2 外部质量评价………………………………………………………………………54 6 诊断试剂临床质量评估……………………………………………………………………57 6.1 评估目的……………………………………………………………………………57 6.2 参考试剂的选择……………………………………………………………………57 6.3 考评盘的制备………………………………………………………………………57 6.4 考评程序……………………………………………………………………………57 附表1 59 ………………………………………………………………………60 附表3 HIV抗体确证检测报告单…………………………………………………………………61 附表4 HIV抗体替代策略检测报告单……………………………………………………………62 附表5 流行病学监测HIV抗体检测报告单………………………………………………………63 附表6 艾滋病病毒抗体检测数及阳性人数统计报表……………………………………………64 附表7 CD4+T淋巴细胞检测结果报告……………………………………………………………65 附表8 6 附表9 68 附表10 艾滋病防治工作人员职业暴露事故汇总表………………………………………………71 第一章 样品的采集和处理 1 范围 本章规定了用于人免疫缺陷病毒（HIV）检测的全血、血清、血浆、细胞、唾液、尿液以及滤纸干血斑（DBS）样品的采集和处理方法，适用于HIV抗体检测、抗原检测、核酸检测、耐药检测,CD4+和CD8+T淋巴细胞测定和HIV分离培养。 2 规范性引用文件 《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》中华人民共和国卫生行业标准 WS 293-2008 《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测质量保证指南（试行）》（中国疾病预防控制中心，2006年2月） 《HIV-1病毒载量测定及质量保证指南（试行）》（中国疾病预防控制中心，2008年2月） Guidelines for Using HIV Testing Technologies in Surveillance WHO/CDS/CSR/EDC/2008 《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》，卫生部第45号令 2006年2月1日 3 样品种类及相应的用途 3.1 全血、血清、血浆、唾液、尿液以及DBS样品可用于HIV抗体检测。 3.2 抗凝全血可用于CD4+和CD8+T淋巴细胞测定。 3.3 血浆可用于HIV-1病毒载量、基因型及耐药检测。DBS样品可用于HIV-1基因型及耐药检测。 3.4 全血、血浆、淋巴细胞富集液、外周血淋巴细胞（PBMC）及DBS样品可用于HIV核酸的定性检测。 3.5 PBMC、全血、淋巴细胞富集液等可用于HIV-1分离培养。 4 操作步骤 4.1 采样前准备 根据检测项目的具体要求，确定采集样品的种类、处理、保存及运输的时限和方法，按照临床采血技术规范的要求操作，遵守生物安全要求（参见本规范第八章实验室生物安全）。 要检查所需物品是否已备齐，是否在有效期内，有无破损，是否足量，特别应检查受检者信息与样品容器表面的标记是否一致，并注明样品采集时间。选择合适的室内（外）采血空间，受检者坐（卧）于合适的位置，准备采血用具、皮肤消毒用品、采血管及试管架、硬质废弃物容器等。 4.1.1 样品的编码和记录 4.1.2 应制定样品编码的标准操作程序（SOP），规定样品编码的原则和方法，为样品制定唯一性编码（编号），保证其唯一性。 4.1.3 采血前，先对装有样品的离心管或滤纸进行标记，核对后编码。要将标签贴在试管的侧面，最好使用预先印制好的、专门用于冷冻储存的耐低温标签。 4.1.4 应使用专门的样品记录本或登记表记录样品，同时录入电脑保存。 4.2 采集和处理样品 4.2.1 血液 4.2.1.1 抗凝全血：消毒局部皮肤，用加有抗凝剂（EDTA钠盐或钾盐、枸橼酸钠、肝素钠）的真空采血管抽取适量静脉血，或用一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管中，轻轻颠倒混匀6～8次，备用。 4.2.1.2 末梢全血：消毒局部皮肤（成人和1岁以上儿童可选择耳垂、中指、无名指或食指。1岁以下儿童采用足跟部）。用采血针刺破皮肤，用无菌纱布擦掉第一滴血。收集滴出的血液，备用。 