微生物的营养

第4章​ 微生物的营养 要点： 微生物的营养要素：微生物的营养物质应满足机体生长、繁殖和完成各种生理活动的需要。 微生物的6类营养要素包括：碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水。 营养类型：根据微生物生长所需的能源、氢供体和基本碳源的不同，可将微生物的营养类型 归纳为光能自养型、光能异养型、化能自养型和化能异养型4种类型。 物质进入细胞的方式：细胞膜是具有高度选择性的半透膜，营养物质分子结构不同其进入细 胞的方式也有差别。总的来说物质通过细胞膜进入细胞的方式有4种：单纯扩散、 促进扩散、主动运送和基团移位。 培养基：人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养料称为培养基。设 计和配制培养基应遵循一定的原则，即目的明确、营养协调、理化适宜、经济节约。 培养基的种类有多种，根据所培养微生物的种类划分有：细菌、放线菌、酵母菌和 霉菌培养基；根据对培养基成分的了解程度划分有：天然培养基、合成培养基和半 合成培养基；根据培养基物理状态划分有：液体培养基、固体培养基、半固体培养 基和脱水培养基；根据培养基的功能划分有：选择性培养基、鉴别培养基、种子培 养基和发酵培养基等。 和其他生物一样，微生物也需要不断地从外部环境中吸收所需要的各种物质，通过新陈代谢将其转化成自身新的细胞物质或代谢物，并从中获取生命活动必需的能量，同时将代谢活动产生的废物排出体外。凡是能满足微生物机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需要的物质，都称为微生物的营养物质，而微生物获得和利用营养物质的过程称为营养。 第一节 微生物的6类营养要素 微生物有六类营养要素，即碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水。 一、碳源 凡是能够提供微生物细胞物质和代谢产物中碳素来源的营养物质称为碳源。有机碳源不仅用于构成微生物的细胞物质和代谢产物，而且为微生物生命活动提供能量。 微生物能够利用的碳源种类极其广泛，从简单的无机含碳化合物如CO2和碳酸盐等，到各种复杂的有机物，如糖类及其衍生物、脂类、醇类、有机酸、烃类、芳香族化合物等。但不同的微生物利用碳源物质的范围大不相同。有的能广泛利用各种类型的碳源，如假单胞菌属的有些种可利用90种以上的碳源；但有的微生物能利用的碳源范围极其狭窄，如甲烷氧化菌仅能利用甲烷和甲醇两种有机物，某些纤维素分解菌只能利用纤维素。 不同营养类型的微生物利用不同的碳源。异养型微生物以有机物作为碳源和能源，其中糖类是微生物最好的碳源，尤其是葡萄糖。其次是醇类、有机酸类和脂类等。在糖类中，单糖优于双糖，己糖优于戊糖，淀粉优于纤维素，纯多糖优于杂多糖和其他聚合物。有些微生物能利用酚、氰化物、农药等有毒的碳素化合物，常被用于处理“三废”，消除污染，并生产单细胞蛋白等。自养型微生物利用CO2作为唯一碳源或主要碳源，将CO2逐步合成细胞物质和代谢产物。这类微生物在同化CO2的过程中需要日光提供能量，或者从无机物的氧化过程中获得能量。 实验室内常用的碳源主要有葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、有机酸等。工业发酵中利用碳源主要是糖类物质如饴糖、玉米粉、甘薯粉、野生植物淀粉，以及麸皮、米糠、酒糟、废糖蜜、造纸厂的亚硫酸废液等。此外，为了解决工业发酵用粮与人们食用粮、畜禽饲料用粮的矛盾，目前已广泛开展了以纤维素、石油、C02等作为碳源的代粮发酵的研究工作，并取得了显著成绩。 二、氮源 凡是构成微生物细胞物质和代谢产物中氮素来源的营养物质称为氮源。主要用于合成细胞物质及代谢产物中的含氮化合物，一般不提供能量。只有少数自养细菌，如硝化细菌能利用铵盐、硝酸盐作为氮源和能源。 微生物能够利用的氮源种类也相当广泛，有分子态氮、氨、铵盐和硝酸盐等无机含氮化合物；尿素、氨基酸、嘌呤和嘧啶等有机含氮化合物。不同的微生物在氮源的利用上差别很大。固氮微生物能以分子态氮作为唯一氮源，也能利用化合态的有机氮和无机氮。大多数微生物都利用较简单的化合态氮，如铵盐、硝酸盐、氨基酸等，尤其是铵盐，几乎可以被所有微生物吸收利用。蛋白质需要经微生物产生并分泌到胞外的蛋白酶水解后才能被吸收利用。有些寄生性微生物只能利用活体中的有机氮化物作氮源。 实验室中常用的氮源有碳酸铵、硫酸铵、硝酸盐、尿素及牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、多肽、氨基酸等。