药理实验对动物给药体积与采血体积的控制

1 药理实验中对动物的各种给药途径给药体积与速度的控制 本文由 wyj 摘要翻译 本文是 2001 年由欧洲制药工业协会联合会 (The European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations ，EFPIA)和欧洲替代方法验证中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)联合发布的关于对动物不同途径给药或采血时所 能充许的给药体积和采血体积指导。动物包括小鼠、大鼠、兔、狗、猴、豚鼠，给药方 法包括 po、ip、im、sc、一次性 iv、缓慢静注、静脉点滴等的一般给药体积、最大充许给药 体积、给药速度等，采血包括各种动物的最大充许采血量和恢复时间等。是一部实用、全面 而又难得的指导原则，相信对从事药理、毒理研究者及其他动物实验工作者有一定的帮助。 下面的节选由wyj摘要翻译，原文见欧洲联盟欧洲制药工业协会联合会,A Good Practice Guide to the Administration of Substances and Removal of Blood, Including Routes and Volumes(2000). J. Appl. Toxicol. 21, 15–23 (2001) 第一部分：动物实验中的给药体积与给药速度 一、一般给药体积与速度 对于各种给药途径的最大给药体积，取决实验动物种属和制剂性质。一般推 荐给药最大容积为见附表（（欧洲联盟欧洲制药工业协会联合会,2000）。 特殊给药途径每次的给药体积(英国药业会，1995）：每眼0.01 ml；⑥直肠 0.5 ml/kg；⑦阴道：大鼠0.2 ml，兔1 ml；⑧吸入2 mg/L；⑨ 鼻：猴或犬每鼻孔 0.1 ml。 表 1 各种给药途径的给药体积及可能的最大给药体积 a （欧洲联盟欧洲制药工业协会联合会,2000） 给药途径与体积 (ml/kg, except bml/site)d 动物种属 Oral sc ip im iv (单次) iv (缓慢注射) 小鼠 10 (50) 10 (40) 20 (80) 0.05b (0.1)b 5 (25) 大鼠 10 (40) 5 (10) 10 (20) 0.1b (0.2)b 5 (20) 兔 10 (15) 1 (2) 5 (20) 0.25 (0.5) 2 (10) 犬 5 (15) 1 (2) 1 (20) 0.25 (0.5) 2.5 (5) 猴 5 (15) 2 (5) C (10) 0.25 (0.5) 2 c 狨猴 10 (15) 2 (5) C (20) 0.25 (0.5) 2.5 (10) 小型猪 10 (15) 1 (2) 1 (20) 0.25 (0.5) 2.5 (5) : a:给非水溶液后，确定再次给药时间时应考虑前次药物是否已被吸收。肌肉内注射每天不能 超过 2 次。皮下注射每天限制在 2~3 个部位，前述皮下注射部位，不包括弗氏佐剂的使用。 2 b:每部位 ml 数。 c．无数据。 d．每一栏内有两组数字，左边的数字代表的是指导原则中适用于单次或多次给药时的给药 体积。右边括号内的数字代表的是可能的最大给药体积。如果超过这个给药体积那么将会导 致动物权益与实验的科学性之间产生矛盾。在某些情况下，给药体积要与药典的要求相适应。 二、静脉内给药 1.静脉推注：这种给药方式可使受试药在很短的时间内进入体内（大约在 一分钟内）。如此的快速注射要求试样与血液之间要能配伍且粘性不能太大。当 大体积的注射物质进入体内时，注射液应预热到动物体温水平。对于啮齿类动 物，给药速度不能超过 3ml/min。观察到把生理盐水以 6 ml/kg 给狗快速静脉内 注射时（<1 min），犬的血细胞容量计、心率方面没有发现可观察到的改变，但 是以 20ml/kg 给药时，血液被稀释 15%，且会出现短暂的心动过速。 2.静脉内缓慢注射：静脉缓慢注射是指注射过程超过 5~10min，此时应使用 蝶状针，或在浅静脉中留置静脉管套（短期），以便长时间内多次给药。 