4.2.1.3 血浆：将采集的抗凝全血1500～3000r/min离心15min，上层即为血浆，吸出置于合适的容器中，备用。 4.2.1.4 血清：根据需要，用一次性注射器（或真空采血管）抽取5～10ml静脉血，室温下自然放置1～2h，待血液凝固、血块收缩后再用1500～3000r/min离心15min，吸出血清，置于合适的容器中，备用。 4.2.1.5 淋巴细胞富集液：将采集的抗凝全血1500～3000r/min离心15min ，吸取血浆层下的淋巴细胞富集液，置于合适的容器中，备用。 4.2.1.6 PBMC：使用淋巴细胞分离液，进行密度梯度离心，吸出PBMC层，备用。 4.2.1.7 根据检测要求选用适当的抗凝剂，如CD4+和CD8+T淋巴细胞测定可选用EDTA钠盐或钾盐、枸橼酸钠、肝素钠，HIV病毒分离、核酸定性/定量检测可选用EDTA钠盐或钾盐或枸橼酸钠。 4.2.1.8 样品采集后处理、保存、运输的时限和条件，因不同的检测项目而异，应参见不同检测项目要求。 4.2.1.9 采血完成后的穿刺针头必须丢弃于尖锐危险品容器里，妥善处理，防止发生职业暴露。 4.2.2 滤纸干血斑 4.2.2.1 根据需要，可将采集的各种血液样品制备成滤纸干血斑，保存、运输及检测。最常用的是用抗凝全血、末梢全血和血浆制备滤纸干血斑。 4.2.2.2 用移液器从样品管中吸取100μL抗凝全血（或血浆）样品，对准滤纸印圈的中心处，将样品滴在滤纸上，或将穿刺后自皮肤伤口流出的末梢全血直接滴加在滤纸印圈的中心处。 4.2.2.3 根据需要，连续在数个印圈上滴加样品。 4.2.2.4 于室温下自然干燥至少4小时（潮湿气候下至少干燥24小时），不要加热或堆叠血斑，勿与其它界面接触。 4.2.2.5 血斑充分干燥后，将其放入密封袋中，避免血斑之间的相互污染，同时放入干燥剂及湿度指示卡，密封包装，保存备用。 4.2.3 尿液和唾液 4.2.3.1 尿液：使用清洁的容器收集尿液。女性应避开月经期。尿液样品可以在2～8℃下存放。存放时间、是否冻存以及是否添加防腐剂以试剂盒说明书为准。 4.2.3.2 唾液：使用试剂盒提供的容器收集唾液样品。存放时间和是否冻存以试剂盒说明书为准。 4.3 样品的保存 4.3.1 用于抗体和抗原检测的血清或血浆样品，短期（1周）内进行检测的可存放于2～8℃， 一周以上应存放于-20℃以下。 4.3.2 用于核酸检测的血浆和血细胞样品4天内进行检测的可存放于4℃，3个月以内应存放于-20℃以下。3个月以上应置于-70℃以下。 4.3.3 艾滋病检测筛查实验室检测的筛查阳性样品应及时送确证实验室，筛查阴性样品，可根据具体需要决定保存时间，建议至少保存1～2个月。特殊用途或专项项目的样品根据具体要求确定保存时间。 4.3.4 艾滋病检测确证实验室收到的筛查阳性样品，无论确证结果如何，均应将剩余的样品保存至少10年，特殊用途或专项项目的样品根据具体要求确定保存时间。 4.4 样品的运送 4.4.1 应符合生物安全要求；要获得相应部门批准并由具有资质的人员专程护送。 4.4.2 应采用三层容器对样品进行包装，随样品应附有与样品唯一性编码相对应的送检单。送检单应标明受检者姓名、样品种类等信息，并应放置在第二层和第三层容器之间。 4.4.2.1 第一层容器：直接装样品，应防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的唯一性编码或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。 4.4.2.2 第二层容器：容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。要求不易破碎、带盖、防渗漏、容器的材料要易于消毒处理。 4.4.2.3 第三层容器：容纳并保护第二层容器的运输用外层包装箱。外面要贴上醒目的标签，注明数量、收样和发件人及联系方式，同时要注明“小心轻放、防止日晒、小心水浸、防止重压”等字样，还应易于消毒。 4.4.2.4 用于抗体检测的血清和血浆样品应在冻存条件下运送。用于CD4+和CD8+T淋巴细胞测定的样品应在室温下（18～25℃）或4℃（特殊要求时）运送。用于病毒载量检测的样品应在-20℃以下运输。DBS样品应在室温下（18～25℃）运送。每一件包装的体积以不超过50mL为宜。 4.4.2.5 运送样品必须有记录。 4.4.2.6 特殊情况下经有关部门批准可以用特快专递邮寄样品，但必须按三层包装，将样品管包扎好，严禁使用玻璃容器。 