工业发酵中常用鱼粉、蚕蛹粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉等作氮源。铵盐、硝酸盐、尿素等氮化物中的氮是水溶性的，玉米浆、牛肉膏、蛋白胨、醇母膏等有机氮化物中的氮主要是蛋白质的降解产物，都可以被菌体直接吸收利用，称为速效性氮源。饼粕中氮主要以蛋白质的形式存在，属迟效性氮源。速效性氮源有利于菌体的生长，迟效性氮源有利于代谢产物的形成。工业发酵中，将速效性氮源与迟效性氮源按一定的比例制成混合氮源加入培养基，以控制微生物的生长时期与代谢产物形成期的长短，提高产量。 很多微生物能将非氨基酸类的简单氮源如尿素、铵盐、硝酸盐、氮气等合成所需要的各种氨基酸和蛋白质，因此，可利用它们生产大量的菌体蛋白和氨基酸等含氮的化合物。 三、能源 能源是指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物质或辐射能。 化能异养型微生物的能源即碳源；化能自养型微生物的能源为NH4+、NO2－、S、H2S、H2、Fe2＋等还原态的无机化合物(4-1)。光能营养型微生物的能源是辐射能。 表4-1 微生物的能源谱 能源谱 化学能 有机物：化能异养型微生物的能源（与碳源相同） 无机物：化能自养型微生物的能源（与碳源不同） 辐射能 光能自养型和光能异养型微生物的能源 一种营养物常有一种以上营养要素的功能。例如，辐射能仅供给能源，是单功能的；还原态无机养分如NH4＋、NO2－ 是双功能的，既作能源又是氮源，有些是三功能的，同时作能源、氮源、碳源；有机物有的是双功能的，有的是三功能的。 四、无机盐 无机盐是微生物生长所不可缺少的营养物质。其主要功能是：①构成细胞的组成成分；②参与酶的组成；③作为酶的激活剂；④调节细胞渗透压，pH值和氧化还原电位；⑤作为某些自氧微生物的能源和无氧呼吸时的氢受体。 磷、硫、钾、钠、钙、镁和铁等元素参与细胞结构组成，并与能量转移、细胞透性调节功能有关。微生物对它们的需要浓度在10-3～10-4mol／L，称为大量元素。铜、锌、锰、钼、钴和镍等元素一般是酶的辅助因子，微生物对其需要浓度在10-6～10-8mol／L，称为微量元素。不同种微生物所需的无机元素浓度有时差别很大，例如，G- 细菌所需Mg2+ 比G＋ 细菌约高10倍。 （一）磷 细胞内矿质元素中磷的含量为最高，磷是合成核酸、磷脂、一些重要的辅酶(NAD，NADP，CoA等)及高能磷酸化合物的重要原料。此外，磷酸盐还是磷酸缓冲液的组成成分，对环境中的pH起着重要的调节作用。微生物所需的磷主要来自无机磷化合物如K2HPO4、KH2PO4等。 （二）硫 硫是蛋白质中某些氨基酸(如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等)的组成成分，是辅酶因子(如CoA、生物素和硫胺素等)的组成成分，也是谷胱甘肽的组成成分。H2S、S、S2O32-等无机硫化物还是某些自养菌的能源物质。微生物从含硫无机盐或有机硫化物中得到硫。一般人为的提供形式为MgSO4。微生物从环境中摄取SO42-，再还原成-SH。 （三）镁 镁是一些酶(如己糖激酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶和固氮酶)的激活剂，是光合细菌菌绿素的组成成分。镁还起到稳定核糖体、细胞膜和核酸的作用。缺乏镁，就会导致核糖体和细胞膜的稳定性降低，从而影响机体的正常生长。微生物可以利用硫酸镁或其他镁盐。 （四）钾 钾不参与细胞结构物质的组成，但它是细胞中重要的阳离子之一。它是许多酶(如果糖激酶)的激活剂，也与细胞质胶体特性和细胞膜透性有关。钾在胞内的浓度比胞外高许多倍。各种水溶性钾盐如K2HPO4、KH2PO4可作为钾源。 （五）钙 钙一般不参与微生物的细胞结构物质(除细菌芽孢外)，但也是细胞内重要的阳离子之一，它是某些酶(如蛋白酶)的激活剂，还参与细胞膜通透性的调节。它在细菌芽孢耐热性和细胞壁稳定性方面起着关键的作用。各种水溶性的钙盐如CaCl2及Ca(NO3)2等都是微生物的钙元素来源。 （六）钠 钠也是细胞内的重要阳离子之一，它与细胞的渗透压调节有关。钠在细胞内的浓度低，细胞外浓度高。对嗜盐菌来说，钠除了维持细胞的渗透压(嗜盐菌放入低渗溶液即会崩溃)外，还与营养物的吸收有关，如一些嗜盐菌吸收葡萄糖需要Na+的帮助。 （七）微量元素 微量元素往往参与酶蛋白的组成或者作为酶的激活剂。