人胰腺癌干细胞对吉西他滨的敏感性及其分子机制研究

第 39 卷第 3 期第 281 页 2010 年 6 月 　　　　 华中科技大学学报 (医学版) Acta Med Univ Sci Technol Huazhong 　　　　 Vol. 39 　No. 3 　P. 281 J une. 　2010 论　　著 3 国家自然科学基金 ( No1 30772172) ,国家自然科学基金青年基金 (No130600592)资助项目 朱　峰 ,男 ,1977 年生 ,主治医师 ,博士研究生 , E2mail : zfjch1977 @ sina1com △通讯作者 ,Corresponding aut hor ,E2mail :ryqin @tjh1 tjmu1edu1cn 人胰腺癌干细胞对吉西他滨的敏感性 及其分子机制研究 3 朱 　峰 , 　王 　敏 , 　秦仁义△ , 　申 　铭 , 　王 　欣 , 　田 　锐 , 　张志发 , 　石程剑 华中科技大学同济医学院附属同济医院胆胰外科 ,武汉 　430030 摘要 :目的 　检测人胰腺癌干细胞对吉西他滨的敏感性 ,分析其差异性基因的达 ,初步阐明其耐药分子机制。方 法 　运用流式技术从人原代胰腺癌和细胞系 SW1990 中分选 CD24 + CD44 + ESA + 细胞 ,行 NOD/ SCID 鼠移植瘤实验验 证其肿瘤干细胞特性 ;运用吉西他滨进行体内、外干预 ,检测胰腺癌干细胞凋亡和表达率变化情况。采用人类全基因组 表达谱 Affymetrix U133 plus210 芯片对胰腺癌干细胞和非干细胞进行差异基因筛选。结果 　人原代胰腺癌和细胞系 SW1990 中分选到 CD24 + CD44 + ESA + (018 %)和 CD24 + CD44 + (316 %) 细胞 ,移植瘤实验证实其为胰腺癌干细胞。肿 瘤干细胞凋亡率及表达率检测提示胰腺癌干细胞对吉西他滨显著耐药。与胰腺癌非干细胞比对 ,基因表达谱芯片筛查 到胰腺癌干细胞 820 条差异基因 ,其中上调表达 281 个 ,下调表达 539 个。结论 　胰腺癌干细胞对吉西他滨耐药 ,具有 特征性基因表达谱 ,为阐明胰腺癌多药耐药机制及靶向治疗奠定基础。 关键词 :胰腺癌 ; 　肿瘤干细胞 ; 　基因芯片 ; 　microRNA ; 　多药耐药 中图分类号 :R73519 　　DOI :10. 3870/ j. issn. 167220741. 2010. 03. 001 Sensitivity of Human Pancreatic Cancer Stem Cells to Gemcitabine and Molecular Mechanism Zhu Feng ,Wang Min ,Qin Renyi △ et al Department of B i l iary2Pancreatic S urgery , Tong j i Hos pital , Tong j i Medical Col lege , H uaz hong Universit y of Science and Technology , W uhan 430030 , China Abstract 　Objective 　To study the sensitivity of human pancreatic cancer stem cells to gemcitabine and screen the gene ex2 pression profile by gene microarray to clarify the multi2drug resistance mechanism of pancreatic cancer stem cells1 Methods 　 CD24 + CD44 + ESA + cells were sorted f rom xenograft s and SW1990 cell line by flow cytometry1 The stem2like properties of this subpopulation were assessed by the xenograft s model1 Pancreatic cancer cells were interfered with gemcitabine i n vivo and i n vi t ro ,and apoptosis rate and rate of pancreatic cancer stem cells were detected1 The differential gene expression between pancre2 atic cancer stem cells and other