4.5 样品的接收 4.5.1 样品包裹必须在具有处理感染性材料能力的实验室内、由经过培训的、穿戴防护衣、戴口罩、防护眼镜的工作人员在生物安全柜中打开，用后的包裹应及时进行消毒。 4.5.2 核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒，同时报告实验室负责人和上一级实验室技术人员。 4.5.3 检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。如果污染过重或者认为样品不能被接受，应将样品安全废弃。并将样品情况立即通知送样人。 4.5.4 接收样品时应填写样品接收单。 第二章 HIV抗体检测 1 范围 本章规定了HIV抗体的检测方法、程序、结果报告、检测策略及质量控制。适用于各级各类医疗机构、疾病预防控制机构、检验检疫机构、采供血机构及卫生保健机构。可作为对HIV感染者诊断和监测的实验室依据。 2 规范性引用文件 《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》（中华人民共和国卫生行业标准，WS293-2008） Guidance for HIV testing in the Western Pacific Region. WHO Draft 19 July 2008. Statement from the Surveillance and Survey Working Group and the Laboratory Working Group to the Office of the Global AIDS Coordinator.26 Nov.2006. Guidelines for the use of the BED assay for incidence estimation and surveillance in resource-limited countries. Atlanta, 5 June 2006. Revised Guidelines for HIV Counseling, Testing, and Referral. U.S. CDC 2001. Current HIV-2 diagnostic strategy overestimates HIV-2 prevalence in China. Journal of Medical Virology, 2009, 81: 790-797. 3 HIV抗体检测实验室要求 应符合《全国艾滋病检测工作管理办法（2006）》中对实验室人员、建筑设施和设备等条件的要求。 实验室的质量保证和实验室安全防护按本规范相关章节规定执行。 4 HIV抗体检测的目的和要点 4.1 HIV抗体检测的目的 4.1.1 HIV抗体检测可用于诊断、血液筛查、监测等。 4.1.2 以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。 4.1.3 以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。 4.1.4 以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。 4.2 HIV抗体检测的要点 4.2.1 根据目的选择检测方法及检测策略。 4.2.2 严格遵守实验室SOP。 4.2.3 筛查试验阳性，须作确证试验。 4.2.4 筛查试验阴性， 不应做确证试验。 4.2.5 筛查及确证试验阳性均应做好咨询工作。 5 以诊断为目的的检测策略 5.1 常规HIV抗体检测的方法和程序 HIV抗体检测分为筛查试验（包括初筛和复检）和确证试验。 5.1.1 筛查试验 5.1.1.1 筛查试剂 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂，其中酶联免疫试剂应批批检合格。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。 5.1.1.2 筛查样品 HIV抗体筛查可采用血清、血浆、滤纸干血斑、唾液和尿液样品。 5.1.1.3 筛查方法 （1）酶联免疫吸附试验（ELISA） 可使用血液、唾液、尿液样品，ELISA多为单纯HIV抗体检测试剂。HIV抗原抗体联合检测试剂可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶标记的HIV抗原或抗体，加底物显色，用酶标仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。 （2）化学发光或免疫荧光试验 这类试剂采用发光或荧光底物，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。 （3）快速检测（RT）及其它检测试验 这类试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。一般可在10～30分钟内得出结果。 明胶颗粒凝集试验（PA）：是HIV血清抗体检测的一种简便方法。将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用。当待检样品含有HIV抗体时，明胶颗粒与抗体发生凝集反应，根据凝集情况判读结果。PA试剂有两种:同时检测HIV-1和HIV-2抗体以及分别检测HIV-1和HIV-2抗体。有效试验必须有阴性和阳性质控。 免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验：均以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状固定在膜上，加待检样品。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10分钟以内。有效试验的质控点必须显色。 免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线状固定在膜上，待检样品（血液或唾液）沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控带必须显色。 5.1.1.4 筛查程序 （1）初筛试验 根据检测目的选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛检测，对呈阴性反应的样品，可出具HIV抗体阴性（-）报告；对呈阳性反应的样品，需要进一步做复检试验和确证试验。 （2）复检试验 对初筛呈阳性反应的样品，应使用原有试剂和另外一种不同原理（或厂家）的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行复检试验。如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，则复检必须包括一种抗原抗体联合试剂。如两种试剂复检均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性（-）；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确证实验室进行确证试验（图1）。如果抗原抗体联合试剂检测呈阳性反应，而抗体试剂检测为阴性反应，则应考虑进行HIV-1 p24抗原或核酸检测，必要时进行随访。 艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反应的样品，确证实验室可以直接进行确证试验。 （3）初筛和复检流程 （图1） （4）筛查试验结果的报告 HIV抗体筛查试验用附表1进行报告，阴性反应报告为“HIV抗体阴性（-）”；阳性反应报告为“HIV抗体待复检”。 （5）筛查试验呈阳性反应样品的转送 如需送上级实验室进行复检，需要核对身份，补充个人信息（如姓名和身份证号码），必要时采集第二份血样，持HIV抗体筛查报告，送当地艾滋病筛查中心实验室，或直接送确证实验室复检。HIV抗体复检试验用附表2 进行报告，两次检测均阳性或一阴一阳报告为 “HIV抗体待确证”；两次检测均阴性报告为“HIV抗体阴性（-）”。HIV抗体复检报告需由1名检验人员和1名审核人员签字。 5.1.2 确证试验 5.1.2.1 确证试剂 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。 5.1.2.2 确证样品 可采用血清、血浆、滤纸干血斑样品。 5.1.2.3 确证方法 包括免疫印迹试验（WB）、条带免疫试验、放射免疫沉淀试验（RIPA）及免疫荧光试验（IFA）等。 5.1.2.4 确证流程 （图2） 使用HIV-1/2混合型试剂进行检测，如果呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性（－）；如果呈阳性反应，则报告HIV-1抗体阳性（＋）；如果不是阴性反应，但又不满足阳性判断标准，则报告HIV抗体不确定（±）。