如铁是过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素和细胞色素氧化酶的组成元素，也是铁细菌的能源；铜是多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶的成分，锌是乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的活性基；钴参与维生素B12的组成；钼参与硝酸还原酶和固氮酶的组成；锰是多种酶的激活剂，有时可以代替Mg2+起激活剂作用。 在配制培养基时，可以通过添加有关化学试剂来补充大量元素，其中首选是K2HPO4和MgSO4，它们可提供四种需要量很大的元素：K、P、S和Mg。对其他需要量较少的元素尤其是微量元素来说，因为它们在一些化学试剂、天然水和天然培养基组分中都以杂质等状态存在，在玻璃器皿等实验用品上也有少量存在，所以，不必另行加入。但如果要配制研究营养代谢的精细培养基时，所用的玻璃器皿是硬质材料、试剂又是高纯度的，这就应根据需要加入必要的微量元素。 五、生长因子 生长因子通常是指那些微生物生长所必需而且需求量很小，但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。各种微生物需求的生长因子的种类和数量是不同的。 自养型微生物和某些异养型微生物（如大肠杆菌）不需要外源生长因子也能生长。不仅如此，同种微生物所需的生长因子也会随环境条件的变化而改变，如在培养基中是否有前体物质、通气条件、pH和温度等条件都会影响微生物对生长因子的需求。 广义的生长因子包括：维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类或脂肪酸；狭义的生长因子一般仅指维生素。 （一）维生素 维生素是一些微生物生长和代谢所必需的微量的小分子有机物。它们的特点是：①机体不能合成，必须经常从食物中获得；②生物对它的需要量较低；③它不是结构或能量物质，但它是必不可少的代谢调节物质，大多数是酶的辅助因子；④不同生物所需的维生素种类各不相同，有的微生物可以自行合成维生素，如肠道菌可以合成维生素K等。有的细菌可以用于生产维生素C。 （二）氨基酸 L-氨基酸是组成蛋白质的主要成分，此外，细菌的细胞壁合成还需要D-氨基酸。所以，如果微生物缺乏合成某种氨基酸的能力，就需要补充这种氨基酸。补充量一般要达到20～50μg／ml，是维生素需要量的几千倍。可以直接提供所需的氨基酸，或含有所需氨基酸的小分子肽。在有些情况下，细胞只能利用小肽，而不能利用氨基酸。这是因为单个氨基酸不能透过细胞，而小分子肽较容易透过细胞，随后由肽酶水解成氨基酸。有时培养基中一种氨基酸的含量太高，会抑制其他氨基酸的摄取，这称为“氨基酸不平衡”现象。 （三）碱基 碱基包括嘌呤碱和嘧啶碱，主要功能是构成核酸和辅酶、辅基。嘌呤和嘧啶进入细胞后，必须转变成核苷和核苷酸后才能被利用。 某些细菌的生长需要嘌呤和嘧啶，以合成核苷酸。最大生长量所需要的浓度是10～20μg／ml。有些微生物既不能自己合成嘌呤或嘧啶，也不能利用外源嘌呤和嘧啶来合成核苷酸，因此必需供给核苷或核苷酸才能使其生长。这些微生物对核苷和核苷酸的需要量都较大，满足最大生长所需浓度约为200～2000μg／ml。 能提供生长因子的天然物质有酵母膏、蛋白胨、麦芽汁、玉米浆、动植物组织或细胞浸液以及微生物生长环境的提取液等。 六、水 水是微生物营养中不可缺少的一种物质。这并不是由于水本身是营养物质，而是因为水是微生物细胞的重要组成成分；水是营养物质和代谢产物的良好溶剂，营养物质与代谢产物都是通过溶解和分解在水中而进出细胞的；水是细胞中各种生物化学反应得以进行的介质，并参与许多生物化学反应；水的比热高，汽化热高，又是良好的热导体，因此能有效地吸收代谢释放的热量，并将热量迅速地散发出去，从而控制细胞内的温度；水还有利于生物大分子结构的稳定。 水在细胞中有两种存在形式：结合水和游离水。结合水与溶质或其他分子结合在一起，很难被微生物利用。游离水则可以被微生物利用。 游离水的含量可用水的活度αw表示。水活度定义为在相同温度、压力下，体系中溶液的水的蒸汽压与纯水的蒸汽压之比，即： 式中 p ——溶液中水的蒸汽压 p0——纯水的蒸汽压 纯水的αw为1.00，当含有溶质后，αw小于1.00。微生物能在αw=0.63～0.99的培养条件下生长。对某种微生物而言，它对αw的要求是一定的，并且不决定于溶质的性质。当培养基的αw值降到该微生物的最适值以下时，会影响微生物的生长和最终的菌体收获量。 第二节 微生物的营养类型 营养类型是指根据微生物生长所需要的主要营养要素即碳源和能源的不同，而划分的微生物类型。微生物营养类型的划分标准或角度多种多样，但是通常是根据微生物对能源、氢供体和基本碳源的需要来区分，具体见表4-2。 