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琼脂糖凝胶电泳相关技巧

2011-07-23 2页 pdf 210KB 23阅读

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琼脂糖凝胶电泳相关技巧 美好明日 美好未来 http://www.biofuture.cn 琼脂糖凝胶电泳实验技巧 核酸分子是两性解离分子,在高于其等电点的电泳缓冲液中,其碱基不解离,而磷酸基团全部解离,核酸分子因 而带负电荷,电泳时向正极迁移。琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰,为一种聚合链线性分子, 使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质,发挥分子筛功能,使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异,从而...
琼脂糖凝胶电泳相关技巧
美好明日 美好未来 http://www.biofuture.cn 琼脂糖凝胶电泳实验技巧 核酸分子是两性解离分子,在高于其等电点的电泳缓冲液中,其碱基不解离,而磷酸基团全部解离,核酸分子因 而带负电荷,电泳时向正极迁移。琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰,为一种聚合链线性分子, 使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质,发挥分子筛功能,使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异,从而 达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速,通过调整其使用浓度,使得分辨率达到大多数实验的要求,因此 成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。 一、操作过程中要注意以下一些问。 1、凝胶制作 1.1 凝胶浓度 凝胶的浓度据实验需要而变 ,一般在 0.8%~2.0%之间,没用完的凝胶可以再次融化,但随着融化次数的增加, 水分丢失也越多,凝胶浓度则会越来越高,导致实验结果不稳定。补水办法:一是在容器上标记煮胶前的刻度,煮胶 后补充相应的水分至原刻度;二是在煮胶前称重,煮胶后补充水至原重量。粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶 条件得出一个经验补水值,以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。核酸染色剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化 的琼脂糖中,终浓度为 0.5t*g/ml;也可在电泳结束后染色。 1.2 梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板,梳齿宽厚,形成的点样孔容积较大,用于 DNA 片段回收实验等; 相反,梳齿窄而薄,形成的点样孔容积就较小,用于 PCR 产物、酶切产物鉴定等。梳板的选择主要是看上样量的多少 而定,一般来说,上样量小时尽量选择薄的梳板制胶,此时电泳条带致密清晰,便于结果分析。另外,每次制胶时都 要注意梳齿与底板的距离至少要 1 mm,否则,拔梳板时易损坏凝胶孔底层,导致点样后样品渗漏。当然,点样孔的破 坏还与拔梳板的时间和方法有关,一般凝胶需冷却 30 min 以上方可拔梳板,应急的情况下可以将成型的凝胶块放 4℃ 冰箱中冷却 15 min 左右,拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中,然后垂直向上慢慢用力,因为有 液体的润滑作用,梳板易拔出且不易损坏点样孔。 2、点样 在样品中加入上样缓冲液,上样缓冲液中含有甘油或蔗糖以增加密度,使样品沉入孔底;上样缓冲液中一般还含 有两种指示剂,溴酚兰和二甲苯青(值得注意的是指示剂并非染色剂,DNA 染色剂是溴化乙锭,而且要在紫外光的激发 下才能看见桔红色荧光),用于指示样品的迁移过程。上样缓冲液储存液一般为 6×(10×),表示其浓度为工作浓度的 六倍。使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。点样方法是将移液器基本垂直对准点样孔,用另一只手帮助固定移液器 下端,移液器枪头(Tip)尖端进入点样孔即可将样品注入孔内,千万不可将 Tip 尖插至孔底。同时点上适合的 DNA 分子 量,所谓适合是指样品 DNA 分子量大小应基本在 DNA 分子量标准范围之内。 3 电泳 将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连,负极与负极相连。核酸带负电荷,从负极向正极移动。电泳槽中电泳缓冲 液与制胶用电泳缓冲液应相同,电泳缓冲液刚好没过凝胶 1mm 为好,电泳缓冲液太多则电流加大,凝胶发热。电泳时 所加电压一般不超过 5v/cm(指的是正负电极之间的距离,而不是凝胶的长度),电泳时间一般为 3O~60 min,根据实 验需要也可作适当调整。电压增高,电泳时间缩短,核酸条带相对来说不够整齐,不够清晰;相反,电压降低,电泳 时间较长,核酸条带整齐清晰。 另外,如果电泳后样品泳动很慢或者没泳动,请检查胶模两端的封口胶条是否已去掉。 4 结果分析 较成功的电泳结果是分子量标准条带整齐清晰,样品条带也整齐清晰。 北京明日百傲生物科技发展研究所 010-62825268 62819319 美好明日 美好未来 http://www.biofuture.cn 二、DNA 电泳常见问题分析 常见问题 原因 对策 DNA 降解 实验过程避免核酸酶污染 电泳缓冲液陈旧 电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH 值上升,缓冲能 力减弱,从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液 所用电泳条件不合适 电泳时电压不应超过 20V/cm,温度<30℃;巨大 DNA 链电泳, 温度应<15℃;核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力 DNA 上样量过多 减少凝胶中 DNA 上样量 DNA 样含盐过高 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐 有蛋白污染 电泳前酚抽提去除蛋白 DNA 带模糊 DNA 变性 电泳前勿加热,用 20mM NaCl 缓冲液稀释 DNA 对于λ/Hind III 片段 cos 位点复性 电泳前于 65℃加热 DNA 5 分钟,然后在冰上冷却 5分钟 电泳条件不合适 电泳电压不超过 20V/cm;温度<30℃;经常更换电泳缓冲液 不规则 DNA 带迁移 DNA 变性 以 20mM NaCl Buffer 稀释 DNA,电泳前勿加热 DNA 的上样量不够 增加 DNA 的上样量;聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度 稍高,上样量可适当降低 DNA 降解 避免 DNA 的核酸酶污染 DNA 走出凝胶 缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度 带弱或无 DNA 带 对于 EB 染色的 DNA,所 用光源不合适 应用短波长(254nm)的紫外光源 小 DNA 带走出凝胶 缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度 分子大小相近的 DNA 带 不易分辨 增加电泳时间,核准正确的凝胶浓度 DNA 变性 电泳前请勿高温加热 DNA 链,以 20mM NaCl Buffer 稀释 DNA DNA 带缺失 DNA 链巨大,常规凝胶电 泳不合适 在脉冲凝胶电泳上分析 明日百傲衷心期望能与您合作双赢! 美 好 明 日 美 好 未 来 北京明日百傲生物科技发展研究所 010-62825268 62819319
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