pancreatic cancer cells was detected by whole human genome microarray(Affymetrix Gene Chip U133 Arrays plus210)1 Results 　CD24 + CD44 + ESA + cells (018 %) and CD24 + CD44 + cells (316 %) were isolated in human pan2 creatic cancer xenografts and SW1990 ,respectively1 Xenograft experiment s confirmed that the sub2group had the characteristics of cancer stem cells1Detection of apoptosis rate and the rate of pancreatic cancer stem cells indicated that this sub2population was significantly resistant to gemcitabine1820 differentially expressed genes were identified ,including 281 up2regulated and 539 down2regulated in human pancreatic cancer stem cells by CDNA microarray screening1 Conclusion 　Pancreatic cancer stem cells were significantly resistant to gemcitabine ,and have special genes expression profile ,which may lay a foundation for studying the molecular mechanism of stem2like properties and targeted therapy1 Key words 　pancreatic cancer ; 　stem cell ; 　gene microarray ; 　micro RNA ; 　multi2drug resistance 　　胰腺癌是一种恶性程度极高 ,预后极差的恶性 肿瘤[ 1 ] 。Li 等[2 ]通过胰腺癌动物移植模型分离、鉴 定到人胰腺癌干细胞 ( CD24 + CD44 + ESA + ) ,并证 实其有可能是胰腺癌发生、发展的关键细胞亚群。 但目前仍未见有关该亚群细胞对临床化疗药物 敏感性及其分子机制的研究报道。本实验拟分选、 鉴定胰腺癌干细胞 ,研究其对吉西他滨的化疗敏感 性 ,并筛选胰腺癌干细胞差异表达基因谱 ,为阐明胰 腺癌多药耐药分子机制和寻找新的治疗靶点奠定基 础。 1 　材料和方法 111 　材料 人新鲜胰腺癌组织取自武汉同济医院原发胰腺 癌手术标本。胰腺癌细胞系 SW1990 为同济医院胆 胰外科实验室常规培养保存。吉西他滨购自 Lilly FRANCY 公司。流式分选抗体 CD242PE/ FITC、 CD442A PC、EpCAM2Percp2cy515、H22Kd2PE 购自 BD 公司 , ESA2FITC 购自 Biomeda 公司。流式细 胞仪 FACS Aria 为 BD 公司产品。NOD/ SCID 鼠 购自北京协和医科大学动物实验中心。表达谱基因 芯片为 Affymet rix U133 plus210。芯片处理由上 海生物芯片公司完成 ,芯片操作及信息处理系统分 别运用 Affymet rix 公司操作平台。 112 　流式细胞术分选 取人胰腺癌标本 ,按照参考文献[ 2 ]方法构建裸 鼠移植瘤模型 ,并制备单细胞悬液 ,移植瘤组织 37 ℃消化 2～3 h ,消化后用 400 目滤网过滤 ,磷酸 盐缓冲液 ( PBS) 漂洗 2 次制得单细胞悬液。 SW1990 细胞以 0125 %胰酶消化成单细胞悬液。细 胞用抗体 CD24、CD44 和 ESA 标记 , H22Kd 去除非 胰腺癌细胞 (裸鼠细胞) , 4′, 62二脒基222苯基吲哚 (4′, 62diamidino222p henylindole , DA PI) 去除死细 胞。流式细胞仪分选人原代胰腺癌 CD24 + CD44 + ESA + 细胞及 SW1990 中 CD24 + CD44 + 细胞 ,细胞 分选 2 次 ,保证分选细胞纯度 > 90 %。非 CD24 + CD44 + ESA + 胰腺癌细胞为胰腺癌非干细胞亚群。 