表4-2 微生物营养的类型 营 养 类 型 能 源 氢 供 体 基 本 碳 源 实 例 光能自养型 （光能无机营养型） 光 无机物 CO2 蓝细菌、紫硫细菌、绿硫细菌、 藻类 光能异养型 （光能有机营养型） 光 有机物 CO2及简单有机物 红螺菌科的细菌（紫色无硫细菌） 化能自养型 （化能无机营养型） 无机物* 无机物 CO2 硝化细菌、硫化细菌、铁细菌、 氢细菌、硫黄细菌等 化能异养型 （化能有机营养型） 有机物 有机物 有机物 绝大多数细菌和全部真核微生物 *NH4+、NO2－、S、H2S、H2、Fe2+等。 一、光能自养型 光能自养型微生物利用光为能源，以CO2作为唯一或主要碳源，以H2S或Na2S2O3等还原态无机化合物作为氢供体，使CO2还原成细胞物质。该类型的代表是蓝细菌、紫硫细菌、绿硫细菌、藻类。它们含有叶绿素或细菌叶绿素等光合色素，可将光能转变成化学能（ATP）供机体直接利用。 二、光能异养型 光能异养型微生物具有光合色素，能利用光为能源，需要以简单有机物作为碳源和氢供体，它们也能利用CO2，但不能作为唯一碳源，一般同时以CO2和简单的有机物为碳源。光能异养细菌生长时，常需外源的生长因子。 三、化能自养型 化能自养型微生物利用无机物氧化放出的化学能作为能源，以CO2或碳酸盐作为唯一碳源或主要碳源，它们可以在完全无机的条件下生长发育。这类菌以H2、H2S、Fe2＋或NO2－为电子供体，使CO2还原为细胞物质。硝化细菌、硫化细菌、铁细菌、氢细菌等均属于这类微生物。它们广泛分布在土壤和水域中，在自然界的物质循环和转化过程中起着重要作用。由于它们一般生活在黑暗和无机的环境中，故又称为化能矿质营养型。 四、化能异养型 化能异养型生物以有机化合物为碳源，以有机物氧化产生的化学能为能源。所以，有机化合物对这些菌来讲，既是碳源，又是能源。已知的绝大多数微生物都属于此类。工业上应用的大多数微生物都属于化能异养型。化能异养型微生物又可分为寄生和腐生两种类型。寄生是指一种生物寄居于另一种生物体内或体表，从而摄取宿主细胞的营养以维持生命的现象；腐生是指通过分解已死的生物或其他有机物，以维持自身正常生活的生活方式。 第三节 营养物质进入细胞的方式 微生物是能够通过细胞表面进行物质交换的。微生物的细胞表面为细胞壁和细胞膜，而细胞壁只对大颗粒的物体起阻挡作用，在物质进出细胞中作用不大。而细胞膜由于具有高度选择通透性而在营养物质进入与代谢产物排出的过程中起着极其重要的作用。 细胞膜具有磷脂双分子层结构，所以物质的通透性与物质的脂溶性程度直接有关。一般来说，物质的脂溶性（或非极性）越高，越容易透过细胞膜。另外，物质的通透性也与其大小有关，气体（O2和CO2）与小分子物质（乙醇）比较容易透过细胞膜。许多大分子物质如糖类、氨基酸、核苷酸、离子（H＋、Na＋、K＋、Ca2+）以及细胞的代谢产物等虽然都是非脂溶性的，但它们借助于细胞膜上的转运蛋白可以自由进出细胞。水虽然不溶于脂，但由于其分子小，不带电以及水分子的双极性结构，所以也能迅速地透过细胞膜。 目前，一般认为营养物质进入细胞主要有四种方式：单纯扩散，促进扩散，主动运送和基团移位。前两者不需能量，是被动的；后两者需要消耗能量，是主动的，并在营养物质的运输中占主导地位。 一、营养物质被动扩散进入细胞的机制 营养物质顺着浓度梯度，以扩散方式进入细胞的过程称为被动扩散。被动扩散主要包括单纯扩散和促进扩散。两者的显著差异在于前者不借助载体，后者需要借助载体进行。 （一）单纯扩散 单纯扩散是指在无载体蛋白参与下，物质顺浓度梯度以扩散方式进入细胞的一种物质运送方式，这是物质进出细胞最简单的一种方式。该过程基本是一个物理过程，运输的分子不发生化学反应。其推动力是物质在细胞膜两侧的浓度差，不需要外界提供任何形式的能量。物质运输的速率随着该物质在细胞膜内外的浓度差的降低而减小，当膜两侧物质的浓度相等时，运输的速率降低到零，单纯扩散就停止。 通过这种方式运送的物质主要是一些气体(O2、CO2)、水、一些水溶性小分子(乙醇、甘油)、少数氨基酸。影响单纯扩散的因素主要有被运输物质的大小、溶解性、极性、膜外pH、离子强度和温度等。一般相对分子质量小、脂溶性、极性小、温度高时营养物质容易吸收。 该过程没有特异性和选择性，扩散速度很慢，因此不是细胞获取营养物质的主要方式。 （二）促进扩散 促进扩散指物质借助存在于细胞膜上的特异性载体蛋白，顺浓度梯度进入细胞的一种物质运送方式。在促进扩散过程中，被运输的营养物质与膜上的特异性载体蛋白发生可逆性结合，载体蛋白像“渡船”一样把溶质从细胞膜的一侧运送到另一侧，运输前后载体本身不发生变化，载体蛋白的存在只是加快运输过程，有时也称作渗透酶、移动酶。