结合流行病学资料，可以在4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到8周。如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性；满足HIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访。随访期间可根据需要，检测病毒核酸或P24抗原作为辅助诊断。如果出现HIV-2型的特异性指示条带，根据实际情况需用HIV-2型免疫印迹试剂再做HIV-2的抗体确证试验或HIV-2核酸检测，以进一步明确HIV-2感染状态，疑难样品送国家艾滋病参比实验室进一步分析。 图2 HIV抗体确证检测流程 5.1.2.5 HIV抗体确证试验结果的判定 （1）HIV-1抗体阳性 同时符合以下2条标准可判为HIV-1抗体阳性：①至少有2条env带（gp41和gp160/gp120）出现，或至少1条env带和p24带同时出现；②符合试剂盒提供的阳性判定标准。 （2）HIV-2抗体阳性 出现HIV-2型特异性指示带的样品：如果同时呈HIV-1抗体阳性反应，报告HIV-1抗体阳性，不推荐进一步做HIV-2抗体确证试验；如果同时呈HIV-1抗体不确定或阴性反应，需用HIV-2型确证试剂再做HIV-2的抗体确证试验。 同时符合以下二条标准，即出现至少2条env带（gp36和gp140/ gp105），和试剂盒提供的阳性判定标准，可判为HIV-2抗体阳性。 （3）HIV抗体不确定 出现HIV抗体特异带，但不足以判定阳性。 注：①HIV-1抗体特异带包括：env带：gp160/gp120、gp41；gag带：p55、p24、p17（或p18）；pol带：p66（或p65）、p51、p31。②HIV-2抗体特异条带包括：env带：gp140/gp105、gp36；gag带：p56、p26、p16；pol带：p68、p53、p34。（由于使用的毒株不同，HIV-2 env带也可为gp125/gp80、gp36）。 （4）HIV抗体阴性 无HIV抗体特异带出现。 5.1.2.6 HIV抗体确证试验结果报告 HIV抗体确证试验结果用附表3报告。 （1）符合HIV-1抗体阳性判断标准，报告“HIV-1抗体阳性（＋）”，并按规定做好检测后咨询、保密和疫情报告工作。符合HIV-2抗体阳性判断标准，报告“HIV-2抗体阳性（＋）”，并按规定做好检测后咨询、保密和疫情报告工作。 （2）符合HIV抗体阴性判断标准，报告“HIV抗体阴性（－）”。如疑似“窗口期”感染，建议进一步做HIV核酸检测，尽早明确诊断。 （3）符合HIV抗体不确定判断标准，报告“HIV抗体不确定（±）”，在备注中应注明“4周后复检”。 5.1.2.7 发出确证报告的同时要做好检测后咨询。 5.1.2.8 HIV抗体确证报告由检测者，复核人员和签发人员签字后，按原送检程序反馈一式三份（确证实验室一份、送检单位一份、患者一份）。如确证对象户口不属于本辖区，确证报告应同时抄送感染者户口所在地的省艾滋病确证中心实验室。其它系统确证的地方人员，也应及时向当地卫生行政部门和省艾滋病确证中心实验室报告。 5.1.2.9 省艾滋病确证中心实验室难以确证的样品，送国家艾滋病参比实验室确证。同一受检对象的样品在不同实验室得到不一致的确证结果时，由国家艾滋病参比实验室予以仲裁。 5.2 其它HIV抗体检测的方法和程序 5.2.1 VCT替代检测策略 除上述常规检测程序以外，对HIV高流行地区高危人群的VCT检测，可采用替代策略。 5.2.1.1 使用要求 使用替代策略，应在确证中心实验室和确证实验室或以上实验室指定的筛查实验室进行，用临床试剂质量评估敏感性和特异性高的筛查试剂检测。使用该策略判断结果，阳性报告须由确证中心实验室和确证实验室或以上实验室认可的筛查实验室出具。 5.2.1.2 检测程序及结果报告 （图3） （1）先用第一种筛查试剂（高敏感性）检测，出现阴性反应报告HIV抗体阴性；出现阳性反应则报告“HIV抗体待复检”，用第二种筛查试剂复检。 （2）第二种筛查试剂（高特异性）复检，出现阴性反应进行确证试验；出现阳性反应用第三种筛查试剂进行确证。 （3）第三种筛查试剂（高特异性ELISA）检测结果阴性则报告HIV抗体阴性；检测结果阳性，且S/CO比值大于或等于6.0者，可以出具“HIV-1抗体阳性（+）”报告，使用“HIV抗体替代策略检测报告单”（附表4）。ELISA试剂检测结果阴性或S/CO在1.0～5.9之间，须进行确证试验。