113 　NOD/ SCID 小鼠移植瘤实验 分别取 1 000 个流式分选所得阳性和阴性胰腺 癌细胞 ,重悬于 Matrigel/ DM EM (1 ∶1) 培养液中 , 分别接种于 8 周龄雌性 NOD/ SCID 小鼠左、右腹壁 皮下 ,共接种 8 只小鼠。饲养 12 周后 ,切取肿瘤组 织做病理切片行苏木精2伊红染色 ;并制备单细胞悬 液 ,按照上述方法再次检测 CD24、CD44 和 ESA 的 表达 ,验证 CD24 + CD44 + ESA + 亚群细胞的自我更 新和分化特性。 114 　胰腺癌干细胞吉西他滨敏感性检测 胰腺癌干细胞和非干细胞在条件培养液培养下 加入吉西他滨 ,终浓度达到 1μg/ mL ,作用 24 h 后 收集细胞。细胞经 PBS 漂洗 2 次后重悬于 500μL 结合缓冲液 ,加入 5μL Annexin Ⅴ2FITC 和 5μL 碘 化丙啶 ( PI) 染色 ,室温避光 30 min ,流式细胞仪检 测。 115 　吉西他滨干预后胰腺癌干细胞表达率检测 SW1990 细胞培养液中加入吉西他滨 ,起始浓 度为 011μg/ mL ,作用 72 h 后换普通培养液培养 , 待细胞增殖到培养瓶 80 %后增加药物浓度干预 ,体 外连续干预 12 周。胰腺癌原代组织裸鼠皮下种植 6 周后 ,鼠尾静脉注射吉西他滨 (100 mg/ kg) ,每周 2 次 ,连续作用 8 周传代成瘤继续干预 ,共干预 3 代。取干预后胰腺癌细胞系 SW1990 和裸鼠移植瘤 细胞 ,流式细胞术检测胰腺癌干细胞表达率 ,实验重 复 3 次。 116 　基因芯片筛选胰腺癌干细胞差异表达谱和 microRNA 基因 　　①RNA 的提取、纯化 :采用 Trizol 一步法抽提 胰腺癌干细胞和胰腺癌非干细胞总 RNA ,Q IA GEN 的 RNeasy Mini Kit 进行纯化 ,运用 Agilent2100 系 统进行电泳质检。具体方法按说明书进行。②合成 与杂交 : 表达谱芯片和 micro RNA 芯片涉及的 cRNA 制备 ,杂交 ,清洗和质检均分别按 Affymet rix 芯片和 micro RNA 芯片说明书进行。其中 Affy2 met rix U133 plus210 芯片在 45 ℃,60 r/ min 条件下 杂交芯片 16 h。③检测和分析 :表达谱芯片经 Af2 fymet rix 扫描仪扫描芯片后 ,用 GCOS 112 软件读 取、处理数据。筛选上调或下调 > 2 倍的差异基因。 通过 onto2express 工具对差异基因进行功能分析 (gene ontology , GO)和信号通路分析。 117 　统计学方法 数据以均数 ±标准差 ( Šx ±s) 表示。应用 SPSS 1210 软件进行分析。成瘤能力检测运用χ2 检验 , 基因芯片分析进行 t 检验。 2 　结果 211 　胰腺癌干细胞的分离、鉴定 胰腺癌移植瘤中分离到 CD24 + CD44 + ESA + 细 胞亚群 ,该细胞亚群占所有细胞的 018 %。SW1990 中表皮特异性抗原 ( ESA) 表达率为 100 % ,CD24 + CD44 + 细胞亚群为 316 %。NOD/ SCID 鼠成瘤实验 表明 ,CD24 + CD44 + ESA + 细胞 ( 7/ 8) 较阴性细胞 (0/ 8)具有更强的成瘤能力 ,且能分化出非 CD24 + CD44 + ESA + 亚群细胞。表明胰腺癌中 CD24 + CD44 + ESA + 亚群细胞具有自我更新和分化的干细 胞样特性 ,成功分选到胰腺癌干细胞 (图 1～3) 。 212 　胰腺癌干细胞对吉西他滨敏感性及耐药性 吉西他滨干预 24 h 后 ,原代胰腺癌干细胞和非 干细胞凋亡率分别为 ( 2117 ±315) %和 ( 4012 ± 51 3) % ; SW1990中胰腺癌干细胞和非干细胞凋亡 ·282· 华中科技大学学报 (医学版) 　　2010 年 6 月第 39 卷第 3 期 率分别为 (1413 ±411) %和 (2416 ±416) % (图 4) 。 在原代肿瘤细胞和 SW1990 细胞系中 ,胰腺癌干细 胞对吉西他滨敏感性明显低于胰腺癌非干细胞 ,差 异有统计学意义 ( P < 0105) 。吉西他滨对原代胰腺 癌和 SW1990 进行体内、外干预后 ,原代肿瘤组织中 肿瘤干细胞比率由 018 %升高为 32165 % ,细胞系中 胰腺癌干细胞比率由 312 %升高为 42167 %(图 5) 。 213 　基因芯片检测结果 人类全基因组表达谱芯片含 47 400 条转录本 , 按 > 2倍差异筛选到表达谱基因有820条 ,占筛选 ·382·朱　峰等. 人胰腺癌干细胞对吉西他滨的敏感性及其分子机制研究 项基因总数的 1172 %。