它的外部是疏水性的，但与溶质的特异性结合部位却是高度亲水的。载体亲水部位取代极性溶质分子上的水合壳，实现载体与溶质分子的结合。具有疏水性外表的载体将溶质带入脂质层，到达另一侧。因为胞内溶质浓度低，所以溶质就会在胞内侧释放。 促进扩散过程对被运输的物质有高度的立体专一性。某些载体蛋白只转运一种分子，如葡萄糖载体蛋白只转运葡萄糖；大多数载体蛋白只转运一类分子，如转运芳香族氨基酸的载体蛋白不转运其他氨基酸。 促进扩散通常在微生物处于高营养物质浓度的情况下发生。与简单扩散一样，促进扩散的驱动力也是浓度梯度。因此过程中不需要消耗能量。这种特异性的扩散，主要在真核生物中存在，例如，葡萄糖通过促进扩散进入酵母菌细胞；在原核生物中促进扩散比较少见，但发现甘油可通过促进扩散进入沙门氏菌、志贺氏菌等肠道细菌细胞。 二、营养物质主动运输进入细胞的机制 对大多数微生物而言，环境中营养物质的浓度总是低于细胞内的浓度，也就是说，这些物质的摄取必需逆浓度梯度地“抽”到细胞内。显然，这个过程需要能量，并且需要载体蛋白。将营养物质逆自身浓度梯度由稀处向浓处移动，并在细胞内富集的过程称为主动运输。 主动运输分为主动运送和基团移位两种运输机制。 （一）主动运送 主动运送是指通过细胞膜上特异性载体蛋白构型变化，同时消耗能量，使膜外低浓度物质进入膜内，且被运输的物质在运输前后并不发生任何化学变化的一种物质运送方式。 这种运送方式也需要载体蛋白参与，因而对被运输的物质有高度的立体专一性，被运输的物质和载体蛋白之间存在亲和力，而且在细胞膜内外亲和力不同，膜外亲和力大于膜内亲和力。因此，被运输的物质与载体蛋白在胞外能形成载体复合物，当进入膜内侧时，载体构象发生变化，亲和力降低，营养物质便被释放出来。 主动运送过程和促进扩散一样需要膜载体的参与，并且被运输物质与载体蛋白的亲和力改变也与载体蛋白构型的改变有关。不同的是：在主动运送过程中载体蛋白构型的变化需要消耗能量。 由于这种方式可以逆浓度差将营养物质输送入细胞，因此，必须由外界提供能量。微生物不同，能量来源也不同，细菌中主动运送所需能量大多来自质子动势，质子动势是一种来自膜内外两侧质子浓度差(膜外质子浓度＞膜内质子浓度)的高能量级的势能，是质子化学梯度与膜电位梯度的总和。质子动势可在电子传递时产生，也可在ATP水解时产生。 主动运送是微生物吸收营养物质的主要方式，很多无机离子、有机离子和一些糖类(乳糖、葡萄糖、麦芽糖等)是通过这种方式进入细胞的，对于很多生存于低浓度营养环境中的微生物来说，主动运送是影响其生存的重要营养吸收方式。 （二）基团移位 基团移位是指被运输的物质在膜内受到化学修饰，以被修饰的形式进入细胞的一种物质运送方式。基团移位也有特异性载体蛋白参与，并需要消耗能量。除了营养物质在运输过程中发生了化学变化这一特点外，该过程的其他特点都与主动运送方式相同。基团移位主要用于运送各种糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖和N-乙酰葡萄糖胺等)、核苷酸、丁酸和腺嘌呤等物质。 基团移位的最典型例子是磷酸转移酶系统，该系统通常由酶I、酶Ⅱ、酶Ⅲ和热稳载体蛋白(HPr)等4种蛋白组成。酶Ⅰ是非特异性的，是磷酸烯醇式丙酮酸-己糖磷酸转移酶。酶 图4－1 营养物质运送入细胞的4种方式 Ⅱ共有三种：Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc，其中Ⅱa为细胞质蛋白，无底物特异性；Ⅱb和Ⅱc均为膜蛋白，具有底物特异性，可通过诱导产生，种类较多。酶Ⅲ是膜结合的特异性酶，对糖有专一性。HPr是一种低分子质量的可溶性蛋白，结合在细胞膜上，起着高能磷酸载体的作用。磷酸转移酶系统每输入1个葡萄糖分子，需要消耗1个ATP的能量。具体运送分两步进行： (1)热稳载体蛋白(HPr)的激活 细胞内高能化合物--磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的磷酸基团通过酶Ⅰ的作用而把HPr激活： (2)糖经磷酸化而运入细胞膜内 膜外环境中的糖分子先与细胞膜外表面上的底物特异膜蛋白——酶Ⅱc结合，接着糖分子被由P～HPr →酶Ⅱa→酶Ⅱb逐级传递来的磷酸基激活。最后通过酶Ⅱc再把这一磷酸糖释放到细胞质中。 由于膜对大多数极性的磷酸化合物有高度的不渗透性，所以，磷酸化后的糖不易再流出细胞，马上可以进入分解代谢。 上述4种运送方式的比较与模式图见表4-3和图4-1。 