按照确证试验结果报告。 5.2.1.3 在发放检测报告的同时上报疫情。 5.2.1.4 做好检测后咨询。 5.2.2 HIV感染产妇所生儿童HIV抗体检测策略及流程 （图4） 5.2.2.1 适用范围 HIV感染产妇所生婴幼儿；已满18个月的婴幼儿，其母亲HIV感染状态不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床怀疑HIV感染的儿童。 5.2.2.2 检测程序及结果报告 （1）婴儿满12个月进行第一次HIV抗体检测。使用两种不同原理或不同厂家筛查试剂进行抗体检测，两种筛查试剂检测结果均为阴性反应，报告“HIV抗体阴性（－）”，可排除感染。检测结果出现阳性反应（一种为阴性反应一种为阳性反应或两种均呈阳性反应），不能排除感染，应继续追踪随访，至儿童满18个月时再次进行HIV抗体检测。 （2）婴儿满18个月时应再次进行HIV抗体检测。使用两种不同原理或不同厂家筛查试剂进行抗体检测。两种筛查试剂的检测结果均为阴性反应，报告“HIV抗体阴性（－）”，可排除感染。检测出现阳性反应（一种为阴性反应一种为阳性反应或两种均呈阳性反应），进一步进行确证试验，根据确证试验的结果判断是否感染HIV（图4）。 （3）在发放检测报告的同时上报疫情。 （4）做好检测后咨询。 5.2.3 HIV-1新近感染检测 HIV常规抗体检测方法可以判定感染和未感染状态，新近感染检测方法则用于识别近期感染与既往感染。目前，检测HIV新近感染的血清学方法中，研究和应用最多的是BED-EIA HIV-1捕获EIA方法（BED-CEIA），其原理是根据HIV特异性IgG占总IgG抗体的比例随着感染时间的延长而逐渐增高。应用BED-CEIA进行新近感染检测只适用于HIV阳性样品。由于个体间抗体生成的变异性，对个体而言，BED结果的预测值偏低，而且在个体水平上，BED检测可能产生一定的假阳性和假阴性，但在人群水平上，假阳性的数目与假阴性的数目相近，因此可以相互抵消彼此的作用。美国FDA将BED-CEIA归为“只应用于监测目的，不能用于个体诊断和临床”的实验方法。该方法用于监测及发病率计算的条件参见“HIV新近感染监测方案”。 5.2.3.1 新近感染检测样品的入选标准 （1）新近感染检测必须应用诊断为HIV-1阳性的血样，禁止将HIV阴性样品纳入新近感染检测。 （2）使用替代策略进行常规监测的地区，若将其HIV阳性样品纳入新近感染检测，对于BED－CEIA抗体梯度试验检测OD-n值<0.3的样品，需要对该样品进行确证检测，以排除潜在的HIV阴性样品。 （3）用于新近感染检测的样品，可以使用常规监测确证为HIV阳性的剩余/库存样品，不必重新采样。样品必须按照要求保存在-20℃以下，反复冻融次数小于3次。 （4）每份样品量不少于0.5ml。要求清亮、无严重溶血。 （5）没有交叉污染，个案信息全面准确。 （6）用于新近感染检测的阳性样品数量必须占总阳性样品的80%以上，否则不推荐纳入新近感染检测。 （7）如果同一人在3个月内出现2份或2份以上的确证阳性样品，将第一份样品纳入新近感染检测，其余样品从总样品中删除。 5.2.3.2 新近感染检测样品排除标准 （1）已经向监测系统报告过的感染者的样品（非初次诊断阳性者），该样品采集时间距HIV阳性检测记录已经超过3个月。 （2）所有艾滋病病人样品。 （3）所有接受抗病毒治疗病人样品。 5.2.3.3 参加新近感染检测的实验室每年至少接受二次国家参比实验室组织的能力验证（PT），通过考核后方可开始检测。 6 以监测为目的的检测策略 6.1 适用范围 全国艾滋病疫情监测。 6.2 检测程序及结果报告 （图5） 6.2.1 先用第一种筛查试剂（高敏感性ELISA）检测，出现阴性反应报告“HIV抗体阴性（-）”。出现阳性反应则用另一种不同原理或不同厂家的筛查试剂（高特异性ELISA）复检。 6.2.2 初筛和复检均为阳性，且样品OD值与临界值（Cutoff）的比值（S/CO）均≥6.0者可作阳性考虑，上报疫情（附表5）；初筛与复检任何一种试剂检测结果S/CO比值在1.0～5.9之间，或复检结果出现阴性反应，应进一步作确证试验，按照确证试验的标准判断结果（图5）。 6.2.3 发放检测报告的同时上报疫情。 6.2.4 对报告阳性者做好检测后咨询。 6.2.5 本程序仅用于流行病学监测和无关联检测，结果不得报告给个人。 7 以血液筛查为目的的检测策略 参照血液系统相关规定执行 8 艾滋病检测实验室检测信息上报 各级艾滋病检测实验室所在机构每月应填写《HIV抗体检测数及阳性人数统计报表》（附表6），并于每月10日前完成网络直报。