当给小鼠每日以 1ml/min 的速度，80ml/kg 的给药量，连续静脉内注射等渗 盐 4 天，经观察没有发现不良应激的显著体征以及肺损害。但以 0.25、0.5、 1.0ml/min 的速度给药且治疗时间延长至 30 天时，肺损害的严重程度和发生率 增加。 在早期可能也会产生不良影响，但因时间较短，不足以观察到病理学改 变。 3.连续输注：为了与临床用药一致,有时需连续静脉内输注。在 2 小时内， 单次给药的给药体积应小于循环血量的 10%。 对动物有效固定但不激惹之，对于维持长时间输液来说是个关键的因素。 一次输注时总的持续时间也是一个因素。表 2提供了推荐使用的关于非连续 输注给药（每天 4小时）及连续输注给药（24 小时）的给药体积、给药速度。 表 2 重复静脉内输注的给药体积与速度(及最大给药体积与速度) 每天输注 时间 小鼠 大鼠 兔* 犬 猴 小型猪 每日给药体积(最大给药总体积) (ml/kg) 4 Hour - 20 - 20 - - 24 Hour 96(192) 60(96) 24(72) 24(96) 60 24 输液速度(最大输注速度( (ml/kg/h) 4 Hour - 5 - 5 - - 24 Hour 4(8) 2.5(4) 1(3) 1(4) 2.5 1 3 （-）无数据,*基于致畸试验。 上表中有两个数据，第二个带括号的数据是推荐使用的最大体积。家兔给 药体积和速度的确定是基于对胚胎毒性的研究所得的数据，研究显示给予≥ 2ml/kg/h 及以上体积（McKeon 等 1997），对胎儿无影响，但母体组织内会形成 血管周围粒细胞套及增生的心内膜炎。大鼠典型的输注速度是 1~4ml/kg/h，但 在胚胎毒性研究中最好不要超过 2 ml/kg/h。小鼠、狗、恒河猴和小型猪的给药 体积均为重复给药一月的数据。 给药体积大时，溶媒的成分也很重要。静脉输注时，溶媒不同时，动物所 能耐受的最大体积有很大不同。 第二部分：动物实验中的采血途径与充许采血体积 一、血液采集一般知识 对动物的终末和非终末采血技术（如麻醉，取血体积）是有区别的，在以动 物死亡为实验结束（终末实验） 时的情况下采血与在清醒动物身上单次或多次 采血的情况是迥然不同的。 在实验过程中减少动物的疼痛不安和获得预期实验结果一样重要。这不仅是 出于人道主义，而且也是良好科学实践所要求的。因某一特定采血技术给动 物带来的不安可能会使动物产生应激，而伴随应激反应出现的许多生化和生理上 的改变会影响实验结果，如血中儿茶酚胺类、催乳素和糖皮质激素的升高会影响 葡萄糖、红细胞数、白细胞数和细胞压积等一些代谢参数。所以如果不能完全排 除应激，那么也应将应激降至最小程度。这不只是为动物考虑，也是为获得良好 的科学数据。在非终末采血中，不要抽血太多，因为取血过多会减少总血量而导 致错误结果。总血量的减少会使血红蛋白含量、氧转运能力和血压下降，同时使 应激相关激素浓度升高，也可能进一步诱发其他变化，如胃粘膜坏死等。 非终末采血可分为单次和多次采血，单次采血量低于动物总血量的15％对动 物不会有明显影响。然而，若取血量为总血量的15％～20％时，则会出现心排血 量或血压降低。取总血量的30％～40％ 会引起缺血性休克。若取血达40％可引 起约50％的猪和大鼠死亡。 4 单次采血不超过动物总血量的15％时，可在3～4周后重复采血。长期多次采 血每24h不应超过总血量的1％(0.6 ml/kg/d)。采集次数和（或）采血量过多则引 起贫血。 对大、小鼠如采血量不超过0.1 ml 时，常用尾尖采血法。眼眶静脉丛穿刺通 常适用于无尾动物如仓鼠。当尾静脉不能满足较大的采血量时，大、小鼠也可用 此技术。一般要求在麻醉下操作。只有当没有别的方法的特殊情况下，2周后才 能考虑在已恢复正常的动物的眼眶静脉丛再次取血。这项技术应由训练良好的工 作人员来操作，而且只能用动物的一只眼睛。不赞成在无麻醉条件下，用眼球摘 除法取血。 在毒代动力学研究中，大鼠采血可采用：尾静脉、趾脉管系、全麻下心脏穿 刺、全麻下颈外静脉和颈总动脉插管。 兔和豚鼠可用耳缘静脉、颈静脉或隐静脉。