表4－3 四种跨膜运输方式的比较 比较项目 简单扩散 促进扩散 主动运送 基团移位 特异载体蛋白 无 有 有 有 运送速度 慢 快 快 快 溶质运送方向 由浓到稀 由浓到稀 由稀到浓 由稀到浓 平衡时内外浓度 相等 相等 内部浓度高得多 内部浓度高得多 运送分子 无特异性 特异性 特异性 特异性 能量消耗 不需要 不需要 需要 需要 运送前后的溶质分子 不变 不变 不变 改变 载体饱和效应 无 有 有 有 与溶质类似物 无竞争性 有竞争性 有竞争性 有竞争性 运送抑制剂 无 有 有 有 运送对象举例 H2、CO2、O2、甘油、乙醇、少数氨基酸、盐类、代谢抑制剂 SO2-、PO34-、糖(真核生物) 氨基酸、乳糖等糖类、Na＋、Ca2＋等无机离子 葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸 第四节 培 养 基 培养基是指人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。任何培养基都应具备微生物生长所需要的六大营养要素，且其间的比例是合适的。制作培养基时应尽快配制并立即灭菌，否则就会杂菌丛生，并破坏其固有的成分和性质。 绝大多数微生物都可在人工培养基上生长，只有少数称作难养菌的寄生或共生微生物，如类支原体、类立克次氏体和少数寄生真菌等，至今还不能在人工培养基上生长。 一、培养基的配制原则 （一）目的明确 配制培养基首先要明确培养目的，要培养什么微生物？是为了得到菌体还是代谢产物？是用于实验室还是发酵生产？根据不同的目的，配制不同的培养基。 培养细菌、放线菌、酵母菌、霉菌所需要的培养基是不同的。在实验室中常用牛肉膏蛋白胨培养基培养异养细菌，培养特殊类型的微生物还需特殊的培养基。 自养型微生物有较强的合成能力，所以培养自养型微生物的培养基完全由简单的无机物组成。异养型微生物的合成能力较弱，所以培养基中至少要有一种有机物，通常是葡萄糖。有的异养型微生物需要多种生长因子，因此常采用天然有机物为其提供所需的生长因子。 如果为了获得菌体或作种子培养基用，一般来说，培养基的营养成分宜丰富些，特别是氮源含量应高些，以利于微生物的生长与繁殖。如果为了获得代谢产物或用作发酵培养基，则所含氮源宜低些，以使微生物生长不致过旺而有利于代谢产物的积累。在有些代谢产物的生产中还要加入作为它们组成部分的元素或前体物质，如生产维生素B12时要加入钴盐，在金霉素生产中要加入氯化物，生产苄青霉素时要加入其前体物质苯乙酸。 （二）营养协调 培养基应含有维持微生物最适生长所必须的一切营养物质。但更为重要的是，营养物质的浓度与配比要合适。 营养物质浓度过低不能满足其生长的需要；过高又抑制其生长。例如，适量的蔗糖是异养型微生物的良好碳源和能源，但高浓度的蔗糖则抑制微生物生长。金属离子是微生物生长所不可缺少的矿质养分，但浓度过大，特别是重金属离子，反而抑制其生长，甚至产生杀菌作用。 各营养物质之间的配比，特别是碳氮比（C／N比）直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的积累。C／N比一般指培养基中元素碳和元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白的含量之比。不同的微生物要求不同的C／N比。如细菌和酵母菌培养基中的C／N比约为5／1，霉菌培养基中的C／N比约为10／l。在微生物发酵生产中，C／N比直接影响发酵产量，如谷氨酸发酵中需要较多的氮作为合成谷氨酸的氮源，若培养基C／N比为4／1，则菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；若培养基C／N比为3／1，则菌体繁殖受抑制，谷氨酸产量增加。 此外，还须注意培养基中无机盐的量以及它们之间的平衡；生长因子的添加也要注意比例适当，以保证微生物对各生长因子的平衡吸收。 （三）理化适宜 微生物的生长与培养基的pH值、氧化还原电位、渗透压等理化因素关系密切。配制培养基应将这些因素控制在适宜的范围内。 1. pH值 各大类微生物一般都有其生长适宜的pH范围。如细菌为7.0～8.0，放线菌为7.5～8.5，酵母菌为3.8～6.0，霉菌为4.0～5.8，藻类为6.0～7.0，原生动物为6.0～8.0。但对于某一具体的微生物菌种来说，其生长的最适pH范围常会大大突破上述界限，其中一些嗜极菌更为突出。 微生物在生长、代谢过程中，会产生改变培养基pH的代谢产物，若不及时控制，就会抑制甚至杀死其自身。因此，在设计此类培养基时，要考虑培养基成分对pH的调节能力。这种通过培养基内在成分所起的调节作用，可称为pH的内源调节。 