其中胰腺癌干细胞中上调 表达 281 个 ,下调表达 539 个。胰腺癌干细胞上调、 下调倍数前 30 的基因分别见表 1、2。GO 分析提示 差异基因涉及细胞凋亡、细胞周期、细胞结构、代谢 等多个环节。对差异基因进行信号通路分析 ,其中 涉及到多条关键调控信号通路 ,如 T GFbR ,apopto2 sis ,p38 MA P K和 EGFR 等。 3 　讨论 胰腺癌恶性程度极高 ,尽管临床手术和综合治 疗技术不断进步 ,但胰腺癌 5 年生存期仍然 < 5 %。 胰腺癌早期侵袭转移和多药耐药已经成为制约其临 床治疗效果的瓶颈[1 ] 。近期研究表明肿瘤中含有一 个具有自我更新、高度耐药和高侵袭转移的特殊亚 群 ———肿瘤干细胞。该特殊亚群细胞已经在多种肿 瘤中得到证实 ,如白血病干细胞、乳腺癌干细胞、脑 肿瘤干细胞、肝脏肿瘤干细胞和口腔肿瘤干细 胞[327 ] 。2007 年 ,Li 等[2 ] 通过人胰腺癌的动物移植 模型成功分离、鉴定出人胰腺癌干细胞 CD24 + CD44 + ESA + 。但目前仍未见有关该亚群细胞恶性 生物学行为及其分子机制的研究报道。据此 ,我们 从胰腺癌原代移植瘤和细胞系 SW1990 中分选到 CD24 + CD44 + ESA + 亚群细胞 ,并证实其为胰腺癌 干细胞 ;通过体内外实验证实 ,胰腺癌干细胞对吉西 他滨显著耐药 ,且经化疗干预后干细胞比率明显增 高。此外我们运用人类全基因组表达谱芯片共筛选 到差异表达谱基因 820 条 ,其中胰腺癌干细胞中上 调表达 281 个 ,下调表达 539 个。 ·482· 华中科技大学学报 (医学版) 　　2010 年 6 月第 39 卷第 3 期 图 5 　原代胰腺癌和细胞系 SW1990 吉西他滨干预后胰腺癌干细胞表达率检测 Fig1 5 Detection of rate of pancreatic cancer stem cells f rom xenograft tumors after t reat ment wit h gemcitabine 　　胰腺癌干细胞多药耐药特性的研究具有重要的 现实意义。实验提示该亚群对临床一线用药吉西他 滨不仅不敏感 ,目前的治疗还有可能提高该亚群细 胞的丰度 ,导致残留胰腺癌细胞恶性生物学行为的 增加。这一现象近期在乳腺癌、肝癌等肿瘤干细胞 中也得到了证实[6 ,8 ] 。以上研究提示 ,要彻底杀灭 肿瘤就必须杀灭肿瘤干细胞 ,而要杀灭肿瘤干细胞 就必须阐明其分子生物学机制 ,找到其靶向性的治 疗位点。本实验表达谱芯片结果 GO 分析显示 ,差 异基因涉及细胞凋亡、细胞周期、细胞器、代谢、耐药 等相关环节。其中包含免疫相关表面分子 CD55 , 代谢关键酶 P KM2 ,侵袭转移相关基因 MMP1 ,多 药耐药家族 ABCC3 和蛋白翻译关键因子 EIF5A 等[9212 ] 。进一步阐明这些关键基因及其蛋白代谢产 物的功能 ,有望探明胰腺癌干细胞分子生物学机制 , 并找到关键的治疗位点。本实验还进行了信号通路 的分析 ,发现多条信号通路异常表达 ,其中 EGFR 目前认为和肿瘤多药耐药密切相关 ,研究该信号通 路对阐明胰腺癌干细胞多药耐药机制具有重要意 义[13 ] 。 本实验分选到胰腺癌干细胞 ,初步阐明其对吉 西他滨耐药特性 ,并建立其差异基因谱。发现多个 与肿瘤生长、多药耐药和侵袭转移相关的基因位点。 进一步将探讨这些差异基因在胰腺癌恶性生物学行 为中的功能 ,为阐明胰腺癌发生、发展机制和靶向治 疗打下坚实的基础。 ·582·朱　峰等. 人胰腺癌干细胞对吉西他滨的敏感性及其分子机制研究 表 1 　胰腺癌干细胞较非干细胞部分升高基因 Table 1 　Up2regulated genes in pancreatic cancer stem cells Affymet rix ID Log ratio Gene title Gene symbol 1555950_a_at 612 CD55 molecule ,decay accelerating factor for complement CD55 222495_at 518 Chromosome 1 open reading f rame 119 C1orf119 204455_at 514 Dystonin DST 218923_at 513 Chitobiase ,di2N2acetyl2 CTBS 204475_at 513 Mat rix metallopeptidase 1 MMP1 204885_s_at 511 Mesot helin MSL N 214696_at 510 Chromosome 17 open reading f rame 91 C17orf91 226178_at 