较大动物的采血可从浅表静脉进 行（隐静脉、头静脉、颈静脉） 二、循环血量 血液总量取决于物种、性别、年龄、健康及营养状况。对于同一种物种，较 大动物单位体重的总血量比较小的动物要少，老龄和肥胖动物单位体重含总血量 少于年轻和正常体重的动物。一般情况下，总循环血量为55～77 ml/kg 体重。 采血量的最大限值的计算，主要依赖于关于循环血量的精确数据。文献综 述表明循环血量的数值有很大的差异，或许这可归因于所用的采血方法、动物 品系和性别等方面的差别。 表 3 中给出了安全性评价研究中常用的不同种属动物的循环血量，以及在 毒理学研究中极为常用的狨猴和小型猪的数据。所列数值来源不同，但均为成 年、健康和处于适当营养水平的动物。 5 表 3：实验动物的循环血量 血量（ml/kg） 种属 推荐均数 数值范围 小鼠 72 63-80 大鼠 64 58-70 家兔 56 44-70 狗（Beagle） 85 79-90 猴（恒河猴） 56 44-67 猴（短尾猴） 65 55-75 狨猴 70 58-82 小型猪 65 61-68 三、采血量 当采血量接近最大限值时，实验动物的权益问题是首先应考虑的问题，但 动物生理反应对研究结果的影响必须同时加以考虑。因为它可能会影响数据的 和数据的正确性。采样前动物的临床症状，也是决定采血量的前提。 Scipioni 等（1997）的工作表明在 24 小时内采血量达到大鼠总血量的 40% 且 2 周后重复，大体上看不出会有不良影响。总之，关于动物采血后健康状况 的关键性指标如心率、呼吸、激素水平及行为学改变的数据不多，而这些指标 或许会在采血时发生变化以适应过度的采血。但要在采血时研究这些指标的变 化将需要付出极大的人力和物力。然而，血液学参数是很容易测定的。 在一个小型的科研项目中，摸拟药动采血过程，对于体重 250g 左右的的雄 性及雌性 Sprague Dawley 大鼠，每次采血 0.3 ml，24 小时内采占循环血量 7.5%， 11%，15%及 20%的血量, 测定了采血前后的红细胞计数（RBC），血红蛋白浓 度（HB），红细胞压积（HCT），红细胞平均容积（MCV）及红细胞分布范围 （RDW）。其后对动物进行了 29 天的观察. 结果表明，这些参数回到基线水平所用的时间相当不同，在 15%~20%的实 验组，一些参数（MCV，RDW）在 29 天后仍旧没有回到基线水平。本文推荐 的多次取样后的恢复时间，是所有大鼠采血后血量均恢复至采血前的“正常” 水平加减 10%的时间。单次取样（诸如要求进行常规毒理研究）推荐不超过 15%， 因超过 15%且抽血不是很缓慢的话，可能引起低血容量性休克。而多次少量取 6 样则不会产生这样的急性反应。毒理实验中血液学指标的变化非常重要，多次 采血会对这些指标发生影响，应特别注意多次采血后的恢复时间 表 4：最大采血体积及恢复时间 一次采血（如毒性研究） 多次采血（如毒代动力学研究） 采血量占循环血量的 % 大致的恢复时间 24 小时内采血量占循环血量的% 大致的恢复时间 7.5% 1 week 7.5% 1 week 10% 2 week 10-15% 2 week 15% 4 week 20% 3 week 然而，药动学研究时大量采血（如 20%）会引起血液动力学变化，或许会对 半衰期等参数产生影响。如果在 24 小时内处死动物，可以评价消除半衰期。暂 不认同补充血量的方法。 参考表 4 的数值，表 5 列出了对动物的正常生理功能没有明显干扰的采血 体积。 表 5 一定体重的实验动物的总循环血量及推荐的最大采血量 种属（重量） 血液体积(ml) 7.5% (ml) 10% (ml) 15% (ml) 20% (ml) 小鼠(25 g) 1.8 0.1 0.2 0.3 0.4 大鼠(250 g) 16 1.2 1.6 2.4 3.2 兔(4kg) 224 17 22 34 45 狗（10kg) 850 64 85 127 170 猴(恒河猴)(5kg) 280 21 28 42 56 猴(短尾猴)(5kg) 325 24 32 49 65 狨猴(350 g) 25 2.0 2.5 3.5 5 小型猪(15 kg) 975 73 98 146 195