内源调节主要有2种方式：①借磷酸缓冲液进行调节：例如调节K2HP04和KH2P04两者浓度比即可获得pH6.4～7.2间的一系列稳定的pH，当两者为等摩尔浓度比时，溶液的pH值可稳定在6.8。②以CaCO3作“备用碱”进行调节：CaCO3在水溶液中溶解度很低，故将它加入至液体或固体培养基中并不会提高培养基的pH，但当微生物生长过程中不断产酸时，却可以溶解CaCO3，从而发挥其调节培养基pH的作用。如果不希望培养基有沉淀，有时可添加NaHCO3。 与内源调节相对应的是外源调节，这是一类按实际需要不断从外界流加酸或碱液，以调整培养液pH值的方法。 2. 氧化还原电位 各种微生物对培养基的氧化还原电位要求不同。一般好氧微生物生长的Eh(氧化还原势)值为 + 0.3～+ 0.4 V，厌氧微生物只能生长在+ 0.1 V以下的环境中。好氧微生物必须保证氧的供应，这在大规模发酵生产中尤为重要，需要采用专门的通气措施。厌氧微生物则必须除去氧，因为氧对它们有害。所以，在配制这类微生物的培养基时，常加入适量的还原剂以降低氧化还原电位。常用的还原剂有巯基乙酸、半胱氨酸、硫化钠、抗坏血酸、铁屑等。也可以用其他理化手段除去氧。发酵生产上常采用深层静置发酵法创造厌氧条件。 3. 渗透压和水活度 多数微生物能忍受渗透压较大幅度的变化。培养基中营养物质的浓度过大，会使渗透压太高，使细胞发生质壁分离，抑制微生物的生长。低渗溶液则使细胞吸水膨胀，易破裂。配制培养基时要注意渗透压的大小，要掌握好营养物质的浓度。常在培养基中加入适量的NaCl以提高渗透压。在实际应用中，常用水活度表示微生物可利用的游离水的含水量。 （四）经济节约 配制培养基特别是大规模生产用的培养基时还应遵循经济节约的原则，尽量选用价格便宜、来源方便的原料。在保证微生物生长与积累代谢产物需要的前提下，经济节约原则大致有：“以粗代精”、“以野代家”、“以废代好”、“以简代繁”、“以烃代粮”、“以纤代糖”、“以氮代朊”、“以国（产）代进（口）”等方面。 二、培养基的种类 培养基的种类繁多。因考虑的角度不同，可将培养基分成以下一些类型： （一）根据所培养微生物的种类作分类 根据微生物的种类可分为：细菌、放线菌、酵母菌和霉菌培养基。 常用的异养型细菌培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，常用的自养型细菌培养基是无机的合成培养基，常用的放线菌培养基为高氏一号合成培养基，常用的酵母菌培养基为麦芽汁培养基，常用的霉菌培养基为察氏合成培养基。 （二） 根据对培养基成分的了解程度作分类 1. 天然培养基 指一类利用动、植物或微生物体包括用其提取物制成的培养基，这是一类营养成分既复杂又丰富、难以说出其确切化学组成的培养基。例如牛肉膏蛋白胨培养基。天然培养基的优点是营养丰富、种类多样、配制方便、价格低廉；缺点是化学成分不清楚、不稳定。因此，这类培养基只适用于一般实验室中的菌种培养、发酵工业中生产菌种的培养和某些发酵产物的生产等。 常见的天然培养基成分有：麦芽汁、肉浸汁、鱼粉、麸皮、玉米粉、花生饼粉、玉米浆及马铃薯等。实验室中常用牛肉膏、蛋白胨及酵母膏等。 2. 合成培养基 又称组合培养基或综合培养基，是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。例如高氏一号培养基、察氏培养基等。合成培养基的优点是成分精确、重演性高；缺点是价格较贵，配制麻烦，且微生物生长比较一般。因此，通常仅适用于营养、代谢、生理、生化、遗传、育种、菌种鉴定或生物测定等对定量要求较高的研究工作中。 3. 半合成培养基 又称半组合培养基，指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。例如培养真菌的马铃薯蔗糖培养基等。严格地讲，凡含有未经特殊处理的琼脂的任何合成培养基，实质上都是一种半合成培养基。半合成培养基特点是配制方便，成本低，微生物生长良好。发酵生产和实验室中应用的大多数培养基都属于半合成培养基。 （三）根据培养基的物理状态作分类 1. 液体培养基 呈液体状态的培养基为液体培养基。它广泛用于微生物学实验和生产，在实验室中主要用于微生物的生理、代谢研究和获取大量菌体，在发酵生产中绝大多数发酵都采用液体培养基。 2. 固体培养基 呈固体状态的培养基都称为固体培养基。固体培养基有加入凝固剂后制成的；有直接用天然固体状物质制成的，如培养真菌用的麸皮、大米、玉米粉和马铃薯块培养基；还有在营养基质上覆上滤纸或滤膜等制成的，如用于分离纤维素分解菌的滤纸条培养基。 常用的固体培养基是在液体培养基中加入凝固剂（约2％的琼脂或5％～12％的明胶），加热至100℃，然后再冷却并凝固的培养基。