510 Suppressor of cytokine signaling 4 SOCS4 208161_s_at 419 A TP2binding cassette ,sub2family C ABCC3 201015_s_at 419 J unction plakoglobin J U P 209925_at 419 Occludin LOC647859 221556_at 418 CDC14 cell division cycle 14 homolog B CDC14B 228152_s_at 418 Hypot hetical protein FLJ31033 FLJ31033 201427_s_at 418 Selenoprotein P ,plasma ,1 SEPP1 219587_at 418 Tet rat ricopeptide repeat domain 12 T TC12 201549_x_at 417 J umonji ,A T rich interactive domain 1B J ARID1B 1554333_at 416 DnaJ ( Hsp40) homolog ,subfamily A ,member 4 DNAJ A4 204527_at 416 Myosin VA M YO5A 203153_at 415 Interferon2induced protein wit h tet rat ricopeptide repeat s 1 IFIT1 203035_s_at 415 Protein inhibitor of activated STA T ,3 PIAS3 201251_at 414 Pyruvate kinase ,muscle P KM2 225579_at 414 PQ loop repeat containing 3 PQLC3 227702_at 413 Cytochrome P450 ,family 4 ,subfamily X ,polypeptide 1 CYP4X1 223434_at 413 Guanylate binding protein 3 GBP3 229787_s_at 412 O2linked N2acetylglucosamine ( GlcNAc) t ransferase O GT 214855_s_at 411 GTPase activating Rap/ Ran GAP domain2like 1 GARNL1 213906_at 411 v2myb myeloblastosis viral oncogene homolog (avian)2like 1 M YBL1 228067_at 410 Chromosome 2 open reading f rame 55 C2orf55 227134_at 410 Synaptotagmin2like 1 SYTL1 参 　考 　文 　献 [ 1 ] 　Jemal A , Siegel R , Ward E et al1 Cancer statistics [ J ]1 CA Cancer J Clin ,2009 ,59 (4) :22522491 [ 2 ] 　Li C , Heidt D G ,Mollenberg N ,et al1 Identification of pancre2 atic cancer stem cells [ J ]1 Cancer Res , 2007 , 67 ( 3 ) : 10302 10371 [ 3 ] 　Lapidot T ,Sirard C ,Vormoor J ,et al1 A cell initiating human acute myeloid leukemia after t ransplantation into SCID mice [J ]1 Nature ,1994 ,17 (6464) :64526481 [ 4 ] 　Al2Hajj M , Wicha M S ,Benito2Hernandez A , et al1 Prospe2 ctive identification of tumorigenic breast cancer cells[J ]1 Proc Natl Acad Sci USA ,2003 ,100 (7) :3983239881 [ 5 ] 　Singh S K , Hawkins C ,Clarke I D ,et al1 Identification of hu2man brain tumour initiating cells [ J ] . 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