未开展网络直报的单位，由县级疾病预防控制机构收集信息后统一上报。 9 质量控制 9.1 抗体检测的统计学室内质量控制 9.1.1 试剂盒内部对照 试剂盒内部对照质控品即为试剂盒内提供的阳性和阴性对照血清。试剂盒内部对照用于判断每次实验的有效性，但不能作为室内质控品使用。每一次检测临床样品时，必须有试剂盒内部对照，而且只能在同批号的试剂盒中使用。内部对照结果无效，必须重新试验。 9.1.2 室内质控品 为非试剂盒组份的外部质控品，是为了监控检测的重复性而设置的，包括强阳性、弱阳性和阴性质控血清。也可以只设置一个弱阳性质控，以该试剂盒临界值（Cut-off）的2～3倍为宜。外部质控品的作用是，判断该批临床样品检测的有效性，因此，每次实验必须包含室内质控品，其结果无效，必须重新试验。室内质控品可以是商品或实验室自行制备。 9.1.2.1 室内质控品的使用和质量要求 每一次实验必须使用室内质控品，以便监控实验的重复性。同时可以了解各批试剂盒的批间或孔间差异。室内质控品的管间或瓶间变异必须小于监测系统预期的变异（cv＜20%，并且质控品应稳定、无菌，且不含有影响试剂反应的防腐剂。 9.1.2.2 统计室内质控的主要表示方法—建立质控图 最常用的质控图是Levey-Jennings质控图，该图使用累计和技术或趋势分析技术的图形提供系统偏移和漂移的状况。下面以ELISA方法检测HIV抗体为例，描述建立质控图步骤： 9.1.3.1 建立质控图参数 外部质控品的均值和标准差应建立在实验室常规使用方法对外部质控品重复测定的基础上。一般采用在不同批次检测取得至少20个数据；如果仅做少量批次的检测，也至少做5个批次的检测，每个批次中不少于4个质控血清测定结果，以建立一个临时性的均值和标准差，当达到20批次数据后，替代临时性的均值和标准差。 （1）算术平均值（ ）：代表一组质控血清测定的S/CO值的均值。为了统计学上有显著性意义，应该采用至少20次（天）所测得的外部对照质控血清S/CO值结果计算出平均值。 （2）标准差（s）：是描述样品与均数之间离散程度的一个指标，是与质控血清S/CO值均值有关的预期范围。一组S/CO值的标准差以s表示。 （3）变异系数（cv）：是反映各次S/CO值相对于均值离散程度的一个指标，可以用来衡量检测的重复性或精密度。 （4）控制限：由实验室根据对外部质控品检测结果的均值和标准差来确定。例如12S质控规则的控制限为外部质控品S/CO均值加减2个标准差；13S质控规则的控制限为外部质控品S/CO均值加减3个标准差。 计算公式为： Σx = ── n s 计算公式为： ─────── ∑（ xn - ）2 s = ─────── n-1 cv 计算公式为： s cv = ──- × 100 % 9.1.3.2 绘制质控图 质控图是把检测数据与已确定的（计算出的）“控制限”进行比较的图，包含一条中心横线和其上、下两条平行的控制线，并按时间顺序点入本实验室每批次试验质控血清的测定值。质控图绘制步骤包括： （1）在常规条件下，对同一批血清连续测定20次（天）或以上，获得一组S/CO值，求均数（ ）和标准差（s）, 超出2s或3s的数据不应删除。 （2）将均值（ ）和标准差（s）分别在质控框架图中标示出来。以S/CO值作纵座标（Y轴），每一批次试验作横座标（x轴），绘制质控图。 （3）从第21次起，将每次质控血清的检测结果依次点入该质控框架图中，检验进入质控状态。 9.1.3.3 质控规则及其使用 实验室在报告实验结果之前必须评价质控数据，可通过图形记录的检查或由计算机审核结果来决定。目前有许多质控规则，常用的是12S和13S规则。 （1）告警（12S）：当外部质控品的S/CO值超出 +2s范围时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。若将12S做失控标准，有较高的假失控概率，所以一般不采用。 （2）失控（13S）：当外部质控品的S/CO值超出 +3s范围时，系统处于失控状态，本次实验结果不能被接受，可能是系统误差、随机误差或外部质控品 稳定性下降所致。 （3）漂移：连续几次（3～5次）外部质控品的S/CO值都落在均值的一侧则称为漂移，提示实验条件发生了较大的变化。 （4）趋势：连续几次（5～7次）外部质控品的S/CO值几乎按一个方向分布时称为趋势，通常由参数的缓慢改变引起。 质控规则的使用应检出随机误差和系统误差，即具有高的检出分析误差的能力，同时应具有较低的假失