4.药物定量分析与分析方法验证

null第四章 药物定量与分析方法验证第四章 药物定量分析与分析方法验证China Pharmaceutical University www.cpu.edu.cn中国药科大学药物分析教研室 第四章 药物定量分析与分析方法验证 第四章 药物定量分析与分析方法验证定量分析样品前处理方法 定量分析方法特点 药品质量标准分析方法验证123一、定量分析样品前处理方法一、定量分析样品前处理方法 Pretreatment of sample used in quantitative analysis定量分析样品前处理方法 概 述null 概 述null 概 述三氯叔丁醇null酒石酸锑钾富马酸亚铁 概 述含金属有机药物 概 述含金属有机药物定量分析样品前处理方法定量分析样品前处理方法直接测定法－含金属或C-M不牢固的有机金属 经水解后测定法－卤素联脂肪碳链（溶于适当溶剂再水解） 直接回流后测定 碱化回流后测定 硫酸水解后测定 经氧化还原后测定法－卤素联芳环牢固（一般用于测碘） 碱性还原后测定法－如泛影酸 酸性还原后测定法－如碘番酸 利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量不经有机破坏的分析方法:经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法湿法破坏 HNO3-HClO4 HNO3-H2SO4 H2SO4-MSO4 金属以高价态存在 干法破坏：无水碳酸钠或氧化镁，注意温度 氧瓶燃烧法空心空心A.燃烧瓶 B.铂丝网 C.D.盛固体样品滤纸及其折叠法 E.F.G.称取液体样品方法AGFEDCB氧瓶燃烧装置及称样方法氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法 样品 吸收液 测定方法 含氟有机药物 H2O pH4.3 HAc-NaAc Buffer 茜素氟蓝 分光光度法 含氯有机药物 NaOH溶液 银量法 汞量法 分光法 含溴有机药物 H2O2-NaOH液 或NaOH液- 银量法 分光法 硫酸肼饱和液 含碘有机药物 NaOH液- 银量法 碘量法 硫酸肼饱和液 汞量法 分光法碘苯酯含量测定碘苯酯含量测定 取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用NaOH T.S. 2ml与H2O 10ml为吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液10 ml，密塞，振摇放置数分钟，加甲酸约1ml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约3~5min，以除去剩余的溴蒸气，加KI 2g，密塞，摇匀，用Na2S2O3液 (0.02mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的硫代硫酸钠液(0.02mol/L)相当于1.388mg的C19H29IO2二、药品质量标准分析方法验证二、药品质量标准分析方法验证 指导原则 药品质量标准分析方法验证 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则 药物稳定性试验指导原则 缓释、控释制剂指导原则 微囊、微球与脂质体制剂指导原则 细菌内毒素检查法应用指导原则第三节 药品质量标准分析方法验证第三节 药品质量标准分析方法验证 目的： 证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求 效能指标： 评价分析方法的尺度 效能指标包括: 精密度, 准确度, 检测限,定量限,选择性, 线性与范围, 耐用性null(1)准确度（accuracy）： 测量值与真实值接近的程度 示: 回收率 测定方法：回收试验 加样回收试验(2)精密度（precision ）：(2)精密度（precision ）：定 义: 同一样品多次测量值之间相互接近的程度 表 示：标准偏差(s), 相对标准偏差(RSD) 重复性: 同一实验室,同一人多次测定的精密度 中间精密度: 同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度 重现性: 不同实验室，不同人测定的精密度(3)专属性（specificity）:(3)专属性（specificity）: 指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性)。第三节 药品质量标准分析方法验证 ------------性能指标第三节 药品质量标准分析方法验证 ------------性能指标(4) 检测限（limit of detection， LOD）： 药物能被检出的最低浓度(µg/ml) 测 定: 信噪比法(S:N=3:1) (5) 定量限（1imit of quantitation，LOQ）： 药物能被定量测出的最低浓度(µg/ml) 测 定: 信噪比法(S:N=10:1)第三节 药品质量标准分析方法验证 ------------性能指标第三节 药品质量标准分析方法验证 ------------性能指标(6) 线性与范围（linearity and range）： 待测物浓度与响应值成线性关系的浓度范围 线性关系：Y=a+bx （r=0.9999) 线性程度：相关系数 (7) 耐用性（robustness）: 测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度 影响因素：被测溶液的稳定性，流动相的组成和pH，商品柱的品牌，柱温等检验项目和验证内容：检验项目和验证内容：① 已有重现性验证，不需验证中间精密度 ② 如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充 ③ 视具体情况予以验证第四节 生物样品分析的基本步骤第四节 生物样品分析的基本步骤1. 药物从蛋白结合或缀合物中释出 ⑴ 蛋白变性：如应用三氯醋酸、HClO4、有机溶剂(乙醇、丙酮、乙腈)使蛋白沉淀 ⑵ 盐酸水解 ⑶ 酶消化法：最常使用蛋白水解酶中枯草菌溶素(一种细菌性蛋白分解酶，可在pH 7.0~11.0使肽键降解)null定量分析方法的验证 ----------生物样品分析定量分析方法的验证 ----------生物样品分析（一）特异性 内源性物质不得干扰原药、代谢物 （二）标准曲线 r≥0.9900，至少5个浓度，不许外延 （三）精密度和准确度 RSD≤15％、20％ 相对回收率85～115％（80～120％）定量分析方法的验证 ----------生物样品分析（四）最低定量限LOQ 3~5倍t1/2，或1/10～1/20倍Cmax （五）样品稳定性 室温、冻融、冰冻长期 （六）提取回收率（绝对回收率） 一般低于100％，须稳定 （七）质控样品 已知浓度样品均匀放入待测生物样品序列中，以确保定量测定的准确度定量分析方法的验证 ----------生物样品分析样品 固相净化 及 反相高效液相色谱法 测定血浆中茶碱样品 固相净化 及 反相高效液相色谱法 测定血浆中茶碱伍朝筼等 药学学报,1989,24(10):769~773血浆样品 净化后空白血浆 净化前空白血浆血浆样品 净化后空白血浆 净化前空白血浆Column Zorbax C18 5µm 2.5cm4.6mm 254nm Precolumn YWG-ODS 9-11µm 54.6mm Mobile Phase:甲醇-醋酸钠(0.05mol/L pH3.0)50׃50null50 100 150 200252015105茶碱(µg/ml)(min)·······················五例病人血浆茶碱浓度测定6.412.819.225.6 3232.41.81.20.60茶碱(µg/ml)·····标准曲线Y=9.56610-2X+6.15310-3 r=0.9995