常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶等。其中，琼脂是最优良的凝固剂。现将琼脂与明胶两种凝固剂的特性列在表4-4中。 固体培养基在科学研究和生产实践中具有很多用途，例如用于菌种分离、鉴定、菌落计数、检测杂菌、育种、菌种保藏、抗生素等生物活性物质的效价测定及获取真菌孢子等方面。在食用菌栽培和发酵工业中也常使用固体培养基。 表4-4 琼脂与明胶若干特性的比较 化学成分 营养价值 分解性 融化 温度 凝固 温度 常用 浓度 透明度 粘着力 耐加压灭菌 琼脂 聚半乳糖的硫酸酯 无 罕见 ～96℃ ～40℃ 1.5～2% 高 强 强 明胶 蛋白质 作氮源 极易 ～25℃ ～20℃ 5～12% 高 强 弱 3. 半固体培养基 半固体培养基是指在液体培养基中加入少量凝固剂（如0.2％～0.5％的琼脂）而制成的半固体状态的培养基。半固体培养基有许多特殊的用途，如可以通过穿刺培养观察细菌的运动能力，进行厌氧菌的培养及菌种保藏等。 4. 脱水培养基 又称脱水商品培养基或预制干燥培养基，指含有除水以外的一切成分的商品培养基，使用时只要加入适量水分并加以灭菌即可，是一类既有成分精确又有使用方便等优点的现代化培养基。 (四)根据培养基的功能作分类 1. 选择性培养基 一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某些物理、化学因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。 混合菌样中数量很少的某种微生物，如直接采用平板划线或稀释法进行分离，往往因为数量少而无法获得。选择性培养的方法主要有两种，一是利用待分离的微生物对某种营养物的特殊需求而设计的，如：以纤维素为唯一碳源的培养基可用于分离纤维素分解菌；用石蜡油来富集分解石油的微生物；用较浓的糖液来富集酵母菌等；二是利用待分离的微生物对某些物理和化学因素具有抗性而设计的，如分离放线菌时，在培养基中加入数滴10％的苯酚，可以抑制霉菌和细菌的生长；在分离酵母菌和霉菌的培养基中，添加青霉素、四环素和链霉素等抗生素可以抑制细菌和放线菌的生长；结晶紫可以抑制革兰氏阳性菌，培养基中加入结晶紫后，能选择性地培养G－ 菌；7.5％NaCl可以抑制大多数细菌，但不抑制葡萄球菌，从而选择培养葡萄球菌；德巴利酵母属中的许多种酵母菌和酱油中的酵母菌能耐高浓度(18％～20％)的食盐，而其他酵母菌只能耐受3％～11％浓度的食盐，所以，在培养基中加入15％～20％浓度的食盐，即构成耐食盐酵母菌的选择性培养基。 2. 鉴别培养基 一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找到目的菌菌落的培养基。最常见的鉴别培养基是伊红美蓝乳糖培养基，即EMB培养基（表4-5）。它在饮用水、牛奶的大肠菌群数等细菌学检查和在E.coli的遗传学研究工作中有着重要的用途。 表4-5 EMB培养基成分 成分 蛋白胨 乳糖 蔗糖 K2HPO4 伊红Y 美蓝 蒸馏水 pH 含量（g） 10 5 5 2 0.4 0.065 1 000 7.2 EMB培养基中的伊红和美蓝两种苯胺染料可抑制G＋ 细菌和一些难培养的G－ 细菌。在低酸度下，这两种染料会结合并形成沉淀，起着产酸指示剂的作用。因此，试样中多种肠道细菌会在EMB培养基平板上产生易于用肉眼识别的多种特征性菌落，尤其是大肠杆菌，因其能强烈分解乳糖而产生大量混合酸，菌体表面带H＋，故可染上酸性染料伊红，又因伊红与美蓝结合，故使菌落染上深紫色，且从菌落表面的反射光中还可看到绿色金属闪光，其他几种产酸力弱的肠道菌的菌落也有相应的棕色。 属于鉴别培养基的还有：明胶培养基可以检查微生物能否液化明胶；醋酸铅培养基可用来检查微生物能否产生H2S气体等。 选择性培养基与鉴别培养基的功能往往结合在同一种培养基中。例如上述EMB培养基既有鉴别不同肠道菌的作用，又有抑制G＋菌和选择性培养G－ 菌的作用。 3. 种子培养基 种子培养基是为了保证在生长中能获得优质孢子或营养细胞的培养基。一般要求氮源、维生素丰富，原料要精。同时应尽量考虑各种营养成分的特性，使pH在培养过程中能稳定在适当的范围内，以有利菌种的正常生长和发育。有时，还需加入使菌种能适应发酵条件的基质。菌种的质量关系到发酵生产的成败，所以种子培养基的质量非常重要。 4. 发酵培养基 发酵培养基是生产中用于供菌种生长繁殖并积累发酵产品的培养基。一般数量较大，配料较粗。发酵培养基中碳源含量往往高于种子培养基。若产物含氮量高，则应增加氮源。在大规模生产时，原料应来源充足，成本低廉，还应有利于下游的分离提取。